Choc hémorrhagique incontrôlable modélisé par la lacération du foie chez les souris avec une surveillance hémodynamique en temps réel

Résumé

L'hémorragie incontrôlée, une cause importante de mortalité chez les patients traumatisés, peut être modélisée en utilisant une lacération standard du foie dans un modèle murin. Ce modèle entraîne une perte de sang constante, une survie et permet de tester des agents hémostatiques. Cet article fournit le processus étape par étape pour effectuer ce modèle précieux.

Résumé

L'hémorragie incontrôlée est une cause importante de décès évitables chez les patients traumatisés. Nous avons développé un modèle murin d'hémorragie incontrôlée par une lacération du foie qui entraîne une perte de sang constante, des altérations hémodynamiques et une survie.

Les souris subissent une résection standardisée du lobe central gauche du foie. Ils sont autorisés à saigner sans intervention mécanique. Les agents hémostatiques peuvent être administrés comme traitement de prétraitement ou de sauvetage en fonction de l'intérêt de l'investigateur. Pendant le temps de l'hémorragie, on effectue une surveillance hémodynamique en temps réel via une ligne artérielle fémorale gauche. Les souris sont ensuite sacrifiées, la perte de sang est quantifiée, le sang est collecté pour une analyse plus approfondie et les organes sont récoltés pour l'analyse des blessures. La conception expérimentale est décrite pour permettre le test simultané de multiples animaux.

L'hémorragie du foie comme modèle d'hémorragie incontrôlée existe iDans la littérature, principalement dans les modèles de rat et de porc. Certains de ces modèles utilisent la surveillance hémodynamique ou quantifier la perte de sang, mais ils manquent de cohérence. Le modèle actuel comprend la quantification de la perte de sang, la surveillance hémodynamique en temps réel dans un modèle murin qui offre l'avantage d'utiliser des lignes transgéniques et un mécanisme à haut débit pour enquêter davantage sur les mécanismes physiopathologiques de l'hémorragie incontrôlée.

Introduction

Le traumatisme est la principale cause de décès et d'incapacité chez les jeunes du monde entier. ^{1 L'} hémorragie non contrôlée reste la principale cause de mortalité chez les patients traumatisés gravement blessés. ^{2 La} prise en charge du traumatisme hémorragique est double: le contrôle des saignements chirurgicaux et la réanimation et le remplacement du sang perdu.

Les modèles animaux de choc hémorragique ont été la pierre angulaire de la recherche sur les traumatismes et peuvent être utilisés dans l'évaluation de la pathophysiologie et du traitement du choc traumatique / hémorragique. ^{3 , 4 Les} chocs dans les modèles animaux peuvent être atteints largement par deux méthodes: hémorragie contrôlée et hémorragie incontrôlée. ^{5 , 6 L'} hémorragie contrôlée est effectuée par élimination d'un volume fixe de sang ou par prélèvement sanguin pour obtenir une certaine pression artérielle (pression fixe). Tandis que leLes modèles se sont utiles dans l'évaluation des mécanismes et des altérations immunitaires du choc hémorragique, ils ne sont pas applicables aux tests d'agents hémostatiques et ne modifient pas le scénario clinique de l'hémorragie suite à un traumatisme. Dans ce but, nous avons cherché à développer un modèle d'hémorragie incontrôlée qui nous permettrait de tester des modifications hémostatiques et des agents pro-coagulants dans un modèle murin. Le foie est une option attrayante pour une hémorragie incontrôlée en partie en raison de l'apport sanguin double sur le foie et c'est l'un des organes intrabdominaux les plus fréquemment blessés dans les traumatismes contondants et pénétrants. Compte tenu de la pertinence clinique élevée, le foie a été utilisé comme modèle d'hémorragie incontrôlée, le plus souvent chez les modèles de rat et de porc, mais récemment chez les primates. ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} Les modèles murins ont également incorporé des lésions hépatiques, comme un modèle d'écrasement ou un traumatisme contondant; Cependant, ces modèles n'entraînent pas de choc hémorragique secondaire à la lésion hépatique. ^{13 , 14}

Les modèles de rat et de porc de l'hémorragie hémorragique incontrôlée, bien que précieux en ce qui concerne les pratiques de réanimation et la surveillance hémodynamique, sont moins avantageux qu'un modèle murin pour diverses raisons telles que le coût, le nombre d'animaux utilisés et, surtout, le manque relatif de lignes transgéniques disponibles pour l'analyse De signalisation cellulaire et moléculaire spécifique. Le modèle murin actuel présente des similitudes importantes avec les modèles existants d'hémorragie hépatique, y compris la lacération standardisée du foie, la quantification de la perte de sang, le suivi hémodynamique et la capacité d'effectuer une analyse de survie. De nombreux modèles existants ne comportent que certains de ces aspects alors que notre modèle a été développé pour mesurer une grande partie de la variabilité physiologiqueSimultanément et à plusieurs souris. De plus, le développement d'un modèle murin ouvre la porte à des recherches au-delà de la réanimation et à de plus grands mécanismes de pathophysie en hémorragie incontrôlée avec le potentiel d'un modèle rentable à haut débit utilisant des techniques moléculaires avancées.

