Medição da lipólise basal e estimulada por Forskolin em almofadas de gordura adiposa inguinal

Resumo

Este protocolo descreve o método de determinação da lipólise basal e estimulada com forscolina em almofadas de gordura inguinal obtidas a partir de dieta normal (NCD) ou dieta rica em gordura (HFD) ± capsaicina alimentada com camundongos de tipo selvagem. Como índice de lipólise, a libertação de glicerol foi medida a partir de almofadas de gordura adiposa inguinal.

Resumo

A lipólise é um processo pelo qual o lípido armazenado como triglicerídeos em tecidos adiposos é hidrolisado em glicerol e ácidos graxos. Este artigo descreve o método para a medição de lipólise estimulada basal e forscolina (FSK) nas almofadas de gordura inguinal isoladas de camundongos de tipo selvagem alimentados com dieta normal (NCD), dieta com alto teor de gordura (HFD) ou uma dieta rica em gordura contendo 0,01 % De capsaicina (CAP; agonista do subfamília Vanilloid do potencial de receptores transitórios 1 (TRPV1) durante 32 semanas. O método aqui descrito para a realização de lipólise ex vivo é adotado a partir de Schweiger et al. ¹ Apresentamos um protocolo detalhado para medir os níveis de glicerol por espectrofotometria UV-Visível (UV / VIS). O método descrito aqui pode ser usado para isolar com sucesso as almofadas de gordura inguinal para medições de lipólise para obter resultados consistentes. O protocolo descrito para almofadas de gordura inguinal pode prontamente ser ampliado para medir a lipólise em outros tecidos.

Introdução

Os tecidos adiposos armazenam a energia como gordura ² e a oxidação de ácidos gordos é necessária para a termogênese ^{3 , 4} . Os ácidos gordurosos ingeridos através de dietas são embalados juntamente com as apoproteínas em quilomicrons e entregues a diferentes tecidos no corpo através da circulação sanguínea. Embora a maioria das células no corpo armazene uma reserva de energia, o tecido adiposo armazena o excesso de energia como gordura ^{5 , 6} . A lipólise no tecido adiposo é regulada por processos complexos e os detalhes moleculares da lipólise ainda permanecem vagos ⁷ .

A lipólise é um processo pelo qual os triglicerídeos (TGL) armazenados em tecido adiposo são hidrolisados ​​para produzir glicerol e ácidos graxos (FA) pela enzima lipidélio triglicerídeo adiposo (ATGL) ⁸ . As alterações na lipólise basal e estimulada são características da obesidade. O bA lipólise de asal é regulada pela ativação ATGL ⁹ , que converte TGL em diacilglicerol (DAG), que posteriormente é hidrolisado em monoacil glicerol (MAG). A ativação da lipase sensível a hormonas (HSL) via adenilil ciclase ativa a estimulação da proteína quinase A (PKA) dependente da adenosina cíclica (cAMP) e causa lipólise. A medição da lipólise, basal e estimulada, é, portanto, importante analisar a atividade das proteínas envolvidas neste processo. Além disso, desvendar a regulação molecular da lipólise pode ser benéfica para desenvolver novas estratégias terapêuticas contra a obesidade ¹⁰ . Uma vez que, moléculas que estimulam lipólise e oxidação de ácidos gordos são potenciais candidatos para a diminuição de gorduras armazenadas em depósitos, é importante empregar um ensaio robusto para a reprodutibilidade.

Dados anteriormente publicados sugerem que a ativação da proteína TRPV1 expressa em tecido adiposo branco por CAP reforçada basalE FSK (ativador de adenilil ciclase) - lipólise estimulada em almofadas de gordura inguinal ¹¹ . Pesquisas anteriores também sugerem que a ativação a longo prazo de TRPV1 por CAP ativa a PKA ¹² . Uma vez que a ativação da PKA estimula a lipólise ^{13 , 14} , a medição da lipólise estimulada basal e PKA estimulada nas almofadas de gordura inguinal isoladas de ratos NCD ou HFD (± CAP) após 32 semanas de alimentação, as dietas respectivas validarão o papel de TRPV1 Ativação na lipólise.

Este artigo descreve um método eficiente de determinação de lipólise basal e estimulada. Embora outros métodos que empregem isótopos radioativos de glicerol e cromatografia líquida tediosa de alta performance ou cromatografia gasosa / espectrometria de massa para medições ^{15 , 16} estejam disponíveis, esse método oferece um método mais direto, simples e econômicoTécnica para determinar lipólise em tecidos adiposos.

Protocolo

Todos os protocolos seguem as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Wyoming.

