Unkontrollierter Hämorrhagischer Schock modelliert über Lebervernichtung bei Mäusen mit Echtzeit-Hämodynamik-Monitoring

Zusammenfassung

Unkontrollierte Blutung, eine wichtige Ursache der Mortalität bei Trauma-Patienten, kann mit einer Standard-Leber-Laceration in einem Maus-Modell modelliert werden. Dieses Modell führt zu gleichbleibendem Blutverlust, Überleben und ermöglicht die Prüfung von hämostatischen Mitteln. Dieser Artikel bietet den Schritt-für-Schritt-Prozess, um dieses wertvolle Modell durchzuführen.

Zusammenfassung

Unkontrollierte Blutung ist eine wichtige Ursache für vermeidbare Todesfälle bei Trauma-Patienten. Wir haben ein murines Modell der unkontrollierten Blutung durch eine Leberverzerrung entwickelt, die zu gleichbleibendem Blutverlust, hämodynamischen Veränderungen und Überleben führt.

Mäuse unterziehen sich einer standardisierten Resektion des linken Mittellappens der Leber. Sie dürfen ohne mechanische Eingriffe bluten. Hämostatische Mittel können als Vorbehandlung oder Rettungstherapie je nach Interesse des Ermittlers verabreicht werden. Während der Zeit der Blutung wird eine Echtzeit-hämodynamische Überwachung über eine linke Oberschenkel-Arterienlinie durchgeführt. Mäuse werden dann geopfert, Blutverlust wird quantifiziert, Blut wird zur weiteren Analyse gesammelt und Organe werden zur Analyse der Verletzung geerntet. Experimentelles Design wird beschrieben, um das gleichzeitige Testen mehrerer Tiere zu ermöglichen.

Leberblutung als Modell der unkontrollierten Hämorrhagie existiert iN der Literatur, vor allem in Ratten- und Schweinemodellen. Einige dieser Modelle nutzen hämodynamische Überwachung oder quantifizieren Blutverlust, aber es fehlt an Konsistenz. Das vorliegende Modell beinhaltet die Quantifizierung des Blutverlusts, die Echtzeit-hämodynamische Überwachung in einem murinen Modell, das den Vorteil bietet, transgene Linien und einen Hochdurchsatzmechanismus zu verwenden, um die pathophysiologischen Mechanismen bei unkontrollierter Blutung weiter zu untersuchen.

Einleitung

Trauma ist die führende Todesursache und Behinderung bei Jugendlichen weltweit. ¹ Unkontrollierte Blutung bleibt eine führende Ursache der Mortalität bei schwer verletzten Trauma-Patienten. ² Management des hämorrhagierenden Trauma-Patienten ist zweifach: Kontrolle der chirurgischen Blutungen und Reanimation und Ersatz von Blut verloren.

Tiermodelle des hämorrhagischen Schocks sind der Grundstein für die Traumaforschung und können bei der Bewertung der Pathophysiologie und Behandlung des traumatischen / hämorrhagischen Schocks eingesetzt werden. ^{3 , 4} Schock in Tiermodellen kann breit durch zwei Methoden erreicht werden: kontrollierte Blutung und unkontrollierte Blutung. ^{5 , 6} Kontrollierte Hämorrhagie wird durch Entfernung eines festen Blutvolumens oder durch Blutentfernung durchgeführt, um einen bestimmten Blutdruck zu erreichen (Festdruck). WährendSe-Modelle sind nützlich bei der Bewertung in den Mechanismen und Immun-Veränderungen bei hämorrhagischen Schock, sie sind nicht anwendbar auf die Prüfung von hämostatischen Mitteln und nicht imitieren das klinische Szenario der Blutung nach Trauma. In diesem Ausmaß haben wir versucht, ein Modell der unkontrollierten Blutung zu entwickeln, das es uns erlauben würde, hämostatische Veränderungen und Prokoagulierungsmittel in einem Mausmodell zu testen. Die Leber ist eine attraktive Option für unkontrollierte Blutung, zum Teil wegen der doppelten Blutversorgung der Leber und es ist eine der am häufigsten verletzten intrabdominalen Organe sowohl bei stumpfem und durchdringendem Trauma. Angesichts der hohen klinischen Relevanz wurde die Leber als Modell der unkontrollierten Blutung verwendet, am häufigsten bei Ratten- und Schweinemodellen, aber vor kurzem auch bei Primaten. ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} Murine Modelle haben auch Leberverletzungen, wie ein Crush-Modell oder stumpfes Trauma; Allerdings führen diese Modelle nicht zu hämorrhagischen Schock sekundär zur Leberverletzung. ^{13 , 14}