Protocole

Les souris ont été logées conformément aux directives de soins aux animaux de l'Université de Pittsburgh (Pittsburgh, PA, États-Unis) et aux Instituts nationaux de santé (NIH, Bethesda, MD, États-Unis) dans des conditions spécifiques sans pathogène avec 12 h de cycles lumière-obscurité et accès gratuit à Alimentation standard et eau. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées et menées conformément aux lignes directrices énoncées par le comité de recherche et de soins des animaux de l'Université de Pittsburgh.

1. Champ chirurgical et configuration de l'instrument

1. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux, suture, gaze, applicateurs de coton, tubulures et tubulures avant la procédure.
   1. Stériliser les instruments chirurgicaux, les sutures, la gaze et les applicateurs de coton dans un autoclave. Stériliser les tubes et les connecteurs de tubes avec de l'oxyde d'éthylène.
2. Champ chirurgical
   1. Allumez un coussin chauffant à circulation d'eau et réglez à 37 ° C. Placez un surgiCal blue pad sur le dessus et ensuite un drap stérile sur le dessus bleu chirurgical.
   2. Ouvrez tous les instruments stérilisés sur le drap stérile. Utilisez des gants stériles pour éviter de briser la stérilité pendant cette étape.
   3. Remplissez un bol en acier inoxydable avec 70% d'éthanol et mis de côté. Cela servira à nettoyer les instruments entre les animaux.
   4. Allumez le stérilisateur de microbilles et laissez chauffer à 150 ° C. Cela servira également à nettoyer les instruments entre les animaux. Si vous effectuez une intervention chirurgicale sur plus de 5 souris, assurez-vous de changer d'instrument pour un nouvel ensemble stérile.
3. Installation du transducteur
   1. Branchez un transducteur stérile, un tube PE-50, deux aiguilles 23G et un luer mâle-mâle et un robinet à trois voies. ⁶
   2. Calibrer et zéro le transducteur selon les instructions du fabricant.

