사타구니 지방 지방 패드에서 기저 및 포스 콜린 자극 된 지방 분해의 측정

요약

이 프로토콜은 일반식이 다이어트 (NCD) 또는 고지 방식 (HFD) ± 캡사이신 야생 동물 먹이에서 얻은 사타구니 지방 패드에서 기초 및 forskolin - 자극 lipolysis를 결정하는 방법을 설명합니다. 지방 분해 지수는 사타구니 지방 지방 패드에서 글리세롤 방출을 측정했습니다.

초록

지방 분해는 지방 조직에 트리글리 세라이드로 저장된 지질을 글리세롤과 지방산으로 가수 분해하는 과정입니다. 이 기사에서는 정상적인식이 요법 (NCD), 고지방식이 요법 (HFD) 또는 0.01을 포함하는 고지식식이 요법을받은 야생형 마우스에서 격리 된 사타구니 지방 패드에서 basal and forskolin (FSK) - 자극 된 지방 분해 측정 방법을 설명합니다 capsaicin (CAP; 일시적인 수용체 잠재 성 vanilloid subfamily 1 (TRPV1) agonist)을 32 주간 투여 하였다. 체외 지방 분해를 수행하기 위해 여기에 기술 된 방법은 Schweiger et al. ¹ UV-Visible (UV / Vis) 분광 광도계로 글리세롤 농도를 측정하기위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 여기에 설명 된 방법은 일관된 결과를 얻기 위해 지질 분해 측정을 위해 사타구니 지방 패드를 성공적으로 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 사타구니 지방 패드에 설명 된 프로토콜을 다른 조직에서 지방 분해를 측정하기 위해 쉽게 확장 할 수 있습니다.

서문

지방 조직은 에너지를 지방 ² 로 저장하고 지방산 산화는 열 생성 ^{3 , 4에} 필요합니다. 다이어트를 통해 섭취 된 지방산은 아포 단백질과 함께 키로 마이크론으로 포장되어 혈액 순환을 통해 신체의 다른 조직으로 전달됩니다. 신체의 대부분의 세포가 에너지를 저장하지만, 지방 조직은 과도한 에너지를 지방으로 저장합니다 ^{5 , 6} . 지방 조직에서 지방 분해는 복잡한 프로세스에 의해 규제되고 지방 분해의 분자 세부 사항은 아직 ⁷ 모호한 남아있다.

지방 분해는 지방 조직에 저장된 트리글리 세라이드 (TGL)를 가수 분해하여 효소 지방 트리글리세리드 리파아제 (ATGL) ^8에 의해 글리세롤 및 지방산 (FA)을 생산하는 과정입니다. 기저 및 자극 된 지방 분해의 변형은 비만의 특징입니다. The basal lipolysis는 TGL을 diacylglycerol (DAG)로 전환시키는 ATGL 활성화 ^9에 의해 조절되며,이어서 DAG가 monoacyl glycerol (MAG)로 가수 분해됩니다. adenylyl cyclase 를 통한 호르몬 민감성 lipase (HSL)의 활성화는 cyclic adenosine monophosphate (cAMP) 의존성 protein kinase A (PKA) 자극을 활성화시키고 지방 분해를 일으킨다. 따라서, 지방 분해, 기초 및 자극의 측정은이 과정에 관여하는 단백질의 활성을 분석하는 데 중요합니다. 또한, lipolysis의 분자 조절을 풀어 비만 ¹⁰ 새로운 치료 전략을 개발하는 것이 유리할 수 있습니다. 지방 분해와 지방산 산화를 자극하는 분자는 저장소에 저장된 지방을 감소시키는 잠재적 인 후보이므로, 재현성에 대한 견고한 분석을 이용하는 것이 중요합니다.

