Неконтролируемый геморрагический шок, моделируемый разрывом печени у мышей с контролем гемодинамики в реальном времени

Резюме

Неконтролируемое кровоизлияние, являющееся важной причиной смертности среди пациентов с травмой, можно смоделировать с использованием стандартного разрыва печени в мышиной модели. Эта модель приводит к постоянной кровопотере, выживаемости и позволяет тестировать гемостатические агенты. В этой статье представлен пошаговый процесс выполнения этой ценной модели.

Аннотация

Неконтролируемое кровотечение является важной причиной предотвратимых смертей среди пациентов с травмой. Мы разработали мышиную модель неконтролируемого кровоизлияния через разрыв печени, что приводит к постоянной потере крови, гемодинамическим изменениям и выживанию.

Мышам подвергается стандартизированная резекция лево-средней доли печени. Им разрешено кровоточить без механического вмешательства. Гемостатические агенты можно вводить в качестве предварительной терапии или спасательной терапии в зависимости от интереса исследователя. Во время кровотечения проводится гемодинамический мониторинг в режиме реального времени через левую бедренную артериальную линию. Затем мышей умерщвляли, измеряли кровопотерю, собирали кровь для дальнейшего анализа, а органы собирали для анализа повреждений. Описана экспериментальная схема, позволяющая проводить одновременные испытания нескольких животных.

Геморрагия печени как модель неконтролируемого кровоизлияния существуетВ литературе, главным образом, в моделях крыс и свиней. Некоторые из этих моделей используют гемодинамический мониторинг или количественную оценку потери крови, но не имеют последовательности. Настоящая модель включает количественную оценку кровопотери, гемодинамический мониторинг в режиме реального времени в мышиной модели, которая дает преимущество использования трансгенных линий и механизма высокой пропускной способности для дальнейшего исследования патофизиологических механизмов при неконтролируемом кровотечении.

Введение

Травма является основной причиной смерти и инвалидности среди молодежи во всем мире. ¹ Неконтролируемое кровоизлияние остается основной причиной смертности среди тяжело травмированных пациентов с травмой. ² Управление пациентом с кровоточащей травмой двойное: контроль хирургического кровотечения, реанимация и замена потерянной крови.

Животные модели геморрагического шока были краеугольным камнем в исследовании травмы и могут быть использованы при оценке патофизиологии и лечения травматического / геморрагического шока. ^{3 , 4} Удар на животных моделях может быть достигнут в широком смысле двумя методами: контролируемое кровоизлияние и неконтролируемое кровоизлияние. ^{5 , 6} Контролируемое кровоизлияние выполняется путем удаления фиксированного объема крови или путем удаления крови для достижения определенного кровяного давления (фиксированного давления). В то времяСе модели полезны при оценке механизмов и иммунных изменений при геморрагическом шоке, они не применимы к тестированию гемостатических агентов и не имитируют клинический сценарий кровотечения после травмы. В этой степени мы стремились разработать модель неконтролируемого кровоизлияния, которая позволила бы нам проверять гемостатические изменения и прокоагулянты в мышиной модели. Печень является привлекательным вариантом для неконтролируемого кровоизлияния частично из-за двойного кровоснабжения печени и является одним из наиболее часто повреждаемых внутрибрюшных органов при тупой и проникающей травме. Учитывая высокую клиническую значимость, печень используется как модель неконтролируемого кровоизлияния, чаще всего в моделях крыс и свиней, но в последнее время и у приматов. ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} Мышиные модели также включают повреждение печени, такое как модель дробления или тупая травма; Однако эти модели не приводят к геморрагическому шоку, вторичному к повреждению печени. ^{13 , 14}

Крысиные и свиные модели неконтролируемого кровоизлияния в печени, хотя они и ценны при изучении методов реанимации и гемодинамического мониторинга, менее выгодны, чем модели для мыши по различным причинам, таким как стоимость, количество используемых животных и, что важно, отсутствие трансгенных линий, доступных для анализа Специфической клеточной и молекулярной сигнализации. Нынешняя модель мыши имеет важное сходство с существующими моделями кровотечений в печени, включая стандартизованное разрывание печени, количественную оценку кровопотери, гемодинамический мониторинг и способность выполнять анализ выживаемости. Многие существующие модели включают только некоторые из этих аспектов, тогда как наша модель была разработана для измерения многих физиологических вариацийОдновременно и у нескольких мышей. Кроме того, разработка мышиной модели открывает двери для исследований за пределами реанимации и в механизмы большей патофизиологии при неконтролируемом кровотечении с потенциалом рентабельной и высокопроизводительной модели с использованием передовых молекулярных методов.