2. Traitement chirurgical de la lacération du foie

1. Induction et positionnement de l'anesthésie
   1. Injecter le pentobarbital de sodium par voie intrapéritonéale à la dose de 70 mg / kg. L'anesthésie devrait prendre effet entre 5 à 10 minutes; Évaluer la profondeur de l'anesthésie avec un pincement de l'orteil. Si la souris a répondu à la pincée, un temps supplémentaire ou une anesthésie est nécessaire. Si une anesthésie supplémentaire est nécessaire pendant la procédure, complétez le pentobarbital de sodium. Ne pas donner de suppléments en plus grande quantité que 0,05 mL pour éviter un surdosage.
   2. Une fois que la souris est complètement sous anesthésie, positionnez la souris en position couchée sur un panneau chirurgical. Fixez les quatre branches de la souris à la carte avec du ruban adhésif.
   3. Raser l'abdomen et les ailes bilatérales avec un rasoir.
   4. Faire tremper la gaze stérile avec de la betadine et appliquer sur l'abdomen et les ailes bilatérales pour la chirurgie. Pour les expériences de survie, prépare l'abdomen et les aines avec de la betadine suivie d'éthanol pour un total de trois cycles de préparation.
   5. Insérez une sonde de température rectale pour surveiller la température de base tout au long de la procédure. Gardez le cTempérature du minerai entre 35-37 ° C.
2. L'artère fémorale et la canulation veineuse
   1. Pour la mise en place du cathéter veineux: remplissez le tube PE-10, une aiguille de 30 G et un robinet à trois voies avec la solution de Ringer lacté à partir d'un sac IV.
   2. Pour la mise en place du cathéter artériel: remplir le tube PE-10 et l'aiguille 30G avec une solution salée héparinée (dilution 1:10 de 1 000 U d'héparine). L'héparine-solution saline est nécessaire pour prévenir la coagulation.
   3. Placez la souris sous un microscope à dissection.
   4. Faire une incision longitudinale de 4 à 5 mm sur le muscle de l'aine à l'aide de ciseaux d'iris chirurgicaux. L'utilisation de pinces Dumont saisit le tissu adipeux relié au muscle adducteur et tire latéralement pour une exposition propre du faisceau fémoral. Ne pas disséquer à travers le tissu adipeux car cela entraînera des lésions vasculaires.
   5. Discute soigneusement le nerf loin de l'artère et de la veine avec la pince Dumont. Il y a un coussinet gras adjacent au nerf. Prenez ceci avec un Dumont forcep anD tire latéralement; Cela attire le nerf de l'artère créant un avion pour la dissection. Avec d'autres Dumont forcep disséquent le tissu conjonctif entre le nerf et l'artère.
      1. Ne pas saisir le nerf pendant cette partie de la dissection.
   6. Bouclez trois sutures de soie 6-0 autour de l'artère et de la veine proximale au décollage de la femelle profonde.
      1. Placez la suture 1 le plus proche et laissez-la.
      2. Placez la suture 2 le plus distalement et attachez-la immédiatement.
      3. Placez la suture 3 entre les sutures 1 et 2 et laissez-les lâcher.
   7. Faire une artériotomie sur la surface ventrale du vaisseau. L'utilisation de ciseaux microvasculaires est recommandée pour provoquer une artériotomie pour éviter la transection du vaisseau.
   8. Insérez le cathéter à trois voies dans l'artère. Imprimez immédiatement les sutures 1 et 2 pour fixer le cathéter en place.
   9. Connectez le cathéter à trois voies au transducteur et collectez les données de la tension artérielle de base.
   10. Répétez les étapes 2.2.4 - 2.2.6 sur l'aine opposée. Canule la veine fémorale d'une manière similaire à celle de l'artère. Effectuer une venotomie sur la surface ventrale du vaisseau suivie de l'insertion du cathéter. Ce cathéter peut être utilisé pour l'administration de fluide ou de médicament.
3. Laceration du foie
   1. Pré-peser un tube contenant 0,5 ml de PBS, trois triangles d'absorption et un bateau de pesée par souris.
   2. Faire une incision de laparotomie de la ligne médiane ventrale à partir du processus de xyphoïde et s'étendre de manière caudale pour permettre l'exposition complète du foie.
   3. Insérez un triangle d'absorption dans l'abdomen contre la paroi abdominale droite. Répétez sur le côté gauche.
      1. Assurez-vous que le triangle d'absorption est éloigné du foie pour éviter un effet hémostatique d'emballage après la détérioration du foie.
   4. Prenez soigneusement le lobe gauche du milieu du foie et détériorez 75% du lobe avec des ciseaux d'iris chirurgicaux. Placez le laceréD dans un tube contenant du PBS.
   5. Fermez la paroi abdominale avec des agrafes par l'intermédiaire d'un applicateur de base. Saisissez la peau et les muscles ensemble et essuyez l'agrafe. Faites cela le plus rapidement possible après la lacération du foie pour éviter la perte de sang à l'extérieur de l'abdomen. Dans les expériences de survie, l'abdomen est fermé en deux couches. Une suture absorbable en cours d'exécution pour le muscle suivie d'une couche de suture non absorbable pour la peau assure une fermeture adéquate.
   6. Pour les souris qui sont pour des temps de survie supérieures à 30 min, les cathéters fémoraux doivent être enlevés, l'artère et la veine liées avec la suture 3 de l'étape 2.2.6. Les ailes bilatérales sont ensuite fermées en deux couches comme décrit dans l'étape précédente.
   7. Après une période d'intérêt spécifique pour l'hémorragie (30 min jusqu'à 72 h), enlever les agrafes. Retirer les triangles d'absorption et les mettre dans les bateaux de pesée pré-pesés correspondants. Utilisez des triangles d'absorption supplémentaires pour absorber tout sang non absorbé.
   8. Pesez les filtres d'absorption pour calculer la perte totale de sang.
4. Soins post-opératoires
   1. Laissez les souris qui doivent être sacrifiées à 30 min sur le panneau chirurgical et sous surveillance constante et sous anesthésie complète jusqu'au moment du sacrifice. Les souris sont euthanasiées avec une combinaison de ponction cardiaque et un surdosage d'isoflurane inhalé.
   2. Placez des souris qui sont pour des points de temps de survie plus longs dans une cage de récupération au-dessus d'un coussin chauffant circulant à l'eau. Surveillez constamment les souris pendant la récupération et ne laissez pas sans surveillance jusqu'à ce qu'elles retrouvent conscience pour maintenir le recul sternal. Ne remettez la souris dans l'espace de la cage qu'avec d'autres souris qu'une fois qu'elle a récupéré de l'anesthésie.
   3. Administrer une analgésie post-opératoire avec 0,1 mg / kg de buprenex par injection sous-cutanée une fois réveillée par anesthésie et toutes les 12 h après le moment du sacrifice.
   4. Autoriser les souris à accéder gratuitement aux aliments et à l'eau après leur retour à leurCages normales post-opératoires.
   5. Au moment du sacrifice pour les souris de survie, l'anesthésie est réalisée avec de l'isoflurane inhalé. Une fois sous anesthésie, le sang est recueilli par une ponction cardiaque cardiaque droite, la perte de sang est enregistrée comme décrit ci-dessus et enfin l'euthanasie est assurée avec une surdose d'isoflurane.

