Messung der Basal- und Forskolin-stimulierten Lipolyse bei Inguinal Adipose Fat Pads

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur Bestimmung der Basal- und Forskolin-stimulierten Lipolyse in Leistenfett-Pads, die aus normaler Chow-Diät (NCD) oder hochfettigen Diät (HFD) ± Capsaicin-gefütterten Wildtyp-Mäusen erhalten wurden. Als Index für die Lipolyse wurde die Glycerinfreisetzung aus Leistenfett-Pads gemessen.

Zusammenfassung

Die Lipolyse ist ein Verfahren, bei dem das als Triglyceride in adipösen Geweben gelagerte Lipid in Glycerin und Fettsäuren hydrolysiert wird. Dieser Artikel beschreibt die Methode zur Messung der basalen und Forskolin (FSK) -stimulierten Lipolyse in den Leistenfettkissen, die von Wildtyp-Mäusen isoliert wurden, die entweder normale Chow-Diät (NCD), fettreiche Diät (HFD) oder eine fettreiche Diät mit 0,01 gefüttert wurden % Des Capsaicins (CAP; transientes Rezeptorpotential Vanilloidunterfamilie 1 (TRPV1) Agonist) für 32 Wochen. Die hier beschriebene Methode zur Durchführung der Ex-vivo- Lipolyse wird von Schweiger et al. ¹ Wir stellen ein detailliertes Protokoll zur Messung der Glycerinspiegel durch UV-Visible (UV / VIS) -Spektrophotometrie vor. Die hier beschriebene Methode kann verwendet werden, um Leistenfettkissen für Lipolyse-Messungen erfolgreich zu isolieren, um konsistente Ergebnisse zu erzielen. Das für Leistenfettkissen beschriebene Protokoll kann leicht erweitert werden, um die Lipolyse in anderen Geweben zu messen.

Einleitung

Adipöse Gewebe speichern Energie als Fett ² und Fettsäure Oxidation ist für die Thermogenese ^{3 , 4} erforderlich. Fettsäuren, die durch Diäten eingenommen werden, werden zusammen mit Apoproteinen in Chylomikronen verpackt und über Blutkreislauf an verschiedene Gewebe im Körper abgegeben. Obwohl die meisten Zellen im Körper speichern eine Reserve von Energie, Fettgewebe speichert überschüssige Energie als Fett ^{5 , 6} . Die Lipolyse im Fettgewebe wird durch komplexe Prozesse reguliert und die molekularen Details der Lipolyse bleiben noch vage ⁷ .

Die Lipolyse ist ein Verfahren, bei dem Triglyceride (TGL), die im Fettgewebe gespeichert sind, hydrolysiert werden, um Glycerin und Fettsäuren (FA) durch das Enzym adipöse Triglyceridlipase (ATGL) ⁸ zu erzeugen. Veränderungen in der basalen und stimulierten Lipolyse ist ein charakteristisches Merkmal der Fettleibigkeit. Die bDie asale Lipolyse wird durch die ATGL-Aktivierung ⁹ reguliert, die TGL in Diacylglycerin (DAG) umwandelt, das anschließend zu Monoacylglycerin (MAG) hydrolysiert wird. Die Aktivierung von hormonempfindlicher Lipase (HSL) über Adenylylcyclase aktiviert die zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP) abhängige Proteinkinase A (PKA) Stimulation und bewirkt eine Lipolyse. Die Messung der Lipolyse, basal und stimuliert, ist daher wichtig, um die Aktivität der an diesem Prozess beteiligten Proteine ​​zu analysieren. Auch die Entschlüsselung der molekularen Regulation der Lipolyse kann vorteilhaft sein, um neue therapeutische Strategien gegen die Fettleibigkeit zu entwickeln ¹⁰ . Da Moleküle, die die Lipolyse und die Fettsäureoxidation stimulieren, potentielle Kandidaten für die Verringerung der in Depots gespeicherten Fette sind, ist es wichtig, einen robusten Test auf Reproduzierbarkeit zu verwenden.