1. Alojamento e alimentação de animais

NOTA: Os ratos adultos de tipo selvagem masculino (C57BL / 6) (idade 12 a 24 semanas) foram criados na unidade animal de pesquisa de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidados Institucionais (IACUC).

1. A partir da semana 6 da idade, os ratos domésticos em grupos de quatro em gaiolas separadas e atribuí-los aleatoriamente em grupos de alimentação de NCD ou HFD (± 0,01% CAP) até a semana 38 de idade.
   NOTA: CAP é um agonista da proteína do canal TRPV1 expresso em tecidos adiposos ^{11 , 17} . Misture o PAC com HFD em um liquidificador dentro do capô e transfira a mistura misturada para uma bandeja contendo pequenas unidades de 1 em ² . Mantenha a bandeja dentro de um congelador de -20 ° C. Remova a bandeja contendo a dieta HFD + CAP do congelador após 24 h e guarde em um recipiente a -20 &# 176; congelador C até o uso.
2. Ratinhos de casa em um ambiente controlado pelo clima (22,8 ± 2,0 ° C, 45 - 50% de umidade) com um ciclo de 12/12 luz / escuridão com acesso a dieta designada e água ad libitum .
3. No final de 38 semanas, dissecar tecidos adiposos inguinais e usar para experiências de lipólise (seções 2-7).

2. Preparando ratos para as experiências

1. Anestesiar ratinhos injetando mistura de ketamina e xilazina (10 mg / kg e 80 mg / kg de peso corporal, respectivamente). Injetar 0,01 mL da mistura / 10 g de peso corporal do mouse.
2. Confirme a anestesia profunda por uma prega firme. Se houver um reflexo do pedal, teste o mouse novamente após pelo menos 30 s.
3. Use uma pomada de olho veterinário para evitar a secura dos olhos durante a anestesia. Não deixe ratos sem vigilância durante nenhum dos procedimentos.
4. Eutanizar camundongos injetando uma dose elevada de mistura de ketamina e mistura de xilazina (10 mg / kg e 80 mg / kg de peso corporal, respectivamente)E (0,01 ml / 10 g de peso corporal) seguido de deslocamento cervical.
   NOTA: Este método de eutanásia é aprovado pela IACUC da Universidade de Wyoming.

3. Isolamento de almofadas de gordura adiposa inguinal

1. Coloque o mouse (alimentado com NCD ou HFD (± CAP) por 32 semanas) deitado à esquerda para o procedimento.
   NOTA: Ao colocar o mouse no lado esquerdo, o membro anterior esquerdo e o membro traseiro esquerdo estarão na plataforma de dissecação, enquanto o membro dianteiro direito e o membro traseiro direito ficarão afastados da plataforma.
2. Esterilizar a superfície da pele com uma almofada de 2 polegadas de ² gazes embebidas em cerca de 2,5 mL de etanol a 70%. Faça um corte lateral de 2 a 3 mm através da pele usando um bisturi para revelar a camada gordurosa subjacente.
3. Faça um corte de 1 cm (dependendo do tamanho do mouse) através da pele usando um bisturi logo abaixo da caixa torácica através da superfície dorsal juntando as duas incisões laterais.
4. Retire a aba da pele arrastando-a cuidadosamenteUsando fórceps estéril e deixa a almofada subcutânea intacta ao não cortar as almofadas de gordura. Esta é a almofada gorda situada debaixo da pele.
5. Disseca cuidadosamente a almofada de gordura do músculo subjacente e da fáscia usando um par de tesouras. Puxe a almofada gorda à medida que é cortada do músculo subjacente.
   NOTA: O peso e o tamanho das almofadas de gordura dependem do tipo de camundongos (NCD ou HFD (± CAP) -fed).
6. Use pinças para transferi-lo para uma placa de Petri contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS) até a experiência de lipólise, à temperatura ambiente (~ 15 min).
7. Aqueça as almofadas de gordura do lado direito do mouse conforme descrito nos passos 3.2-3.6.

