El shock hemorrágico no controlado se modela a través de la laceración hepática en ratones con monitorización hemodinámica en tiempo real

Resumen

La hemorragia incontrolada, una importante causa de mortalidad entre los pacientes con traumatismo, puede ser modelada usando una laceración hepática estándar en un modelo murino. Este modelo resulta en pérdida de sangre consistente, supervivencia, y permite la prueba de agentes hemostáticos. Este artículo proporciona el proceso paso a paso para realizar este valioso modelo.

Resumen

La hemorragia no controlada es una causa importante de muertes evitables entre los pacientes traumatizados. Hemos desarrollado un modelo murino de hemorragia no controlada a través de una laceración hepática que da como resultado pérdida de sangre consistente, alteraciones hemodinámicas y supervivencia.

Los ratones se someten a una resección normalizada del lóbulo medio izquierdo del hígado. Se les permite sangrar sin intervención mecánica. Los agentes hemostáticos se pueden administrar como terapia de pretratamiento o de rescate dependiendo del interés del investigador. Durante el tiempo de la hemorragia, se realiza monitorización hemodinámica en tiempo real a través de una línea arterial femoral izquierda. Luego se sacrifican los ratones, se cuantifica la pérdida de sangre, se recoge sangre para un análisis posterior y se recogen los órganos para el análisis de la lesión. El diseño experimental se describe para permitir la prueba simultánea de múltiples animales.

Existe hemorragia hepática como modelo de hemorragia incontroladaN en la literatura, principalmente en modelos de ratas y porcinos. Algunos de estos modelos utilizan la monitorización hemodinámica o cuantifican la pérdida de sangre pero carecen de consistencia. El presente modelo incorpora la cuantificación de la pérdida de sangre, monitoreo hemodinámico en tiempo real en un modelo murino que ofrece la ventaja de usar líneas transgénicas y un mecanismo de alto rendimiento para investigar más a fondo los mecanismos fisiopatológicos en la hemorragia no controlada.

Introducción

El trauma es la principal causa de muerte y discapacidad entre los jóvenes de todo el mundo. ^{1 La} hemorragia incontrolada sigue siendo una de las principales causas de mortalidad entre los pacientes traumatizados gravemente heridos. ^{2 El} tratamiento del paciente con trauma hemorrágico es doble: control de la hemorragia quirúrgica y reanimación y reemplazo de sangre perdida.

Los modelos animales de choque hemorrágico han sido la piedra angular en la investigación de trauma y pueden ser utilizados en la evaluación de la fisiopatología y el tratamiento del shock traumático / hemorrágico. ^{3 , 4 El} shock en los modelos animales puede lograrse ampliamente por dos métodos: hemorragia controlada y hemorragia incontrolada. ^{5 , 6 La} hemorragia controlada se realiza mediante la extirpación de un volumen fijo de sangre o por extracción de sangre para lograr una determinada presión sanguínea (presión fija). Mientras que laAlgunos modelos son útiles en la evaluación de los mecanismos y alteraciones inmunitarias en el choque hemorrágico, no son aplicables a la prueba de agentes hemostáticos y no imitan el escenario clínico de hemorragia tras un traumatismo. En este sentido, se buscó desarrollar un modelo de hemorragia incontrolada que nos permitiera probar los cambios hemostáticos y los agentes procoagulantes en un modelo murino. El hígado es una opción atractiva para la hemorragia incontrolada en parte debido a la doble fuente de sangre al hígado y es uno de los órganos intrabdominal más comúnmente lesionados en el trauma romo y penetrante. Dada la alta relevancia clínica, el hígado se ha utilizado como modelo de hemorragia incontrolada, más comúnmente en modelos de ratas y porcinos, pero recientemente también en primates. ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} 13 ^{, 14}

Los modelos de hemorragia hepática no controlada por ratas y porcinos, aunque valiosos en la observación de prácticas de reanimación y monitorización hemodinámica, son menos ventajosos que un modelo murino por diversas razones, tales como el costo, el número de animales utilizados y lo importante es la falta relativa de líneas transgénicas disponibles para el análisis De señalización celular y molecular específica. El presente modelo murino comparte similitudes importantes con los modelos de hemorragia hepática existentes, incluyendo la laceración estandarizada del hígado, la cuantificación de la pérdida de sangre, el monitoreo hemodinámico y la capacidad para realizar el análisis de supervivencia. Muchos modelos existentes sólo incorporan algunos de estos aspectos mientras que nuestro modelo fue desarrollado para medir muchas de las variaciones fisiológicasBles simultáneamente y en ratones múltiples. Además, el desarrollo de un modelo murino abre la puerta a investigaciones más allá de la reanimación ya mecanismos fisiopatológicos más grandes en hemorragia incontrolada con el potencial de un modelo rentable y de alto rendimiento usando técnicas moleculares avanzadas.

