Scossa emorragica non controllata modellata mediante Lacerazione del fegato nei topi con monitoraggio emodinamico in tempo reale

Riepilogo

L'emorragia non controllata, una causa importante della mortalità tra i pazienti traumatici, può essere modellata utilizzando una lacerazione epatica standard in un modello murino. Questo modello provoca una consistente perdita di sangue, la sopravvivenza e consente di testare agenti emostatici. Questo articolo fornisce il processo passo per passo per eseguire questo prezioso modello.

Abstract

L'emorragia non controllata è una causa importante delle morti evitabili tra i pazienti traumatici. Abbiamo sviluppato un modello murino di emorragia incontrollata attraverso una lacerazione epatica che comporta una consistente perdita di sangue, alterazioni emodinamiche e sopravvivenza.

I topi subiscono una resezione standardizzata del lobo sinistro e medio del fegato. Sono autorizzati a sanguinare senza intervento meccanico. Gli agenti emostatici possono essere somministrati come terapia di pre-trattamento o di soccorso a seconda dell'interesse dell'investigatore. Durante l'emorragia, viene eseguito il monitoraggio emodinamico in tempo reale attraverso una linea arteriosa sinistra femorale. I topi vengono poi sacrificati, la perdita di sangue viene quantificata, il sangue viene raccolto per ulteriori analisi e gli organi vengono raccolti per l'analisi del danno. È descritto il disegno sperimentale per consentire la sperimentazione simultanea di più animali.

L'emorragia epatica come modello di emorragia incontrollata esisteN la letteratura, principalmente nei modelli ratto e porcino. Alcuni di questi modelli utilizzano il monitoraggio emodinamico o quantificano la perdita di sangue ma mancano la coerenza. Il presente modello comprende la quantificazione della perdita di sangue, il monitoraggio emodinamico in tempo reale in un modello murino che offre il vantaggio di utilizzare linee transgeniche e un meccanismo ad alto rendimento per studiare ulteriormente i meccanismi patofisiologici in emorragia incontrollata.

Introduzione

Il trauma è la principale causa di morte e disabilità tra i giovani in tutto il mondo. ^{1 L'} emorragia non controllata rimane una causa principale di mortalità tra i pazienti con traumi gravemente feriti. ^{2 La} gestione del paziente traumatico emorragico è duplice: il controllo del sanguinamento chirurgico, la rianimazione e la sostituzione del sangue perduto.

I modelli animali di shock emorragico sono stati la pietra angolare nella ricerca del trauma e possono essere utilizzati nella valutazione della fisiopatologia e del trattamento dello shock traumatico / emorragico. ^{3 , 4 Gli} shock nei modelli animali possono essere ottenuti ampiamente da due metodi: emorragia controllata e emorragia incontrollata. ^{5 , 6 L'} emorragia controllata viene eseguita rimuovendo un volume fisso di sangue o rimuovendo il sangue per ottenere una certa pressione sanguigna (pressione fissa). Mentre ilSe sono utili nella valutazione nei meccanismi e nelle alterazioni immunitarie dello shock emorragico, non sono applicabili alla prova degli agenti emostatici e non mimano lo scenario clinico di emorragia dopo traumi. A questo punto abbiamo cercato di sviluppare un modello di emorragia incontrollata che ci permetterebbe di verificare i cambiamenti emostatici e gli agenti pro-coagulanti in un modello murino. Il fegato è un'opzione attraente per l'emorragia incontrollata in parte a causa della doppia alimentazione del sangue al fegato ed è uno degli organi intrabdominali più comuni in entrambi i traumi sbarrati e penetranti. Data l'elevata rilevanza clinica, il fegato è stato utilizzato come modello di emorragia incontrollata, più comunemente nei modelli ratto e suina ma recentemente anche nei primati. ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} I modelli murini hanno anche incluso lesioni epatiche, ad esempio un modello di schiacciamento o un trauma sordo; Tuttavia, questi modelli non provocano uno shock emorragico secondario alla lesione epatica. ^{13 , 14}

I modelli ratto e sanguigni di emorragia epatica incontrollata, pur valorizzando le pratiche di rianimazione e il monitoraggio emodinamico, sono meno vantaggiose rispetto a un modello murino per varie ragioni come il costo, il numero di animali utilizzati e soprattutto la mancanza relativa di linee transgeniche disponibili per l'analisi Di specifiche segnalazioni cellulari e molecolari. L'attuale modello murino condivide importanti somiglianze con i modelli di emorragia epatica esistenti, tra cui lacerazione epatica standardizzata, la quantificazione della perdita di anima, il monitoraggio emodinamico e la capacità di eseguire l'analisi di sopravvivenza. Molti modelli esistenti incorporano solo alcuni di questi aspetti, mentre il nostro modello è stato sviluppato per misurare molte delle variazioni fisiologicheSimultaneamente e in topi multipli. Inoltre, lo sviluppo di un modello murino apre la porta a indagini oltre la rianimazione e nei più grandi meccanismi di fisiopatologia in emorragia incontrollata con il potenziale di un modello a costi elevati e ad alto rendimento utilizzando tecniche avanzate molecolari.