이전에 발표 된 데이터는 CAP에 의해 백색 지방 조직에서 발현 된 TRPV1 단백질의 활성화가 기저부 강화및 사타구니 지방 패드에 FSK (adenylyl cyclase 활성제) 자극 lipolysis ¹¹ . 이전의 연구는 또한 CAP에 의한 TRPV1의 장기간 활성화가 PKA ^12를 활성화 시킨다는 것을 제안한다. PKA의 활성화가 lipolysis ^{13 , 14를} 자극하기 때문에 NBC 또는 HFD (± CAP)가 투여 된 사료에서 32 주 후에 각 사료를 먹인 사타구니 지방 패드에서 기초 및 PKA 의존성 지방 분해를 측정 한 결과 TRPV1 지방 분해의 활성화.

이 기사는 기저 및 자극 지방 분해를 결정하는 효율적인 방법을 설명합니다. 글리세롤 지루한 고성능 액체 크로마토 그래피 측정 또는 ^{(15, 16)를 사용할} 수있는 용 기체 크로마토 그래피 / 질량 분석기의 방사성 동위 원소를 이용하는 다른 방법이 있지만,이 방법은 더 직접적 간단하고 비용 효율적인 제공지방 조직에서의 지방 분해를 측정하는 기술.

프로토콜

모든 프로토콜은 와이오밍 대학교의 동물 관리 지침을 따릅니다.

1. 동물 주거 및 수유

참고 : 동물계 야생 동물 (C57BL / 6) (12 ~ 24 주령)은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 승인 프로토콜에 따라 연구 동물 시설에서 자란다.

1. 6 주부터 시작하여 4 마리의 그룹으로 된 쥐를 별도의 우리에 넣고 38 주까지 NCD 또는 HFD (+ 0.01 % CAP)의 수유 그룹에 무작위로 할당합니다.
   참고 : CAP는 지방 조직 ^{11 , 17} 에서 발현되는 TRPV1 채널 단백질의 작용제입니다. 후드 내부의 믹서기에서 HFD와 CAP를 섞은 다음 혼합 된 혼합물을 작은 1 / ² 파티션이있는 트레이로 옮깁니다. 트레이를 -20 ° C의 냉동고 안에 보관하십시오. 24 시간 후 냉동실에서 HFD + CAP식이가 들어있는 트레이를 꺼내어 -20 &사용하기 전까지 # 176; C 냉동고.
2. 지정된식이 요법과 물을 자유롭게 섭취 할 수있는 12 / 12-light / dark cycle의 기후 조절 환경 (22.8 ± 2.0 ° C, 45 - 50 % 습도)의 하우스 마우스.
3. 38 주가 끝날 때 사타구니 지방 조직을 해부하고 지방 분해 실험에 사용합니다 (2-7 절).

2. 실험용 마우스 준비

1. ketamine과 xylazine 혼합물 (각각 10 ㎎ / ㎏ 및 80 ㎎ / kg 체중)을 주사하여 쥐를 마취시킨다. 혼합물 0.01 mL / 마우스 10 g을 주입하십시오.
2. 단단한 발가락으로 깊은 마취를 확인하십시오. 페달 반사가 있으면 적어도 30 초 후에 마우스를 다시 테스트하십시오.
3. 마취 중 눈의 건조를 방지하기 위해 수의사 용 연고를 사용하십시오. 어떤 과정에서도 마우스를 방치하지 마십시오.
4. 케타민 및 자일 라진 혼합 주사 (각각 10 mg / kg 및 80 mg / kg 체중)의 높은 용량을 주입하여 마우스를 안락사하십시오.e (0.01 ml / 10 g 체중)로 자궁 경부 탈구를 시행 하였다.
   참고 :이 안락사 방법은 와이오밍 대학교 IACUC의 승인을 받았습니다.