Bisher veröffentlichte Daten deuten darauf hin, dass die Aktivierung von TRPV1-Protein, ausgedrückt in weißem Fettgewebe, durch CAP-basierteUnd FSK (Adenylylcyclaseaktivator) - stimulierte Lipolyse in Leistenfettkissen ¹¹ . Die bisherige Forschung deutet auch darauf hin, dass die langfristige Aktivierung von TRPV1 durch CAP die PKA ¹² aktiviert. Da die Aktivierung von PKA die Lipolyse ^{13 , 14} stimuliert ^, wird sowohl die basale als auch die PKA-abhängige stimulierte Lipolyse in Leistenfettpolstern, die nach 32 Wochen nach der Fütterung der jeweiligen Diäten von NCD- oder HFD- (± CAP) -Fed-Mäusen isoliert wurden, die Rolle von TRPV1 validieren Aktivierung in der Lipolyse

Dieser Artikel beschreibt eine effiziente Methode zur Bestimmung der basalen und stimulierten Lipolyse. Obwohl andere Verfahren, die radioaktive Isotope von Glycerin und mühsame Hochleistungsflüssigchromatographie oder Gaschromatographie / Massenspektrometrie für die Messungen ^{15 , 16} zur Verfügung stellen, verfügbar sind, bietet diese Methode eine direkte, einfache und kostengünstigeTechnik zur Bestimmung der Lipolyse im Fettgewebe.

Protokoll

Alle Protokolle folgen den Tierschutzrichtlinien der Universität Wyoming.

1. Tierhaltung und Fütterung

ANMERKUNG: Erwachsene männliche Wildtyp-Mäuse (C57BL / 6) (Alter 12 bis 24 Wochen) wurden in der Forschungstierstätte gemäß den Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Protokollen gezüchtet.

1. Ab der Woche 6 des Alters, Haus Mäuse in Gruppen von vier in getrennten Käfigen und zufällig zuordnen sie in Fütterung Gruppen von NCD oder HFD (± 0,01% CAP) bis Woche 38 des Alters.
   HINWEIS: CAP ist ein Agonist von TRPV1-Kanalprotein, ausgedrückt in Fettgeweben ^{11 , 17} . Mischen Sie CAP mit HFD in einem Mixer in der Kapuze und übertragen Sie die gemischte Mischung in ein Tablett mit kleinen 1 in ² Trennwänden. Halten Sie das Tablett in einem -20 ° C Gefrierschrank. Entfernen Sie das Tablett mit der HFD + CAP Diät aus dem Gefrierschrank nach 24 h und lagern Sie in einem Behälter bei -20 &# 176; C Gefrierschrank bis zum Gebrauch.
2. Hausmäuse in einer klimatisierten Umgebung (22,8 ± 2,0 ° C, 45 - 50% Feuchtigkeit) mit einem 12/12-Licht / Dunkel-Zyklus mit Zugang zu ausgewiesener Diät und Wasser ad libitum .
3. Am Ende von 38 Wochen, sezernden adinösen Fettgewebe und Verwendung für Lipolyse-Experimente (Abschnitte 2-7).

2. Vorbereitung von Mäusen für die Experimente

1. Anästhesieren von Mäusen durch Injektion von Ketamin und Xylazin-Gemisch (10 mg / kg bzw. 80 mg / kg Körpergewicht). Injektion von 0,01 ml der Mischung / 10 g Körpergewicht der Maus.
2. Bestätige tiefe Anästhesie durch eine feste Zehenkneife. Wenn es einen Pedalreflex gibt, teste die Maus nach mindestens 30 s erneut.
3. Verwenden Sie Tierarzneimittel, um die Trockenheit der Augen während der Anästhesie zu verhindern. Verlassen Sie Mäuse nicht unbeaufsichtigt während eines der Verfahren.
4. Euthanisieren von Mäusen durch Einspritzen einer hohen Dosis Ketamin- und Xylazin-Gemischinjektion (10 mg / kg bzw. 80 mg / kg Körpergewicht)E (0,01 ml / 10 g Körpergewicht) gefolgt von Zervixversetzung.
   ANMERKUNG: Diese Methode der Sterbehilfe wird vom IACUC der Universität Wyoming genehmigt.