Protocollo

I topi sono stati ospitati in conformità con le norme di cura degli animali in condizioni specifiche per la cura degli animali, con 12 ore di ciclo chiaro e scuro, e accesso libero a tutti i pazienti, in conformità con l'Università di Pittsburgh (Pittsburgh, PA) e National Institutes of Health (NIH; Bethesda, MD). L'alimentazione standard e l'acqua. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati e condotti secondo le linee guida stabilite dal comitato di ricerca e cura degli animali presso l'Università di Pittsburgh.

1. Installazione del campo chirurgico e dello strumento

1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici, sutura, garza, applicatori a punta di cotone, tubi e raccordi di tubi prima della procedura.
   1. Sterilizzare strumenti chirurgici, sutura, garza e applicatori a punta di cotone in autoclave. Sterilizzare connettori tubi e tubi con ossido di etilene.
2. Campo chirurgico
   1. Accendere un tappetino di riscaldamento circolante e impostare a 37 ° C. Mettere un surgiCalotta blu su di esso e poi un drappo sterile in cima al tampone blu chirurgico.
   2. Aprire tutti gli strumenti sterilizzati sul tetto sterile. Utilizzare guanti sterili per evitare la rottura della sterilità durante questo passaggio.
   3. Riempire una ciotola in acciaio inox con il 70% di etanolo e mettere da parte. Questo sarà usato per pulire gli strumenti tra gli animali.
   4. Attivare lo sterilizzatore a micropiuma e lasciare raffreddare a 150 ° C. Questo sarà utilizzato anche per pulire gli strumenti tra gli animali. Se effettui interventi su più di 5 topi, assicuratevi di cambiare gli strumenti in un nuovo kit sterile.
3. Configurazione del trasduttore
   1. Collegare un trasduttore sterile, tubo PE-50, due aghi 23G e un luer maschio-maschio e un rubinetto a tre vie. ⁶
   2. Calibrare e rimuovere il trasduttore per istruzioni del produttore.