Protocolo

Los ratones se alojaron de acuerdo con las pautas de cuidado de animales de la Universidad de Pittsburgh (Pittsburgh, PA, EE.UU.) y de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, Bethesda, MD, EUA) en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos de luz y oscuridad de 12 h y libre acceso a Alimentación estándar y agua. Todos los experimentos con animales fueron aprobados y llevados a cabo de acuerdo con las directrices establecidas por el Animal Research and Care Committee en la Universidad de Pittsburgh.

1. Campo quirúrgico y configuración del instrumento

1. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos, sutura, gasa, aplicadores de punta de algodón, tubería y conectores de tubería antes del procedimiento.
   1. Esterilizar instrumentos quirúrgicos, sutura, gasa y aplicadores de punta de algodón en un autoclave. Esterilice los conectores de tubería y tubos con óxido de etileno.
2. Campo quirúrgico
   1. Encienda una almohadilla de calefacción de circulación de agua y ajuste a 37 ° C. Coloque un surgiCal azul encima de ella y luego un paño estéril en la parte superior de la almohadilla azul quirúrgica.
   2. Abra todos los instrumentos esterilizados sobre el paño estéril. Utilice guantes estériles para evitar que se rompa la esterilidad durante este paso.
   3. Llenar un recipiente de acero inoxidable con etanol al 70% y dejar de lado. Esto se usará para limpiar instrumentos entre animales.
   4. Encender el esterilizador de microperlas y dejar calentar a 150 ° C. Esto también se utilizará para limpiar instrumentos entre animales. Si realiza la cirugía en más de 5 ratones, asegúrese de cambiar los instrumentos a un nuevo conjunto estéril.
3. Configuración del Transductor
   1. Conecte un transductor estéril, tubería PE-50, dos agujas 23G y macho-macho luer, y una llave de paso de tres vías. ⁶
   2. Calibre y ajuste el transductor según las instrucciones del fabricante.

2. Procedimiento quirúrgico de laceración del hígado

1. Inducción y posicionamiento de la anestesia
2. Inyectar pentobarbital de sodio por vía intraperitoneal a una dosis de 70 mg / kg. La anestesia debe tener efecto entre 5-10 min; Evalúe la profundidad de la anestesia con un pellizco del dedo del pie. Si el ratón tiene respuesta a la pinza del dedo del pie, se necesita tiempo adicional o anestesia. Si se necesita anestesia adicional durante el procedimiento, suplemento de pentobarbital de sodio. No administre suplementos en cantidades mayores que 0,05 ml para prevenir la sobredosis.
3. Después de que el ratón esté completamente bajo anestesia, coloque el ratón en posición supina sobre una placa quirúrgica. Asegure los cuatro miembros del ratón a la tarjeta con cinta adhesiva.
4. Afeitar el abdomen y las inglesas bilaterales con una maquinilla de afeitar.
5. Remoje la gasa estéril con betadine y aplíquela en el abdomen y las inglesas bilaterales para la cirugía. Para los experimentos de supervivencia, preparar el abdomen y las ingles con betadina seguido de etanol para un total de tres ciclos de preparación.
6. Inserte una sonda de temperatura rectal para monitorear la temperatura central durante todo el procedimiento. Mantener el cLa temperatura del mineral entre 35-37 ° C.