3. Isolierung von Inguinal Adipose Fat Pads

1. Legen Sie die Maus (mit NCD oder HFD (± CAP) für 32 Wochen) liegen auf der linken Seite für die Prozedur.
   HINWEIS: Wenn du die Maus auf die linke Seite legst, wird der linke Vorder- und linke Hinterbein auf der Sektionsplattform stehen, während der rechte Vorsprung und der rechte Hinterbein von der Plattform abgewandt werden.
2. Sterilisieren Sie die Hautoberfläche mit einem 2-Zoll- ^2- Gaze-Pad, das in etwa 2,5 ml 70% Ethanol eingeweicht wurde. Machen Sie einen 2 - 3 mm seitlichen Schnitt durch die Haut mit einem Skalpell, um die zugrunde liegende Fettschicht zu zeigen.
3. Machen Sie einen 1 cm Schnitt (abhängig von der Größe der Maus) durch die Haut mit einem Skalpell direkt unter dem Brustkorb über die dorsale Oberfläche verbinden die beiden seitlichen Einschnitte.
4. Schälen Sie die Hautklappe, indem Sie sie sorgfältig ziehenMit steriler Pinzette und lassen Sie die subkutane Auflage intakt, indem Sie nicht die fetten Pads schneiden. Das ist das fette Pad, das unter der Haut liegt.
5. Ziehen Sie das Fett-Pad sorgfältig aus dem zugrunde liegenden Muskel und Faszie mit einer Schere. Ziehen Sie das Fett-Pad, wie es aus dem zugrunde liegenden Muskel geschnitten wird.
   HINWEIS: Das Gewicht und die Größe der Fettpolster hängt von der Art der Mäuse (NCD oder HFD (± CAP) -fed ab).
6. Verwenden Sie eine Pinzette, um sie auf eine Petrischale mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu übertragen, bis die Lipolyse-Experimente bei Raumtemperatur (~ 15 min) durchgeführt wurden.
7. Isoliere die Fettpolster von der rechten Seite der Maus, wie in den Schritten 3.2-3.6 beschrieben.

4. Basal Glycerol Freisetzung von Inguinal Fat Pads

1. Verwenden Sie scharfe Schere, um etwa 20 mg Fettgewebe in 5 bis 8 Stück zu schneiden.
2. Inkubieren Sie die geschnittenen Stücke von Leistenfettkissen in 200 & mgr; l Inkubationsmedium (Dulbecco's Modified Eagel's Medium (DMEM), das 2% Fettsäure enthältFreies Rinderserumalbumin (BSA)) bei 37 ° C, 5% CO ₂ und 95% Feuchtigkeit für 60 min.
   1. Das Inkubationsmedium sammeln und bei -80 ° C für den Lipolyse-Test einfrieren.
      HINWEIS: Die geschnittenen Stücke werden zur Bestimmung der Proteinkonzentration nach der Lipidextraktion verwendet.
   2. Übertragen Sie die geschnittenen Fettstücke mit Hilfe von Pinzetten in 1 ml Extraktionslösung (Chloroform: Methanol (2: 1, v / v) und 1% Eisessig) und inkubieren für 60 min bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln bei 100 ° C Rpm Die Fettabsaugungslösung verwerfen.
      HINWEIS: Dieser Schritt wird Fett aus den Schnittstücken extrahieren. Verwerfe die Fett-Extraktionslösung, da sie die Proteinbestimmung beeinträchtigen wird.
   3. Übertragen Sie das Gewebe (aus Schritt 4.2.2) mit einer Pinzette in ein steriles Mikrofugenröhrchen, das 500 μl Lyse-Lösung (0,3 N NaOH, enthaltend 0,1% Natriumdodecylsulfat, SDS) enthält und über Nacht (12 h) bei 55 ° C unter kräftigem Schütteln inkubieren Bei 100 U / min.
3. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration des Gewebes (Schritt 4.2.3) unter Verwendung des Bicinchoninsäure (BCA) -Reagens und BSA als Standard ¹⁸ .
4. Auftauen des gefrorenen Mediums (Schritt 4.2.1) auf Eis und festzustellen , der Glyceringehalt des Mediums ein freies Glycerin Reagenz wie in Protokoll Abschnitten 6 und 7 beschriebenen ^6.
   1. Extraktion der Konzentration von Glycerin in Proben aus der Standardkurve, die unter Verwendung von Glycerin-Standards ¹⁹ aufgetragen ist, und Expression von Lipolyse als Nanomol-Glycerin pro mg Protein pro h ²⁰ .