Résultats

Le modèle de laceration du foie entraîne une perte sanguine reproductible et constante chez la souris. La figure 1A démontre le poids constant du foie lacéré qui peut être obtenu avec un écart type de seulement 0,02 g. Cette consistance dans le poids du foie lacéré permet de reproduire le modèle entre les souris et dans différentes configurations expérimentales telles que différents protocoles de réanimation. De plus, le poids reproductible du foie lacéré...

Discussion

Le modèle de laceration du foie murin décrit ici fournit un modèle fiable et cohérent d'hémorragie incontrôlée. Ce modèle est simple à réaliser, mais il y a des étapes importantes qui nécessitent une considération méticuleuse. La partie la plus techniquement difficile du modèle est la canulation des vaisseaux fémoraux pour la surveillance hémodynamique et l'administration de fluide / médicament. Des précautions doivent être prises lors de la dissection du nerf et de l'artériotomie / veno...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
SS/45 dumonts	Fine Science Tools	11203-25
surgical scissors	Fine Science Tools	14068-12
hemostats	Fine Science Tools	13009-12
microscissors	Fine Science Tools	15000-08
0.8mm curved forceps	Fine Science Tools	11009-13
suture reel 6-0	Fine Science Tools	18020-60
suture 4-0 silk w/ needle	Owens Minor	K188H
gauze 4x4	can be purchased through any global vendor
cotton-tip applicator	can be purchased through any global vendor
30G needle	can be purchased through any global vendor
23G needle	can be purchased through any global vendor
10cc syringe	can be purchased through any global vendor
50cc conical tube	can be purchased through any global vendor
1cc syringe w/ 25G needle	Fisher Scientific	14-826-88
Polyethylene 10 tubing 100`(PE-10)	Fisher Scientific	14-170-12P
Polyethylene 50 tubing 100`(PE-50)	Fisher Scientific	14-170-12B
3-way stopcock	Fisher Scientific	NC9779127
surgical blue pad	Fisher Scientific	50-7105
Sterile Field dressings	Fisher Scientific	NC9517505
tape rolls 1"	Corporate Express	MMM26001
straight side wide mouth jars	VWR	159000-058
stainless steel tray 8" x 11"	VWR	62687-049
male-male leur lock 3-way	VWR	20068-909
sterilization pouch 3"x8"	VWR	24008
sterilization pouch 5"x10"	VWR	24010
absorption triangles	Fine Science Tools	18105-03
7mm wound clip applier	Fisher Scientific	E0522687
1000 7mm wound clips	Fisher Scientific	E0522687
betadine (4oz)	can be purchased through any global vendor
sterile gloves	can be purchased through any global vendor
eppendorfs	can be purchased through any global vendor
1/2cc Lo-Dose insulin syringe	Fisher Scientific	12-826-79
small weigh boat	can be purchased through any global vendor
lactated ringers	can be purchased through any global vendor
hepranized saline solution (.1µ hep + 9.9µNaCl)	can be purchased through any global vendor
phosphate buffered saline	can be purchased through any global vendor
pentobarbital	can be purchased through any global vendor
Wild M650 microscope w/ boom stand	Leica
Digi-Med BPA-400 analyzer & systems integrator	Micro-Med	SYS-400
TXD-310 (Digi-Med Transducer)	Micro-Med	TXD-300
Computer	Dell
microbead instrument sterilizer	VWR	11156-002
Oster A5 clippers w. size 40 blade	VWR	10749-020
circulating heating pad 18x26	Harvard	py872-5272
rectal thermometer	Kent Scientific	RET-3