протокол

Мышей содержали в соответствии с Питтсбургским университетом (Питтсбург, Пенсильвания, США) и Национальными институтами здравоохранения (NIH, Bethesda, MD, USA) руководствами по уходу за животными в конкретных условиях без патогенов с 12-часовыми циклами светлого-темного цвета и свободным доступом к Стандартного корма и воды. Все эксперименты на животных были одобрены и проведены в соответствии с руководящими принципами, изложенными Комитетом по исследованиям и уходу за животными в Университете Питтсбурга.

1. Хирургическое поле и настройка прибора

1. Перед процедурой стерилизуют все хирургические инструменты, шовный материал, марлю, аппликаторы на хлопчатобумажных кончиках, шланги и трубки.
   1. Стерилизовать хирургические инструменты, шовные, марлевые и аппликаторы с хлопковым наконечником в автоклаве. Стерилизовать соединительные трубки и трубки с этиленоксидом.
2. Хирургическое поле
   1. Включите водяную циркуляционную грелку и установите температуру 37 ° C. Место хирургического вмешательстваСинюю подушку на ней сверху, а затем стерильную драпировку поверх хирургической синей подушки.
   2. Откройте все стерилизованные инструменты на стерильной драпировке. Используйте стерильные перчатки, чтобы избежать нарушения стерильности во время этого шага.
   3. Заполните чашу из нержавеющей стали 70% -ным этанолом и отложите в сторону. Это будет использоваться для очистки инструментов между животными.
   4. Включите микробарабанный стерилизатор и дайте ему нагреться до 150 ° C. Это также будет использоваться для очистки инструментов между животными. При проведении операции на более чем 5 мышах обязательно смените инструменты на новый стерильный набор.
3. Настройка датчика
   1. Подключите стерильный преобразователь, трубку PE-50, две иглы 23G и мужскую рубашку luer и трехходовой запорный кран. ⁶
   2. Откалибруйте и обнулите преобразователь согласно инструкциям производителя.