4. Liberação basal de glicerol das almofadas de gordura inguinal

1. Use tesoura afiada para cortar cerca de 20 mg de tecido adiposo em 5 a 8 peças.
2. Incubar as peças cortadas de almofadas de gordura inguinal em 200 μL de meio de incubação (Dulbecco's Model Eagel's Medium (DMEM) contendo 2% de ácido gordoAlbumina de soro bovino livre (BSA)) a 37 ° C, 5% de CO ₂ e 95% de humidade durante 60 min.
   1. Recolher o meio de incubação e congelar a -80 ° C para ensaio de lipólise.
      NOTA: As peças cortadas são usadas para a determinação da concentração de proteína após a extração de lipídios.
   2. Transfira as peças de gordura cortada com a ajuda de pinças para 1 mL de solução de extração (clorofórmio: metanol (2: 1, v / v) e 1% de ácido acético glacial) e incubar durante 60 minutos a 37 ° C sob agitação vigorosa a 100 Rpm. Descarte a solução de extração de gordura.
      NOTA: Esta etapa extrairá gordura das peças cortadas. Descarte a solução de extração de gordura, pois interferirá com a determinação da proteína.
   3. Transferir o tecido (a partir do passo 4.2.2) usando uma pinça num tubo de microcentrífuga estéril contendo 500 μL de solução de lise (0,3 N de NaOH contendo 0,1% de dodecilsulfato de sódio SDS) e incubar durante a noite (12 h) a 55 ° C sob agitação vigorosa A 100 rpm.
3. Determine a concentração de proteína do tecido (passo 4.2.3) usando o reagente do ácido bicinconinico (BCA) e BSA como padrão ¹⁸ .
4. Descongelar o meio congelado (passo 4.2.1) no gelo e determinar o teor de glicerol do meio utilizando um reagente de glicerol livre conforme descrito nas secções de protocolo 6 e 7 ⁶ .
   1. Extrapolar a concentração de glicerol em amostras da curva padrão plotada usando padrões de glicerol ¹⁹ e lipólise expressa como nanomoles de glicerol por mg de proteína por h ²⁰ .

5. Lipólise estimulada por FSK

1. Pré-incuba cerca de 20 mg de almofada de gordura inguinal (5 a 8 partes cortadas) obtidas a partir de NCD ou HFD (± CAP) - rato selvagem de tipo selvagem em 200 μL de DMEM contendo 2% de BSA livre de ácidos graxos, 10 μM de FSK e 5 μM de Triacsina C em 37 ° C em 5% de CO ₂ e 95% de umidade durante 60 min.
   1. Transfira as peças de tecido usando pinças para um meio idêntico e incube por mais 60 min a 37 ° C, 5% de CO ₂ e 95% de umidade. Recolher o meio de incubação e armazenar a -80 ° C até o ensaio de lipólise.
      NOTA: A estimulação da lipólise provoca a liberação rápida de ácidos gordurosos e glicerol dentro de 15 minutos, que é linear durante a primeira hora, e planaltos a partir daí. Uma vez que a taxa de lipólise estimulada é maior e estável entre a primeira e segunda horas de estimulação com FSK, este protocolo mediu a lipólise no estado estimulado após o segundo período de incubação como descrito anteriormente ¹ . Então, as etapas experimentais (5.1 e 5.1.1) são necessárias.
2. Para extrair a gordura das almofadas de gordura inguinal, transfira as peças cortadas de almofadas de gordura inguinal (obtidas a partir de ratos NCD ou HFD (± CAP) do passo 5.1 com a ajuda de pinças em 1 mL de solução de extração (clorofórmio: metanol (2 : 1. v /V) e 1% de ácido acético glacial) e incubar durante 60 min a 37 ° C sob agitação vigorosa a 100 rpm. Descarte a gordura extraída.
3. Transfira o tecido (do passo 5.2) usando pinças para um tubo de microcentrífuga estéril contendo 500 μL de solução de lise (0,3N de NaOH contendo 0,1% de SDS) e incube durante a noite (12 h) a 55 ° C sob agitação vigorosa a 100 rpm.
4. Determine a concentração de proteína e o teor de glicerol do tecido como descrito nos passos 4.3 e 4.4, respectivamente.

6. Preparação do Reagente Gratuito de Glicerol

1. Reconstitua o reagente de glicerol ¹⁹ em 40 mL de água desionizada em um frasco de vidro colorido âmbar, coloque uma rolha no frasco e misture bem invadindo 10 vezes. Não misture agitando.
2. Armazene o frasco para injectáveis ​​a 4 ° C dentro de um frigorífico protegido da luz, cobrindo o frasco completamente com papel alumínio.
3. Proceda à preparação do padrão de glicerol (seção 7).