3. 사타구니 지방 지방 패드의 격리

1. 절차를 위해 왼쪽에 놓인 마우스 (NCD 또는 HFD (± CAP)를 32 주 동안 먹임)를 놓습니다.
   참고 : 마우스를 왼쪽에 놓으면 왼쪽 forelimb와 왼쪽 hindlimb가 해부 플랫폼에 있고 오른쪽 forelimb와 오른쪽 hindlimb는 플랫폼에서 멀어집니다.
2. 약 2.5 mL의 70 % 에탄올에 담근 2 인치 ² 거즈 패드로 피부 표면을 소독하십시오. 밑에있는 지방층을 드러내 기 위해 메스를 사용하여 피부를 2 - 3 mm 측면 절단하십시오.
3. 두 측면 incisions을 합치면 등면에 걸쳐 갈비뼈 케이지 바로 아래 메스를 사용하여 피부를 통해 1cm 잘라 내기 (마우스의 크기에 따라) 확인하십시오.
4. 피부 뚜껑을 조심스럽게 떼어서 껍질을 벗기십시오.살균 포셉을 사용하고 지방 패드를 절단하지 않고 그대로 피하 패드를 남겨주세요. 이것은 피부 아래에있는 뚱뚱한 패드입니다.
5. 가위를 사용하여 아래 근육과 근막에서 조심스럽게 지방 패드를 해부하십시오. 그것이 기본 근육에서 잘라 지방 패드를 당겨.
   참고 : 뚱뚱한 패드의 무게와 크기는 쥐의 유형에 따라 다릅니다 (NCD 또는 HFD (± CAP) -fed).
6. 지방 제거 실험까지 실온 (~ 15 분)까지 인산 완충 식염수 (PBS)가 들어있는 페트리 접시에 핀셋을 사용하여 옮깁니다.
7. 3.2-3.6 단계에서 설명한대로 마우스의 오른쪽에서 지방 패드를 분리합니다.

4. 사타구니 지방으로부터의 기초 글리세롤 방출

1. 날카로운 가위로 약 20mg의 지방 조직을 5-8 개로 자릅니다.
2. 배양 배지 (2 % 지방산을 포함하는 Dulbecco의 수정 Eagel의 매체 (DMEM)의 200 μL에 사타구니 지방 패드의 절단 조각을 품어37 ℃, 5 % CO ₂ 및 95 % 습도에서 60 분 동안 무균 소 혈청 알부민 (BSA)으로 처리 하였다.
   1. 부화 배지를 수집하고 lipolysis 분석을 위해 -80 ° C에서 동결.
      참고 : 잘라 조각은 지질 추출 후 단백질 농도의 결정에 사용됩니다.
   2. 추출 용액 (클로로포름 : 메탄올 (2 : 1, v / v) 및 1 % 빙초산) 1 mL에 핀셋을 사용하여 잘라 낸 지방 조각을 옮기고 37 ℃에서 60 분 동안 항온 배양 한 후 100 ℃에서 격렬한 동요 rpm. 지방 추출 용액을 버린다.
      참고 :이 단계는 절단 조각에서 지방을 추출합니다. 지방 추출 용액은 단백질 결정을 방해하므로 폐기하십시오.
   3. 500 μL의 용해 용액 (0.1 % 나트륨 도데 실 설페이트가 포함 된 0.3 N NaOH; SDS)이 들어있는 살균 된 미세 튜브에 핀셋을 사용하여 (4.2.2 단계에서) 조직을 옮기고 55 ° C에서 밤새도록 배양합니다 (12 시간). 100 rpm에서.
3. 조직 (단계 4.2.3) 표준으로서 ¹⁸ bicinchoninic 산 (BCA) 시약 및 BSA를 사용하여 단백질 농도를 결정한다.
4. 얼음 냉동 매질 (단계 4.2)에 녹여 프로토콜 부 (6, 7) ^(6)에 기재된 바와 같이 자유 글리세롤 시약을 사용하여 매체의 글리세롤 함량을 결정한다.
   1. 글리세롤 표준 ^19을 사용하여 플로팅 된 표준 곡선에서 샘플의 글리세롤 농도를 외삽하고 ²⁰ 분당 단백질 당 나노 몰 글리세롤로 지방 분해를 나타냅니다.