2. Хирургическая процедура разрывания печени

1. Индукция и позиционирование анестезии
   1. Вводите пентобарбитал натрия внутрибрюшинно в дозе 70 мг / кг. Анестезия должна вступить в силу между 5-10 мин; Оценить глубину анестезии пальцами ног. Если у мыши есть реакция на повышение пальцев стопы, требуется дополнительное время или анестезия. Если во время процедуры необходима дополнительная анестезия, добавьте пентобарбитал натрия. Не давать добавки в больших количествах, чем 0,05 мл для предотвращения передозировки.
   2. После того, как мышь полностью находится под анестезией, поместите мышь на спину на хирургический щит. Закрепите все четыре конечности мыши доски лентой.
   3. Брить бритвой бритвой и двухсторонними пахами.
   4. Замочите стерильную марлю бетадином и нанесите на живот и двусторонние пахи для хирургии. Для экспериментов по выживанию препарируйте брюшную полость и пахи бетадином, затем этанол, в общей сложности три подготовительных цикла.
   5. Вставьте ректальный датчик температуры, чтобы контролировать температуру ядра во время процедуры. Держите cТемпература руды между 35-37 ° C.
2. Бедренная артерия и венозная канюляция
   1. Для установки венозного катетера: заполните трубку PE-10, иглу 30 G и трехсторонний кран с раствором Lactated Ringer из пакета IV.
   2. Для установки артериального катетера: заполните трубку PE-10 и иглу 30G гепаринизированным физиологическим раствором (разведение 1:10 гепарина 1000 U). Гепарин-солевой раствор необходим для предотвращения свертывания крови.
   3. Поместите мышь под рассекающий микроскоп.
   4. Сделайте 4-5 мм продольный разрез над паховой мышцей с помощью хирургических ножниц Iris. Используя пинцеты Дюмонта, захватите жировую ткань, связанную с мышцей приводящего мышцы, и потяните латерально для чистой экспозиции бедренной связки. Не рассекайте через жировую ткань, так как это приведет к сосудистому повреждению.
   5. Тщательно рассекайте нерв от артерии и вены с помощью щипцов Дюмонта. Есть жировая прокладка, прилегающая к нерву. Возьмите это с одним усилием Дюмона иD тянуть сбоку; Это оттягивает нерв от артерии, создавая плоскость для вскрытия. С помощью других силмона Дюмон прямо рассекает соединительную ткань между нервом и артерией.
      1. Не хватайте нерв во время этой части диссекции.
   6. Протяните три шовных шва 6-0 вокруг артерии и вены, проксимальной к бедрам профунды.
      1. Место шва 1 наиболее проксимально и оставить свободно.
      2. Место шва 2 наиболее дистально и связать сразу.
      3. Поместите шов 3 между шовными нитями 1 и 2 и оставьте свободным.
   7. Сделайте артериотом на вентральной поверхности сосуда. Рекомендуется использовать микрососудистые ножницы, чтобы артериотомия предотвращала перелом сосуда.
   8. Вставьте трехсторонний катетер в артерию. Сразу же завяжите шовные нити 1 и 2, чтобы зафиксировать катетер на месте.
   9. Подключите трехсторонний катетер к датчику и собрать исходные данные артериального давления.
   10. Повторите шаги 2.2.4 - 2.2.6 на противоположном пахе. Канюляция бедренной вены аналогична артерии. Выполните венотомию на вентральной поверхности сосуда с последующей установкой катетера. Этот катетер можно использовать для введения жидкости или лекарства.
3. Разрыв печени
   1. Предварительно взвесьте пробирку, содержащую 0,5 мл PBS, три абсорбирующих треугольника и один весовой лоток на мышь.
   2. Сделайте разрез лапаротомии средней линии в брюшной полости, начиная с мечевидного отростка и продолжая каудально, чтобы полностью вывести печень.
   3. Вставьте один абсорбционный треугольник в живот против правой брюшной стенки. Повторите с левой стороны.
      1. Убедитесь, что абсорбционный треугольник удален от печени, чтобы избежать гемостатического эффекта упаковки после разрыва печени.
   4. Тщательно захватите левую среднюю долю печени и размойте 75% доли с помощью хирургических ножниц Iris. Место разрываD в трубке, содержащей PBS.
   5. Закройте брюшную стенку скобами с помощью аппликатора сшивателя. Возьмитесь за кожу и мышцы вместе и сжигайте скрепки. Делайте это как можно быстрее после ранения печени, чтобы избежать кровопотери за пределами живота. В экспериментах по выживанию живот закрывают в два слоя. Ходовой абсорбируемый шов для мышцы, за которым следует бегущий слой неабсорбируемого шовного материала для кожи, обеспечивает адекватное закрытие.
   6. Для мышей, которые в течение периодов времени выживания более 30 мин, бедренные катетеры должны быть удалены, артерия и вена связаны шовным материалом 3 с этапа 2.2.6. Затем двухсторонние пахи закрывают в два слоя, как описано на предыдущем этапе.
   7. После определенного времени, представляющего интерес для кровоизлияния (от 30 минут до 72 часов), удалите скрепки. Снимите абсорбционные треугольники и поместите их в соответствующие взвешенные до взвешивания лодки. Используйте дополнительные абсорбционные треугольники, чтобы впитать любую невпитываемую кровь.
   8. Взвешивающие фильтры для расчета общей потери крови.
4. Послеоперационный уход
   1. Оставьте мышей, которые должны быть принесены в жертву в течение 30 минут на хирургическом пульте и под постоянным контролем и под полной анестезией до момента жертвоприношения. Мышей подвергают эвтаназии сочетанием сердечной пункции и передозировки вдыхаемого изофлурана.
   2. Место мышей, которые для более длительного времени выживания точек в клетке восстановления на вершине воды циркулирующих грелку. Постоянно следить за мышами во время выздоровления и не оставлять без присмотра, пока они не придут в сознание, чтобы сохранить туловище. Верните мышь в клетку с другими мышами только после восстановления после анестезии.
   3. Администрирование послеоперационной аналгезии с 0,1 мг / кг бупренэкса путем подкожной инъекции после пробуждения от анестезии и каждые 12 ч после до момента жертвования.
   4. Разрешить мышам свободный доступ к пище и воде после того, как они будут возвращены наПосле операции.
   5. Во время жертвоприношения для выживания мышей анестезия осуществляется с помощью ингаляционного изофлурана. После анестезии кровь собирается через сердечную пункцию правого сердца, кровоток регистрируется, как описано выше, и, наконец, эвтаназия застрахована передозировкой изофлюрана.