Arteria femoral y venosa

1. Para la instalación de catéter venoso: rellene la tubería PE-10, una aguja de 30 G y una llave de tres vías con solución de lactato de Ringer de una bolsa intravenosa.
2. Para el montaje del catéter arterial: llenar el tubo de PE-10 y la aguja 30G con solución salina heparinizada (dilución 1:10 de 1.000 U de heparina). Se requiere heparina-solución salina para prevenir la coagulación.
3. Coloque el ratón debajo de un microscopio de disección.
4. Haga una incisión longitudinal de 4-5 mm sobre el músculo de la ingle usando tijeras quirúrgicas de Iris. El uso de fórceps Dumont agarra el tejido adiposo conectado al músculo adductor y tire lateralmente para una exposición limpia del haz femoral. No disecar a través del tejido adiposo ya que esto dará lugar a lesión vascular.
5. Cuidadosamente disecar el nervio lejos de la arteria y la vena con la pinza Dumont. Hay un cojín de grasa adyacente al nervio. Coge esto con un Dumont forcep anD tirar lateralmente; Esto extrae el nervio de la arteria creando un plano para la disección. Con otros Dumont forcep disección sin rodeos el tejido conectivo entre el nervio y la arteria.
   1. No tome el nervio durante esta parte de la disección.
6. Bucle tres suturas de seda 6-0 alrededor de la arteria y la vena proximal a la femoral profunda despegue.
   1. Coloque la sutura 1 de forma más proximal y deje suelta.
   2. Coloque la sutura 2 más distalmente y ate inmediatamente.
   3. Coloque la sutura 3 entre la sutura 1 y 2 y deje suelta.
7. Haga una arteriotomía en la superficie ventral del vaso. Se recomienda el uso de tijeras microvasculares para realizar la arteriotomía para evitar la transección del vaso.
8. Inserte el catéter de tres vías en la arteria. Empate inmediatamente la sutura 1 y 2 para asegurar el catéter en su lugar.
9. Conecte el catéter de tres vías al transductor y recoja los datos de la presión arterial basal.
10. Repita los pasos 2.2.4 a 2.2.6 en la ingle opuesta. Cannular la vena femoral de manera similar a la arteria. Realizar una venotomía en la superficie ventral del vaso seguido de la inserción del catéter. Este catéter puede utilizarse para la administración de fluidos o fármacos.

Laceración del Hígado

1. Pre-pesar un tubo que contiene 0,5 ml de PBS, tres triángulos de absorción, y un barco de pesada por ratón.
2. Haga una incisión de laparotomía de la línea media ventral comenzando en el proceso xifoide y extendiéndose caudalmente para permitir la exposición del hígado por completo.
3. Inserte un triángulo de absorción en el abdomen contra la pared abdominal derecha. Repita en el lado izquierdo.
   1. Asegúrese de que el triángulo de absorción está alejado del hígado para evitar un efecto hemostático después de que el hígado se laceró.
4. Agarre cuidadosamente el lóbulo medio izquierdo del hígado y lacerar el 75% del lóbulo con tijeras quirúrgicas de Iris. Coloque el laceradoD en un tubo que contenía PBS.
5. Cierre la pared abdominal con grapas a través de un aplicador de grapas. Agarre la piel y los músculos y dispare la grapa. Hacer esto tan pronto como sea posible después de la laceración del hígado para evitar la pérdida de sangre fuera del abdomen. En experimentos de supervivencia, el abdomen se cierra en dos capas. Una sutura absorbible corriente para el músculo seguida por una capa de sutura no absorbible para la piel proporciona un cierre adecuado.
6. Para los ratones que son para los puntos de supervivencia más de 30 min los catéteres femorales deben ser removidos, la arteria y la vena atada con la sutura 3 de la etapa 2.2.6. Las arcadas bilaterales se cierran entonces en dos capas como se describe en el paso anterior.
7. Después de un tiempo específico de interés para la hemorragia (30 min a 72 h), retire las grapas. Retire los triángulos de absorción y póngalos en los correspondientes botes pesados ​​previamente pesados. Use triángulos de absorción adicionales para absorber cualquier sangre no absorbida.
8. Pesar filtros de absorción para calcular la pérdida total de sangre.