5. FSK-stimulierte Lipolyse

1. Präinkubieren Sie etwa 20 mg Leistenfettkissen (5 bis 8 Schnittstücke), erhalten aus NCD- oder HFD (± CAP) -Fett-Wildtyp-Maus in 200 μl DMEM mit 2% fettsäurefreiem BSA, 10 μM FSK und 5 μM Triacsin C an 37 ° C in 5% CO ₂ und 95% Feuchtigkeit für 60 min.
   1. Übertragen Sie die Gewebestücke mit Pinzetten auf ein identisches Medium und inkubieren für weitere 60 min bei 37 ° C, 5% CO ₂ und 95% Feuchtigkeit. Sammle das Inkubationsmedium und lag bei -80 ° C bis zum Lipolyse-Assay.
      HINWEIS: Die Stimulation der Lipolyse bewirkt eine rasche Freisetzung von Fettsäuren und Glycerin innerhalb von 15 min, die während der ersten Stunde linear ist, und Plateaus danach. Da die Rate stimulierter Lipolyse höher und stabiler ist Zeitraum zwischen der ersten und zweiten Stunde der FSK - Stimulation, dieses Protokoll gemessen Lipolyse in dem stimulierten Zustand nach dem zweiten Inkubation , wie zuvor ¹ beschrieben. So sind sowohl die experimentellen Schritte (5.1 und 5.1.1) notwendig.
2. Um Fett aus Leistenfettkissen zu extrahieren, übergeben Sie die geschnittenen Stücke von Leistenfettkissen (erhalten von NCD- oder HFD- (± CAP) -Fed-Mäusen) aus Schritt 5.1 mit Hilfe von Pinzetten in 1 ml Extraktionslösung (Chloroform: Methanol (2 : 1. v /V) und 1% Eisessig) und inkubieren für 60 min bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln bei 100 U / min. Das extrahierte Fett verwerfen.
3. Übertragen Sie das Gewebe (aus Schritt 5.2) mit einer Pinzette in ein steriles Mikrofugenröhrchen, das 500 μl Lyse-Lösung (0,3 N NaOH, enthaltend 0,1% SDS) enthält und über Nacht (12 h) bei 55 ° C unter kräftigem Schütteln bei 100 U / min inkubieren.
4. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration und den Glyceringehalt des Gewebes, wie in den Schritten 4.3 bzw. 4.4 beschrieben.

6. Herstellung des freien Glycerinreagens

1. Das Glycerinreagenz ¹⁹ in 40 ml entionisiertem Wasser in einer bernsteinfarbenen Glasfläschchen rekonstituieren, einen Stopf auf die Durchstechflasche legen und 10 mal mischen. Mischen Sie nicht durch Schütteln.
2. Lagern Sie die Durchstechflasche bei 4 ° C in einem kühlschrank vor Licht, indem Sie die Durchstechflasche vollständig mit Aluminiumfolie abdecken.
3. Weiter zur Vorbereitung des Glycerin-Standards (Abschnitt 7).