Результаты

Модель разрыва печени приводит к воспроизводимой и последовательной потере крови у мышей. Рисунок 1А демонстрирует постоянный вес рваной печени, которая может быть получена со стандартным отклонением всего 0,02 г. Эта последовательность в раздираемом весе пе?...

Обсуждение

Модель разрыва мышиной печени, описанная здесь, обеспечивает надежную, согласованную модель неконтролируемого кровоизлияния. Эта модель проста в исполнении, но есть важные шаги, которые требуют тщательного рассмотрения. Наиболее технически сложной частью модели является канюляция б...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
SS/45 dumonts	Fine Science Tools	11203-25
surgical scissors	Fine Science Tools	14068-12
hemostats	Fine Science Tools	13009-12
microscissors	Fine Science Tools	15000-08
0.8mm curved forceps	Fine Science Tools	11009-13
suture reel 6-0	Fine Science Tools	18020-60
suture 4-0 silk w/ needle	Owens Minor	K188H
gauze 4x4	can be purchased through any global vendor
cotton-tip applicator	can be purchased through any global vendor
30G needle	can be purchased through any global vendor
23G needle	can be purchased through any global vendor
10cc syringe	can be purchased through any global vendor
50cc conical tube	can be purchased through any global vendor
1cc syringe w/ 25G needle	Fisher Scientific	14-826-88
Polyethylene 10 tubing 100`(PE-10)	Fisher Scientific	14-170-12P
Polyethylene 50 tubing 100`(PE-50)	Fisher Scientific	14-170-12B
3-way stopcock	Fisher Scientific	NC9779127
surgical blue pad	Fisher Scientific	50-7105
Sterile Field dressings	Fisher Scientific	NC9517505
tape rolls 1"	Corporate Express	MMM26001
straight side wide mouth jars	VWR	159000-058
stainless steel tray 8" x 11"	VWR	62687-049
male-male leur lock 3-way	VWR	20068-909
sterilization pouch 3"x8"	VWR	24008
sterilization pouch 5"x10"	VWR	24010
absorption triangles	Fine Science Tools	18105-03
7mm wound clip applier	Fisher Scientific	E0522687
1000 7mm wound clips	Fisher Scientific	E0522687
betadine (4oz)	can be purchased through any global vendor
sterile gloves	can be purchased through any global vendor
eppendorfs	can be purchased through any global vendor
1/2cc Lo-Dose insulin syringe	Fisher Scientific	12-826-79
small weigh boat	can be purchased through any global vendor
lactated ringers	can be purchased through any global vendor
hepranized saline solution (.1µ hep + 9.9µNaCl)	can be purchased through any global vendor
phosphate buffered saline	can be purchased through any global vendor
pentobarbital	can be purchased through any global vendor
Wild M650 microscope w/ boom stand	Leica
Digi-Med BPA-400 analyzer & systems integrator	Micro-Med	SYS-400
TXD-310 (Digi-Med Transducer)	Micro-Med	TXD-300
Computer	Dell
microbead instrument sterilizer	VWR	11156-002
Oster A5 clippers w. size 40 blade	VWR	10749-020
circulating heating pad 18x26	Harvard	py872-5272
rectal thermometer	Kent Scientific	RET-3