Procedura chirurgica di Lacerazione del fegato

1. Induzione e posizionamento di anestesia
   1. Iniettare il pentobarbital sodico intraperitonealmente alla dose di 70 mg / kg. L'anestesia dovrebbe avere effetto tra 5-10 minuti; Valutare la profondità dell'anestesia con un pizzico di punta. Se il mouse ha risposta al pizzico del piede, è necessario un tempo aggiuntivo o anestesia. Se durante la procedura è necessaria un'anestesia aggiuntiva, completare pentobarbital sodico. Non somministrare integratori in quantità superiori a 0,05 ml per prevenire il sovradosaggio.
   2. Dopo che il mouse è completamente sotto l'anestesia, posizionare il mouse supino su una scheda chirurgica. Fissare tutti i quattro arti del mouse sulla scheda con nastro.
   3. Rasare l'addome e gli ingombri bilaterali con un rasoio.
   4. Immergere la garza sterile con betadina e applicare all'addome e alle intestine bilaterali per la chirurgia. Per esperimenti di sopravvivenza, preparare l'addome e gli inguine con betadina seguita da etanolo per un totale di tre cicli di preparazione.
   5. Inserire una sonda di temperatura rettale per monitorare la temperatura del cuore durante tutta la procedura. Tenere il cTemperatura del minerale tra 35-37 ° C.
2. Arteria femorale e cannulazione venosa
   1. Per il set-up del catetere venoso: riempire il tubo PE-10, un ago da 30 G e un rubinetto a tre vie con la soluzione di Lactated Ringer da una borsa IV.
   2. Per il set-up del catetere arterioso: riempire il tubo PE-10 e l'ago 30G con salina eparinizzata (diluizione 1:10 di 1.000 U di eparina). È necessaria la salina eparina per prevenire il coagulazione.
   3. Posizionare il mouse sotto un microscopio di dissezione.
   4. Fai un'incisione longitudinale di 4-5 millimetri sopra il muscolo dell'inguine utilizzando le forbici chirurgiche Iris. Usando le pinze Dumont afferrare il tessuto adiposo collegato al muscolo adductor e tirare lateralmente per un'esposizione pulita del fascio femorale. Non dissectare attraverso il tessuto adiposo in quanto ciò porterà a lesioni vascolari.
   5. Separare con cura il nervo dall'arteria e dalla vena con la pinza Dumont. C'è un rilievo di grasso adiacente al nervo. Prendi questo con un Dumont forcep anD tirare lateralmente; Questo tira fuori il nervo dall'arteria creando un piano per la dissezione. Con l'altro Dumont forcep si disseccano con estrema facilità il tessuto connettivo tra il nervo e l'arteria.
      1. Non afferrare il nervo durante questa parte della dissezione.
   6. Loop tre suture di seta 6-0 intorno all'arteria e vena prossimale al profunda femoris decollare.
      1. Posizionare la sutura 1 in modo più prossimale e lasciare sciolta.
      2. Posizionare la sutura 2 più distalmente e legare immediatamente.
      3. Posizionare la sutura 3 tra sutura 1 e 2 e lasciarla allentata.
   7. Fare un'arteriotomia sulla superficie ventrale del vaso. L'uso di forbici microvascolari è raccomandato per evitare l'attraversamento della vasca per evitare l'arteriotomia.
   8. Inserire il catetere a tre vie nell'arteria. Fissare immediatamente la Sutura 1 e 2 per fissare il catetere in posizione.
   9. Collegare il catetere a tre vie al trasduttore e raccogliere i dati della pressione sanguigna di base.
   10. Ripetere i passaggi 2.2.4 - 2.2.6 sull'inguine opposto. Canottare la vena femorale in modo simile all'arteria. Eseguire una venotomia sulla superficie ventrale del vaso seguita dall'inserzione del catetere. Questo catetere può essere utilizzato per somministrazione di fluidi o farmaci.
3. Lacerazione del fegato
   1. Pre-pesare un tubo contenente 0,5 mL di PBS, tre triangoli di assorbimento e una barca di pesatura per mouse.
   2. Effettuare un'incisione laparotomia midline ventrale partendo dal processo xiphoid e estendentesi caudalmente per consentire l'esposizione del fegato completamente.
   3. Inserire un triangolo di assorbimento nell'addome contro la parete addominale destra. Ripetere sul lato sinistro.
      1. Assicurarsi che il triangolo di assorbimento sia lontano dal fegato per evitare un effetto emostatico di imballaggio dopo che il fegato è lacerato.
   4. Prendete con attenzione il lobo sinistro del fegato e lacerate il 75% del lobo con le forbici chirurgiche Iris. Mettere il laceratoSegmento d in un tubo contenente PBS.
   5. Chiudere la parete addominale con le graffette tramite un applicatore di graffette. Afferrare la pelle e il muscolo insieme e sparare il fiocco. Fai questo il più rapidamente possibile dopo lacerazione del fegato per evitare la perdita di sangue al di fuori dell'addome. Negli esperimenti di sopravvivenza, l'addome è chiuso in due strati. Una sutura assorbibile in esecuzione per il muscolo seguita da uno strato di sutura non assorbibile per la pelle fornisce una chiusura adeguata.
   6. Per i topi che sono per il tempo di sopravvivenza più di 30 minuti i cateteri femorali devono essere rimossi, l'arteria e la vena legati con la sutura 3 dalla fase 2.2.6. I ginocchi laterali sono quindi chiusi in due strati come descritto nel passaggio precedente.
   7. Dopo un periodo di tempo specifico per l'emorragia (da 30 minuti a 72 h), togliere le graffette. Rimuovere i triangoli di assorbimento e mettere in corrispondenti barche pesate pre-pesate. Utilizzare ulteriori triangoli di assorbimento per assorbire eventuali sangue non assorbito.
   8. Filtri di assorbimento del peso per calcolare la perdita totale del sangue.
4. Cura postoperatoria
   1. Lasciare i topi che devono essere sacrificati a 30 minuti sulla scheda chirurgica e sotto costante monitoraggio e sotto anestesia completa fino al momento del sacrificio. I topi vengono eutanizzati con una combinazione di puntura cardiaca e un sovradosaggio di isoflurano inalato.
   2. Metti i topi che sono per più tempo di sopravvivenza punti in una gabbia di recupero in cima a un rilievo di riscaldamento circolante con acqua. Monitorare costantemente i topi durante il recupero e non lasciare incustoditi fino a quando non riesumano la coscienza per mantenere la ricostruzione sternale. Rimettere il mouse allo spazio di gabbia con altri topi solo dopo aver recuperato dall'anestesia.
   3. Somministrare analgesia postoperatoria con 0.1 mg / kg di buprenex mediante iniezione sottocutanea una volta svegliata da anestesia e ogni 12 h dopo fino all'ora del sacrificio.
   4. Consentire ai topi di accedere gratuitamente al cibo e all'acqua dopo che saranno restituiti al loroNormali gabbie post-operative.
   5. Al momento del sacrificio per topi di sopravvivenza, l'anestesia viene eseguita con isoflurano inalato. Una volta sottoposta a anestesia, il sangue viene raccolto tramite una punzonatura cardiaca destra, la perdita di sangue viene registrata come sopra descritto e infine l'eutanasia è assicurata con un sovradosaggio di isoflurano.