7. Preparação do padrão de glicerol e determinação do teor de glicerol

1. Faça um estoque de 1 mM diluindo 35 μL do estoque fornecido com 65 μL de água desionizada.
   NOTA: O estoque padrão de glicerina fornecido pelo fabricante é 2,8 mM de glicerol.
2. Pegue cinco cubetas descartáveis ​​de metacrilato de 1 cm de comprimento de caminho. Rotule as cuvetes usando um marcador como padrão 0, 1.25, 2.5, 5 e 10 nmol.
3. Adicione 0, 1,25, 2,5, 5 e 10 μL de padrão de glicerol 1 mM às respectivas cuvetes rotuladas. Faça o volume de cada cuvete para 10 μL com água desionizada.
4. Faça uma diluição de 1 a 10 de todas as amostras (do passo 4.4 ou 5.1.1), adicionando 10 μL da amostra a 90 μL de água desionizada em tubos de centrífuga pré -tiquetados frescos de 500 μL. Adicione 10 μL das amostras diluídas nas cubetas rotuladas com o respectivo número de identificação da amostra.
5. Ligar o espectrofotômetro UV-VIS e ajustar a ondaComprimento até 540 nm.
6. Aquecer o reagente de glicerol livre até à temperatura ambiente, mantendo o frasco (passo 6.2) à temperatura ambiente durante 15 min.
7. Configure uma série de cuvetes rotulados como padrão de nmol "0" em branco (passo 7.3), padrões (etapa 7.3) e amostras (passo 7.4).
8. Adicione 10 μL de cada padrão e amostra na respectiva cuvete rotulada. Use "0" nmol padrão como em branco.
9. Adicione 0,8 mL de reagente de glicerol livre em cada cuvete, contendo os padrões de glicerol usando uma pipeta de 1 mL.
10. Cubra a cuvete com uma película de parafina de plástico quadrada de 1,5 cm e misture o conteúdo invadindo a cuvete por 3 vezes e reserve à temperatura ambiente por 10 min.
11. Coloque a cuvete no espectrofotômetro UV-VIS e grave a absorvância (comprimento de onda de 540 nm).
12. Trace a curva padrão usando as concentrações dos padrões (nmol) no eixo X e a absorvância registrada no eixo Y.
13. Calcule a concentração de glYcerol nas amostras (nmol) por extrapolação usando a curva padrão plotada no passo 7.12.
14. Multiplique a concentração de amostras (nmol / cuvete) com o fator de diluição 10 (consulte o passo 7.4) e 20 (volume total)
15. Divida a concentração de glicerol em cada amostra (passo 7.13) pelo mg de proteína calculado pelo método BCA.
    NOTA: Uma vez que as amostras da almofada de gordura inguinal são incubadas durante 60 min, representam os resultados como nmol de glicerol / mg de proteína / h.

Resultados

Para avaliar o efeito da CAP sobre lipólise basal e estimulada, esta pesquisa mediu a lipólise em almofadas de gordura adiposa inguinal isoladas de camundongos selvagens de NCD ou HFD (± CAP). Os resultados representativos para a lipólise basal e estimulada por FSK para as almofadas de gordura inguinal são apresentados na Tabela I. Liberação de glicerol estimulada basal e FSK na presença de Triacsina C, que inibe a acil coA sintetase e evita a regeneração de TG...

Discussão

O processo de degradação de TGL em glicerol e ácidos graxos é catalisado por ATGL ⁹ durante a lipólise basal e orquestrado por uma série de proteínas, incluindo a ativação da via adenilil ciclase / dependente de PKA durante a lipólise estimulada ^{21 , 22 , 23} . O aprimoramento da lipólise aumenta os níveis plasmáticos de ácidos graxos para transporte e uso de energia ²⁴

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capsaicin	Sigma, USA	M2028	TRPV1 agonist
Forskolin	Sigma, USA	F6886	Adenylyl cyclase activator
DMEM	GE healthcare and life sciences, UT, USA	SH30081.01
High fat diet	Research diets, New Brunswick, USA	D12492	Abbreviated as HFD
Tris	Amresco, USA	O497
Sodium chloride	Thermofisher Scientific	BP358-212
Sodium deoxycholate	Sigma, USA	D6750
Dithiothreitol	Sigma, USA	D9163
Sodium orthovanadate	Sigma, USA	S6508
Protease inhibitor cocktail	Sigma, USA	P8340
Free Glycerol reagent	Sigma USA	F6428
DMSO	Sigma, USA	D8779
Triacsin C	Sigma, USA	T4540	Acyl CoA transferase inhibitor
Bovine serum albumin	Sigma, USA	A7030
Chloroform	Sigma Aldrich	31998-8
Methanol	Thermofisher Scientific, USA	A412-1
Sodium hydroxide	Amresco, USA	O583
Sodium dodecyl sulfate	Sigma, USA	L3371
Bicinchoninic acid reagent	Sigma, USA	BCA1-1KT
UV-VIS Spectrophotometer	Pharmacia Biotech, NJ, USA	Ultrospec 2000
Normal chow diet	Labdiet.com	500I	abreviated as NCD
C57BL/6 mice	Jackson Laboratory, CT, USA	Stock number000664	wild type mice
Parafilm	Heathrow Scientific, USA	HS 234526A
Glycerol standard	Sigma, USA	G7793