Die Ratten- und Schweinemodelle der unkontrollierten Leberblutung, während sie bei der Betrachtung der Wiederbelebungspraktiken und der hämodynamischen Überwachung wertvoll sind, sind weniger vorteilhaft als ein Mausmodell aus verschiedenen Gründen wie Kosten, Anzahl der verwendeten Tiere und vor allem die relativen Mangel an transgenen Linien, die für die Analyse zur Verfügung stehen Spezifische zelluläre und molekulare Signalisierung. Das vorliegende murine Modell teilt wichtige Ähnlichkeiten mit bestehenden Leberblutungsmodellen, einschließlich standardisierter Leberverzerrung, Blutverlustquantifizierung, hämodynamisches Monitoring und die Fähigkeit, die Überlebensanalyse durchzuführen. Viele vorhandene Modelle enthalten nur einige dieser Aspekte, während unser Modell entwickelt wurde, um viele der physiologischen Varia zu messenBles gleichzeitig und bei mehreren Mäusen. Ebenso öffnet die Entwicklung eines murinen Modells die Tür zu Untersuchungen über die Wiederbelebung hinaus und in größere pathophysiologische Mechanismen bei unkontrollierter Blutung mit dem Potenzial eines kostengünstigen Hochdurchsatzmodells mit fortgeschrittenen molekularen Techniken.

Protokoll

Mäuse wurden in Übereinstimmung mit der University of Pittsburgh (Pittsburgh, PA, USA) und National Institutes of Health (NIH; Bethesda, MD, USA) Tierpflege Richtlinien in bestimmten pathogenfreien Bedingungen mit 12 h Licht-Dunkel-Zyklen und freien Zugang zu Standardfutter und Wasser. Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des Tierforschungs- und Pflegeausschusses an der University of Pittsburgh genehmigt und durchgeführt.

1. Chirurgisches Feld und Instrumenten-Setup

1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente, Naht-, Gaze-, Baumwollspitzen-Applikatoren, Schlauch- und Schlauchverbinder vor dem Eingriff.
   1. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente, Naht-, Gaze- und Baumwollspitzenapplikatoren in einem Autoklaven. Sterilisier- und Schlauchverbinder mit Ethylenoxid.
2. Chirurgisches Feld
   1. Schalten Sie ein wasserzirkulierendes Heizkissen ein und stellen Sie es auf 37 ° C. Lege eine ChirurgieCal Blue Pad oben und dann eine sterile drapieren auf der chirurgischen blauen Pad.
   2. Öffnen Sie alle sterilisierten Instrumente auf die sterile Abdeckung. Verwenden Sie sterile Handschuhe, um die Sterilität während dieses Schrittes zu vermeiden.
   3. Füllen Sie eine Edelstahlschale mit 70% Ethanol und beiseite legen. Dies wird verwendet, um Instrumente zwischen Tieren zu reinigen.
   4. Drehen Sie den Mikroperle Sterilisator ein und lassen Sie ihn auf 150 ° C erhitzen. Dies wird auch verwendet, um Instrumente zwischen den Tieren zu reinigen. Bei chirurgischen Eingriffen auf mehr als 5 Mäusen, achten Sie darauf, Instrumente zu einem neuen sterilen Satz zu wechseln.
3. Aufnehmer
   1. Verbinden Sie einen sterilen Wandler, PE-50-Schlauch, zwei 23G-Nadeln und männlich-männlichen Luer und einen Dreiwege-Hahn. ⁶
   2. Kalibrieren und null den Messumformer pro Herstelleranleitung.