5. FSK- 자극 된 지방 분해

1. 2 % 지방산이없는 BSA, 10 μM FSK 및 5 μM Triacsin C가 함유 된 200 μL DMEM에 NCD 또는 HFD (± CAP)가 투여 된 야생형 마우스에서 얻은 사타구니 지방 패드 (5 ~ 8 조각) 약 20 mg을 사전 인큐베이션 37 ℃ 5 % CO ₂ 및 95 % 습도에서 60 분.
   1. 37 ° C, 5 % CO ₂ 및 95 % 습도에서 추가 60 분 동안 동일한 배지 및 부화로 핀셋을 사용하여 조직 조각을 전송합니다. lipolysis 분석 때까지 incubation 매체와 상점을 -80 ° C에서 수집하십시오.
      참고 : 지방 분해의 자극은 지방산과 글리세롤의 빠른 방출을 15 분 이내에 일으키며, 처음 1 시간 동안 선형이며 이후 평지가됩니다. 자극 지질 분해 속도는 FSK 자극의 제 1 및 제 2 시간 사이에서 더 안정하기 때문에 이전에 ^한 바와 같이, 자극 된 상태에서이 프로토콜 측정 지질 분해 제 잠복기 다음. 따라서 실험 단계 (5.1 및 5.1.1)가 모두 필요합니다.
2. 사타구니 지방 패드에서 지방을 추출하려면 추출 용액 (클로로포름 : 메탄올 (2) 1 mL)에 핀셋을 사용하여 단계 5.1의 사타구니 지방 패드 (NCD 또는 HFD (± CAP) : 1. v /v)와 1 % glacial acetic acid)에 넣고 100 rpm으로 격렬하게 흔들어 주면서 37 ℃에서 60 분간 배양한다. 추출 된 지방을 버립니다.
3. 100 μl에서 격렬하게 흔들어 55 ° C에서 하룻밤 (12 H) 품어과 용해 솔루션 (0.1 N SDS 함유) 용해 액 500 μL를 포함하는 멸균 microfuge 튜브에 핀셋을 사용하여 (단계 5.2에서) 조직을 전송합니다.
4. 단계 4.3 및 4.4에 각각 설명 된대로 조직의 단백질 농도와 글리세롤 함량을 결정합니다.

6. 유리 글리세롤 시약의 제조

1. 앰버 색 유리 병에 40mL의 탈 이온수에 글리세롤 시약 ¹⁹ 를 넣고 바이알에 마개를 놓고 10 번 뒤집어서 잘 섞는다. 흔들어서 섞지 마십시오.
2. 유리 병을 알루미늄 호일로 완전히 덮어서 빛으로부터 보호되는 냉장고 안에 4 ℃에서 보관하십시오.
3. 글리세롤 표준 준비 (섹션 7).

7. 글리세롤 표준의 제조 및 글리세롤 함량의 결정

1. 공급 된 물질 35 μL를 탈 이온수 65 μL로 희석하여 1 mM의 원료를 만드십시오.
   참고 : 제조사가 공급 한 글리세롤 표준 원액은 2.8 mM 글리세롤입니다.
2. 1cm 길이의 일회용 메타 크릴 레이트 큐벳 5 개를 가져갑니다. 0, 1.25, 2.5, 5 및 10 nmol 표준으로 마커를 사용하여 큐벳에 라벨을 붙이십시오.
3. 각각의 표시된 cuvettes에 1mM 글리세롤 표준의 0, 1.25, 2.5, 5 및 10μL를 추가합니다. 탈 이온수로 각 큐벳의 부피를 10 μL로 만듭니다.
4. 신선한 500 - μL prelabel 원심 튜브에 탈 이온수 90 μL에 샘플 10 μL를 추가하여 모든 시료 (단계 4.4 또는 5.1.1에서)를 1에서 10 희석합니다. 묽게 한 견본의 10μL를 각각 견본 ID 수로 레테르를 붙인 cuvettes로 추가하십시오.
5. UV-VIS 분광 광도계를 켜고 물결을 설정합니다.길이는 540nm입니다.
6. 바이알 (단계 6.2)을 실온에서 15 분간 유지하여 유리 글리세롤 시약을 실온으로 가온시킨다.
7. 일련의 표지 된 큐벳을 빈 "0"nmol 표준 (7.3 단계), 표준 (7.3 단계) 및 시료 (7.4 단계)로 설정하십시오.
8. 표준 및 시료 각각 10 μL를 해당 레이블이 표시된 큐벳에 넣으십시오. "0"nmol 표준을 공란으로 사용하십시오.
9. 1 ML 피펫을 사용하여 글리세롤 표준을 포함하는 각 큐벳에 무료 글리세롤 시약 0.8 ML을 추가합니다.
10. 큐벳을 1.5 cm 정사각형 플라스틱 파라핀 필름으로 덮고 큐벳을 3 회 뒤집어 내용물을 혼합하고 실온에서 10 분간 정치합니다.
11. UV-VIS 분광 광도계에 큐벳을 놓고 흡광도 (540 nm 파장)를 기록합니다.
12. X 축의 기준 농도 (nmol)와 Y 축의 기록 흡광도를 사용하여 표준 곡선을 플롯합니다.
13. gl 농도를 계산하십시오.(7.12)에서 플롯 한 표준 곡선을 사용하여 외삽 법에 의해 샘플 (nmol)에서 결정 하였다.
14. 희석 배수 10 (단계 7.4 참조) 및 20 (총량)으로 시료 농도 (nmol / cuvette)를 곱합니다.
15. BCA 방법으로 계산 된 단백질 mg에 의해 각 시료 (단계 7.13)의 글리세롤 농도를 나눕니다.
    참고 : 사타구니 지방 패드 샘플은 60 분 incubated 때문에, 글리세롤 / mg 단백질 / h의 nmol로 결과를 나타냅니다.