Cuidados postoperatorios

1. Dejar los ratones que se deben sacrificar a los 30 min en el tablero quirúrgico y bajo supervisión constante y bajo anestesia completa hasta el momento del sacrificio. Los ratones son eutanasiados con una combinación de punción cardiaca y una sobredosis de isoflurano inhalado.
2. Coloque los ratones que son para los puntos de tiempo de supervivencia más larga en una jaula de recuperación en la parte superior de una almohadilla de calefacción de circulación de agua. Vigilar constantemente a los ratones durante la recuperación y no dejarlos desatendidos hasta que recuperen la conciencia para mantener la decúbito esternal. Devuelva el ratón a espacio en jaula con otros ratones sólo una vez que se ha recuperado de la anestesia.
3. Administrar analgesia postoperatoria con buprenex a 0,1 mg / kg por inyección subcutánea una vez despertado de la anestesia y cada 12 h después de la expiración del sacrificio.
4. Permitir a los ratones el libre acceso a los alimentos y el agua después de ser devueltos a suJaulas normales después de la operación.
5. En el momento del sacrificio para los ratones de supervivencia, la anestesia se realiza con isoflurano inhalado. Una vez bajo anestesia se recoge sangre a través de una punción cardiaca derecha, la pérdida de sangre se registra como se ha descrito anteriormente y finalmente se asegura la eutanasia con una sobredosis de isoflurano.

Resultados

El modelo de laceración hepática produce una pérdida de sangre reproducible y consistente en ratones. La Figura 1A demuestra el peso consistente del hígado lacerado que se puede obtener con una desviación estándar de sólo 0,02 g. Esta consistencia en el peso del hígado lacerado permite la capacidad de reproducir el modelo entre los ratones y en diferentes configuraciones experimentales tales como diferentes protocolos de resucitación. Además, el peso reproducib...

Discusión

El modelo de laceración de hígado murino descrito aquí proporciona un modelo fiable y consistente de hemorragia no controlada. Este modelo es sencillo de realizar, pero hay pasos importantes que requieren consideración meticulosa. La parte más difícil técnicamente del modelo es la canulación de los vasos femorales para la monitorización hemodinámica y la administración de fluidos / fármacos. Se debe tener cuidado durante la disección del nervio y la arteriotomía / venotomía. Es importante no tocar el nerv...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
SS/45 dumonts	Fine Science Tools	11203-25
surgical scissors	Fine Science Tools	14068-12
hemostats	Fine Science Tools	13009-12
microscissors	Fine Science Tools	15000-08
0.8mm curved forceps	Fine Science Tools	11009-13
suture reel 6-0	Fine Science Tools	18020-60
suture 4-0 silk w/ needle	Owens Minor	K188H
gauze 4x4	can be purchased through any global vendor
cotton-tip applicator	can be purchased through any global vendor
30G needle	can be purchased through any global vendor
23G needle	can be purchased through any global vendor
10cc syringe	can be purchased through any global vendor
50cc conical tube	can be purchased through any global vendor
1cc syringe w/ 25G needle	Fisher Scientific	14-826-88
Polyethylene 10 tubing 100`(PE-10)	Fisher Scientific	14-170-12P
Polyethylene 50 tubing 100`(PE-50)	Fisher Scientific	14-170-12B
3-way stopcock	Fisher Scientific	NC9779127
surgical blue pad	Fisher Scientific	50-7105
Sterile Field dressings	Fisher Scientific	NC9517505
tape rolls 1"	Corporate Express	MMM26001
straight side wide mouth jars	VWR	159000-058
stainless steel tray 8" x 11"	VWR	62687-049
male-male leur lock 3-way	VWR	20068-909
sterilization pouch 3"x8"	VWR	24008
sterilization pouch 5"x10"	VWR	24010
absorption triangles	Fine Science Tools	18105-03
7mm wound clip applier	Fisher Scientific	E0522687
1000 7mm wound clips	Fisher Scientific	E0522687
betadine (4oz)	can be purchased through any global vendor
sterile gloves	can be purchased through any global vendor
eppendorfs	can be purchased through any global vendor
1/2cc Lo-Dose insulin syringe	Fisher Scientific	12-826-79
small weigh boat	can be purchased through any global vendor
lactated ringers	can be purchased through any global vendor
hepranized saline solution (.1µ hep + 9.9µNaCl)	can be purchased through any global vendor
phosphate buffered saline	can be purchased through any global vendor
pentobarbital	can be purchased through any global vendor
Wild M650 microscope w/ boom stand	Leica
Digi-Med BPA-400 analyzer & systems integrator	Micro-Med	SYS-400
TXD-310 (Digi-Med Transducer)	Micro-Med	TXD-300
Computer	Dell
microbead instrument sterilizer	VWR	11156-002
Oster A5 clippers w. size 40 blade	VWR	10749-020
circulating heating pad 18x26	Harvard	py872-5272
rectal thermometer	Kent Scientific	RET-3