2. Leber-Laceration Chirurgische Vorgehensweise

1. Anästhesie Induktion und Positionierung
   1. Natriumpentobarbital intraperitoneal in einer Dosis von 70 mg / kg injizieren. Anästhesie sollte zwischen 5-10 min wirksam werden; Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie mit einer Zehenklemme. Wenn die Maus auf die Zehen-Prise reagiert, wird zusätzliche Zeit oder Anästhesie benötigt. Wenn eine zusätzliche Anästhesie während des Eingriffs erforderlich ist, ergänzen Sie Natriumpentobarbital. Geben Sie keine Ergänzungen in größeren Mengen als 0,05 ml, um eine Überdosierung zu vermeiden.
   2. Nachdem die Maus vollständig unter Anästhesie ist, positioniere die Maus auf einem chirurgischen Brett. Sichern Sie alle vier Glieder der Maus an die Tafel mit Klebeband.
   3. Rasieren Sie den Bauch und die bilateralen Leisten mit einem Rasiermesser.
   4. Sofort sterile Gaze mit Betadin und auf den Bauch und die bilateralen Leisten für die Chirurgie anwenden. Für Überlebensexperimente, Vorbereitung der Bauch und Leisten mit Betadin gefolgt von Ethanol für insgesamt drei Vorbereitungszyklen.
   5. Setzen Sie einen rektalen Temperaturfühler ein, um die Kerntemperatur während des gesamten Verfahrens zu überwachen. Halten Sie die cErze-Temperatur zwischen 35-37 ° C.
2. Femoralarterie und venöse Kanüle
   1. Für den venösen Katheteraufbau: PE-10-Schlauch, eine 30-G-Nadel und einen Dreiwege-Hahn mit Lactated Ringer-Lösung aus einer IV-Tasche füllen.
   2. Für den Arterienkatheteraufbau: PE-10-Schlauch und 30G-Nadel mit heparinierter Kochsalzlösung (1:10 Verdünnung von 1.000 U Heparin) füllen. Heparin-Kochsalzlösung ist erforderlich, um Gerinnung zu verhindern.
   3. Lege die Maus unter ein Sektionsmikroskop.
   4. Machen Sie einen 4-5 mm Längsschnitt über die Leisten Muskeln mit chirurgischen Iris Schere. Mit Dumont Pinzette greifen die Fettgewebe mit dem Adduktor Muskel verbunden und ziehen seitlich für eine saubere Exposition der Femoral Bündel. Nicht durch das Fettgewebe zerlegen, da dies zu Gefäßverletzungen führen wird.
   5. Den Nerv vorsichtig von der Arterie und Vene mit der Dumont-Pinzette zerlegen. Es ist ein fetter Pad neben dem Nerv. Ergreifen Sie das mit einem Dumont forcep anD seitlich ziehen; Das zieht den Nerv weg von der Arterie und schafft ein Flugzeug für die Sektion. Mit anderen Dumont-Zupfen zerlegt das Bindegewebe zwischen dem Nerv und der Arterie.
      1. Ergreife den Nerv nicht während dieses Teils der Sektion.
   6. Loop drei 6-0 Seidennähte um die Arterie und Vene proximal zum profunda femoris abheben.
      1. Legen Sie die Naht 1 am proximalen und lassen Sie locker.
      2. Legen Sie Naht 2 am distal und binden Sie sofort.
      3. Lege Naht 3 zwischen Naht 1 und 2 und lose los.
   7. Machen Sie eine Arteriotomie auf der ventralen Oberfläche des Schiffes. Die Verwendung von mikrovaskulären Scheren wird empfohlen, um die Arteriotomie zu vermeiden Transektion des Schiffes.
   8. Setzen Sie den Dreiwege-Katheter in die Arterie ein. Sofort die Naht 1 und 2 abklemmen, um den Katheter zu befestigen.
   9. Verbinden Sie den Dreiwege-Katheter mit dem Transducer und sammeln Sie die Blutdruckdaten des Grundlinders.
   10. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.4 - 2.2.6 auf der gegenüberliegenden Leiste. Cannulieren Sie die Femoralvene in ähnlicher Weise wie die Arterie. Führen Sie eine Venotomie auf der ventralen Oberfläche des Schiffes, gefolgt von Katheter-Insertion. Dieser Katheter kann für die Fluid- oder Arzneimittelverabreichung verwendet werden.