결과

기초 및 자극 lipolysis에 대한 CAP의 효과를 평가하기 위해,이 연구는 NCD 또는 HFD (± CAP)가 투여 된 야생형 마우스로부터 격리 된 사타구니 지방 지방 패드에서 지방 분해를 측정했습니다. 사타구니 지방 패드에 대한 기초 및 FSK 자극 lipolysis에 대한 대표 결과는 표 1 에 나와 있습니다. 아실 CoA 신테 타제를 억제하고 TGL의 재생을 방지하는 Triacsin C의 ?...

토론

글리세롤과 지방산으로의 TGL 분해 과정은 기저 지방 분해 동안 ATGL ^9에 의해 촉매되고 자극 된 지방 분해 동안 아데 닐릴 사이 클라 제 / PKA 의존 경로의 활성화를 포함하는 단백질 어레이에 의해 조율된다 ^{21 , 22 , 23} . 지방 분해의 향상은 교통 및 에너지 사용량 ²⁴ 지방산의 혈장 수준을 증가?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capsaicin	Sigma, USA	M2028	TRPV1 agonist
Forskolin	Sigma, USA	F6886	Adenylyl cyclase activator
DMEM	GE healthcare and life sciences, UT, USA	SH30081.01
High fat diet	Research diets, New Brunswick, USA	D12492	Abbreviated as HFD
Tris	Amresco, USA	O497
Sodium chloride	Thermofisher Scientific	BP358-212
Sodium deoxycholate	Sigma, USA	D6750
Dithiothreitol	Sigma, USA	D9163
Sodium orthovanadate	Sigma, USA	S6508
Protease inhibitor cocktail	Sigma, USA	P8340
Free Glycerol reagent	Sigma USA	F6428
DMSO	Sigma, USA	D8779
Triacsin C	Sigma, USA	T4540	Acyl CoA transferase inhibitor
Bovine serum albumin	Sigma, USA	A7030
Chloroform	Sigma Aldrich	31998-8
Methanol	Thermofisher Scientific, USA	A412-1
Sodium hydroxide	Amresco, USA	O583
Sodium dodecyl sulfate	Sigma, USA	L3371
Bicinchoninic acid reagent	Sigma, USA	BCA1-1KT
UV-VIS Spectrophotometer	Pharmacia Biotech, NJ, USA	Ultrospec 2000
Normal chow diet	Labdiet.com	500I	abreviated as NCD
C57BL/6 mice	Jackson Laboratory, CT, USA	Stock number000664	wild type mice
Parafilm	Heathrow Scientific, USA	HS 234526A
Glycerol standard	Sigma, USA	G7793