7. Vorbereitung des Glycerin-Standards und Bestimmung des Glycerin-Gehalts

1. Machen Sie einen Vorrat von 1 mM durch Verdünnen von 35 & mgr; l des zugeführten Materials mit 65 & mgr; l entionisiertem Wasser.
   ANMERKUNG: Der Hersteller lieferte Glycerin-Standardlager 2,8 mM Glycerin.
2. Nehmen Sie fünf 1-cm-Pfadlänge Einweg-Methacrylat-Küvetten. Markieren Sie die Küvetten mit einem Marker als 0, 1.25, 2.5, 5 und 10 nmol Standard.
3. Füge 0, 1,25, 2,5, 5 und 10 μl 1 mM Glycerin-Standard zu den jeweiligen markierten Küvetten hinzu. Das Volumen jeder Küvette auf 10 μl mit entionisiertem Wasser auffüllen.
4. 1 bis 10 Verdünnung aller Proben (aus Schritt 4.4 oder 5.1.1) durch Zugabe von 10 μl der Probe zu 90 μl deionisiertem Wasser in frische 500 μl prämarkierte Zentrifugenröhrchen herstellen. 10 μl der verdünnten Proben in die mit der jeweiligen Probenidentifikationsnummer markierten Küvetten geben.
5. Schalte das UV-VIS-Spektrophotometer ein und setze die Welle einLänge bis 540 nm.
6. Das freie Glycerinreagenz auf Raumtemperatur erwärmen, indem man die Durchstechflasche (Schritt 6.2) bei Raumtemperatur 15 min lang hält.
7. Stellen Sie eine Reihe von markierten Küvetten als leeren "0" nmol Standard (Schritt 7.3), Standards (Schritt 7.3) und Proben (Schritt 7.4) auf.
8. Fügen Sie 10 μl von jedem der Standard und Probe in die jeweilige markierte Küvette. Verwenden Sie "0" nmol Standard als Leerzeichen.
9. Füge 0,8 ml freies Glycerinreagenz in jede Küvette hinzu, wobei die Glycerin-Standards unter Verwendung einer 1-ml-Pipette enthalten sind.
10. Die Küvette mit einem 1,5 cm quadratischen Plastik-Paraffin-Film bedecken und den Inhalt durch dreimaliges Umkehren der Küvette mischen und 10 min bei Raumtemperatur ablegen.
11. Legen Sie die Küvette in das UV-VIS-Spektrophotometer und notieren Sie die Absorption (540 nm Wellenlänge).
12. Zeichnen Sie die Standardkurve unter Verwendung der Konzentrationen der Standards (nmol) in der X-Achse und der aufgezeichneten Absorption in der Y-Achse.
13. Berechnen Sie die Konzentration von glYcerol in den Proben (nmol) durch Extrapolation unter Verwendung der in Schritt 7.12 aufgetragenen Standardkurve.
14. Multiplizieren Sie die Konzentration der Proben (nmol / Küvette) mit dem Verdünnungsfaktor 10 (siehe Schritt 7.4) und 20 (Gesamtvolumen)
15. Teilen Sie die Konzentration von Glycerin in jeder Probe (Schritt 7.13) durch die nach dem BCA-Verfahren berechnete mg Protein.
    HINWEIS: Da die Leistenfettkissenproben für 60 min inkubiert werden, stellen sie die Ergebnisse als nmol von Glycerin / mg Protein / h dar.

Ergebnisse

Um die Wirkung von CAP auf die basale und stimulierte Lipolyse zu bewerten, wurde in dieser Untersuchung die Lipolyse in Leistenfett-Pads durchgeführt, die aus NCD- oder HFD- (± CAP) -förmigen Wildtyp-Mäusen isoliert wurden. Die repräsentativen Ergebnisse für die Basal- und FSK-stimulierte Lipolyse für die Leistenfett-Pads sind in Tabelle I angegeben . Basal- und FSK-stimulierte Glycerin-Freisetzung in Gegenwart von Triacsin C, die die Acyl-coA-Synthetase hemmt un...

Diskussion

Der Abbauprozess von TGL in Glycerin und Fettsäuren wird durch ATGL ⁹ während der Basallipolyse katalysiert und durch eine Reihe von Proteinen einschließlich der Aktivierung des Adenylylcyclase / PKA-abhängigen Weges während der stimulierten Lipolyse ^{21 , 22 , 23} orchestriert. Verbesserung der Lipolyse erhöht die Plasmaspiegel von Fettsäuren für Transport und Energieverbrauch ^24...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capsaicin	Sigma, USA	M2028	TRPV1 agonist
Forskolin	Sigma, USA	F6886	Adenylyl cyclase activator
DMEM	GE healthcare and life sciences, UT, USA	SH30081.01
High fat diet	Research diets, New Brunswick, USA	D12492	Abbreviated as HFD
Tris	Amresco, USA	O497
Sodium chloride	Thermofisher Scientific	BP358-212
Sodium deoxycholate	Sigma, USA	D6750
Dithiothreitol	Sigma, USA	D9163
Sodium orthovanadate	Sigma, USA	S6508
Protease inhibitor cocktail	Sigma, USA	P8340
Free Glycerol reagent	Sigma USA	F6428
DMSO	Sigma, USA	D8779
Triacsin C	Sigma, USA	T4540	Acyl CoA transferase inhibitor
Bovine serum albumin	Sigma, USA	A7030
Chloroform	Sigma Aldrich	31998-8
Methanol	Thermofisher Scientific, USA	A412-1
Sodium hydroxide	Amresco, USA	O583
Sodium dodecyl sulfate	Sigma, USA	L3371
Bicinchoninic acid reagent	Sigma, USA	BCA1-1KT
UV-VIS Spectrophotometer	Pharmacia Biotech, NJ, USA	Ultrospec 2000
Normal chow diet	Labdiet.com	500I	abreviated as NCD
C57BL/6 mice	Jackson Laboratory, CT, USA	Stock number000664	wild type mice
Parafilm	Heathrow Scientific, USA	HS 234526A
Glycerol standard	Sigma, USA	G7793