3. Lebervernichtung
   1. Vorwägen einer Röhre mit 0,5 ml PBS, drei Absorptionsdreiecken und einem wiegen Boot pro Maus.
   2. Machen Sie eine ventrale Mittellinie Laparotomie Inzision beginnend bei der Xiphoid-Prozess und erweitern kaudal, um die Exposition der Leber vollständig zu ermöglichen.
   3. Setzen Sie ein Absorptionsdreieck in den Bauch gegen die rechte Bauchwand ein. Wiederholen auf der linken Seite.
      1. Stellen Sie sicher, dass das Absorptionsdreieck von der Leber entfernt ist, um eine hämostatische Packung zu vermeiden, nachdem die Leber zerrissen ist.
   4. Vorsichtig den linken Mittellappen der Leber packen und 75% des Lappens mit chirurgischer Irisschere zerreißen. Legen Sie die lacerateD-Segment in einem PBS enthaltenden Rohr.
   5. Schließen Sie die Bauchwand mit Heftklammern über einen Heftklammerapplikator. Fassen Sie die Haut und den Muskel zusammen und feuern Sie die Heftklammer. Tun Sie dies so schnell wie möglich nach der Leberverzerrung, um Blutverlust außerhalb des Bauches zu vermeiden. Bei Überlebensexperimenten ist der Abdomen in zwei Schichten geschlossen. Eine laufende resorbierbare Naht für den Muskel, gefolgt von einer Laufschicht aus nicht resorbierbarer Naht für die Haut, sorgt für einen ausreichenden Verschluss.
   6. Für Mäuse, die für Überlebenszeiträume länger als 30 min sind, sollten die Oberschenkelkatheter entfernt werden, die Arterie und die Vene, die mit der Naht 3 aus Schritt 2.2.6 verbunden sind. Bilaterale Leisten werden dann in zwei Schichten geschlossen, wie im vorherigen Schritt beschrieben.
   7. Nach einer bestimmten Zeit für die Blutung (30 min bis 72 h), entfernen Sie die Heftklammern. Entfernen Sie die Absorptionsdreiecke und setzen Sie sie in entsprechende vorgewichtete Wägeboote ein. Verwenden Sie zusätzliche Absorptionsdreiecke, um jedes nicht absorbierte Blut aufzusaugen.
   8. Wiegen Sie Absorptionsfilter, um den Gesamtblutverlust zu berechnen.
4. Postoperative Pflege
   1. Lassen Sie Mäuse, die bei 30 Minuten auf dem chirurgischen Brett geopfert werden sollen, und unter ständiger Überwachung und unter Vollnarkose bis zum Zeitpunkt des Opfers. Mäuse werden mit einer Kombination von Herzpunktion und einer Überdosis von inhaliertem Isofluran euthanasiert.
   2. Legen Sie Mäuse, die für längere Überlebenszeit Punkte in einem Wiederherstellungskorb auf einem wasserzirkulierenden Heizkissen sind. Ständig die Mäuse während der Genesung überwachen und nicht unbeaufsichtigt lassen, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt haben, um die Sternal Recumbency zu erhalten. Bringe die Maus mit anderen Mäusen in den Käfig zurück, sobald sie sich von der Anästhesie erholt hat.
   3. Die postoperative Analgesie mit 0,1 mg / kg Buprenex über die subkutane Injektion nach der Anästhesie und alle 12 Stunden nach der Zeit des Opfers verabreichen.
   4. Erlaube Mäusen freien Zugang zu Nahrung und Wasser, nachdem sie zu ihr zurückgebracht werdenNormale Käfige postoperativ.
   5. Zum Zeitpunkt des Opfers für Überlebensmäuse wird die Anästhesie mit inhaliertem Isofluran erreicht. Einmal unter Anästhesie Blut wird über eine rechte Herz Herzpunktion gesammelt, Blutverlust wird wie oben beschrieben aufgezeichnet und schließlich Euthanasie ist mit einer Überdosierung von Isofluran versichert.