Risultati

Il modello di lacerazione del fegato produce una perdita di sangue riproducibile e coerente nei topi. La figura 1A mostra il peso coerente del fegato lacerato che può essere ottenuto con una deviazione standard di soli 0,02 g. Questa coerenza nel peso fegato lacerato consente la capacità di riprodurre il modello tra i topi e in differenti configurazioni sperimentali come diversi protocolli resuscitativi. Inoltre, il peso riproducibile del fegato lacerato, con un errore...

Discussione

Il modello di lacerazione del fegato murino qui descritto fornisce un modello affidabile e coerente di emorragia incontrollata. Questo modello è semplice da eseguire ma ci sono importanti passaggi che richiedono una considerazione meticolosa. La parte più tecnicamente impegnativa del modello è la cannulazione dei vasi femorali per il monitoraggio emodinamico e la somministrazione di fluido / farmaco. La cura deve essere presa durante la dissezione del nervo e dell'arteriotomia / venotomia. È importante non tocca...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
SS/45 dumonts	Fine Science Tools	11203-25
surgical scissors	Fine Science Tools	14068-12
hemostats	Fine Science Tools	13009-12
microscissors	Fine Science Tools	15000-08
0.8mm curved forceps	Fine Science Tools	11009-13
suture reel 6-0	Fine Science Tools	18020-60
suture 4-0 silk w/ needle	Owens Minor	K188H
gauze 4x4	can be purchased through any global vendor
cotton-tip applicator	can be purchased through any global vendor
30G needle	can be purchased through any global vendor
23G needle	can be purchased through any global vendor
10cc syringe	can be purchased through any global vendor
50cc conical tube	can be purchased through any global vendor
1cc syringe w/ 25G needle	Fisher Scientific	14-826-88
Polyethylene 10 tubing 100`(PE-10)	Fisher Scientific	14-170-12P
Polyethylene 50 tubing 100`(PE-50)	Fisher Scientific	14-170-12B
3-way stopcock	Fisher Scientific	NC9779127
surgical blue pad	Fisher Scientific	50-7105
Sterile Field dressings	Fisher Scientific	NC9517505
tape rolls 1"	Corporate Express	MMM26001
straight side wide mouth jars	VWR	159000-058
stainless steel tray 8" x 11"	VWR	62687-049
male-male leur lock 3-way	VWR	20068-909
sterilization pouch 3"x8"	VWR	24008
sterilization pouch 5"x10"	VWR	24010
absorption triangles	Fine Science Tools	18105-03
7mm wound clip applier	Fisher Scientific	E0522687
1000 7mm wound clips	Fisher Scientific	E0522687
betadine (4oz)	can be purchased through any global vendor
sterile gloves	can be purchased through any global vendor
eppendorfs	can be purchased through any global vendor
1/2cc Lo-Dose insulin syringe	Fisher Scientific	12-826-79
small weigh boat	can be purchased through any global vendor
lactated ringers	can be purchased through any global vendor
hepranized saline solution (.1µ hep + 9.9µNaCl)	can be purchased through any global vendor
phosphate buffered saline	can be purchased through any global vendor
pentobarbital	can be purchased through any global vendor
Wild M650 microscope w/ boom stand	Leica
Digi-Med BPA-400 analyzer & systems integrator	Micro-Med	SYS-400
TXD-310 (Digi-Med Transducer)	Micro-Med	TXD-300
Computer	Dell
microbead instrument sterilizer	VWR	11156-002
Oster A5 clippers w. size 40 blade	VWR	10749-020
circulating heating pad 18x26	Harvard	py872-5272
rectal thermometer	Kent Scientific	RET-3