Ergebnisse

Das Leber-Lacerationsmodell führt zu einem reproduzierbaren und konsistenten Blutverlust bei Mäusen. Abbildung 1A zeigt das gleichbleibende Gewicht der zerrissenen Leber, die mit einer Standardabweichung von nur 0,02 g erhalten werden kann. Diese Konsistenz im zerrissenen Lebergewicht ermöglicht die Fähigkeit, das Modell zwischen Mäusen und in verschiedenen experimentellen Aufbauten wie verschiedenen resuscitativen Protokollen zu reproduzieren. Ebenso liefert das re...

Diskussion

Das hier beschriebene murine Lebervernichtungsmodell stellt ein zuverlässiges, konsistentes Modell der unkontrollierten Blutung dar. Dieses Modell ist einfach zu erledigen, aber es gibt wichtige Schritte, die akribische Betrachtung erfordern. Der technisch anspruchsvollste Teil des Modells ist die Kanülierung der Oberschenkelgefäße für die hämodynamische Überwachung und die Flüssigkeits- / Arzneimittelverabreichung. Bei der Sezierung des Nervs und der Arteriotomie / Venotomie ist Vorsicht geboten. Es ist wichtig...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
SS/45 dumonts	Fine Science Tools	11203-25
surgical scissors	Fine Science Tools	14068-12
hemostats	Fine Science Tools	13009-12
microscissors	Fine Science Tools	15000-08
0.8mm curved forceps	Fine Science Tools	11009-13
suture reel 6-0	Fine Science Tools	18020-60
suture 4-0 silk w/ needle	Owens Minor	K188H
gauze 4x4	can be purchased through any global vendor
cotton-tip applicator	can be purchased through any global vendor
30G needle	can be purchased through any global vendor
23G needle	can be purchased through any global vendor
10cc syringe	can be purchased through any global vendor
50cc conical tube	can be purchased through any global vendor
1cc syringe w/ 25G needle	Fisher Scientific	14-826-88
Polyethylene 10 tubing 100`(PE-10)	Fisher Scientific	14-170-12P
Polyethylene 50 tubing 100`(PE-50)	Fisher Scientific	14-170-12B
3-way stopcock	Fisher Scientific	NC9779127
surgical blue pad	Fisher Scientific	50-7105
Sterile Field dressings	Fisher Scientific	NC9517505
tape rolls 1"	Corporate Express	MMM26001
straight side wide mouth jars	VWR	159000-058
stainless steel tray 8" x 11"	VWR	62687-049
male-male leur lock 3-way	VWR	20068-909
sterilization pouch 3"x8"	VWR	24008
sterilization pouch 5"x10"	VWR	24010
absorption triangles	Fine Science Tools	18105-03
7mm wound clip applier	Fisher Scientific	E0522687
1000 7mm wound clips	Fisher Scientific	E0522687
betadine (4oz)	can be purchased through any global vendor
sterile gloves	can be purchased through any global vendor
eppendorfs	can be purchased through any global vendor
1/2cc Lo-Dose insulin syringe	Fisher Scientific	12-826-79
small weigh boat	can be purchased through any global vendor
lactated ringers	can be purchased through any global vendor
hepranized saline solution (.1µ hep + 9.9µNaCl)	can be purchased through any global vendor
phosphate buffered saline	can be purchased through any global vendor
pentobarbital	can be purchased through any global vendor
Wild M650 microscope w/ boom stand	Leica
Digi-Med BPA-400 analyzer & systems integrator	Micro-Med	SYS-400
TXD-310 (Digi-Med Transducer)	Micro-Med	TXD-300
Computer	Dell
microbead instrument sterilizer	VWR	11156-002
Oster A5 clippers w. size 40 blade	VWR	10749-020
circulating heating pad 18x26	Harvard	py872-5272
rectal thermometer	Kent Scientific	RET-3