Измерение базального и форсколин-стимулированного липолиза в паховых жировых жировых подушечках

Резюме

В этом протоколе описывается метод определения базального и форсколин-стимулированного липолиза в паховых жировых подушечках, полученных из обычной диеты для чау-чау (NCD) или диеты с высоким содержанием жиров (HFD) - капсаицина, кормящих мышей дикого типа. В качестве показателя для липолиза высвобождение глицерина измеряли из пастиковых жировых подушечек.

Аннотация

Липолиз представляет собой процесс, посредством которого липид, хранящийся в виде триглицеридов в жировых тканях, гидролизуется в глицерин и жирные кислоты. В этой статье описывается метод измерения базального и форсколинового (FSK) -стимулированного липолиза в паховых жировых подушечках, изолированных от мышей дикого типа, получающих либо нормальную диету чау (NCD), диету с высоким содержанием жиров (HFD), либо диету с высоким содержанием жира, содержащую 0,01 % Капсаицина (CAP, транзиторный рецепторный ванилоидный подсемейство 1 (TRPV1) агонист) в течение 32 недель. Способ, описанный здесь для проведения липолиза ex vivo, принимается Schweiger et al. ¹ Мы представляем подробный протокол для измерения уровня глицерина с помощью спектрофотометрии УФ-видимой (УФ / ВИ). Описанный здесь способ можно использовать для успешной изоляции паховых жировых подушечек для измерений липолиза для получения согласованных результатов. Протокол, описанный для пастиковых жировых прокладок, можно легко расширить, чтобы измерить липолиз в других тканях.

Введение

Жировые ткани хранят энергию, поскольку жир ² и окисление жирных кислот необходимы для термогенеза ^{3 , 4} . Жирные кислоты, проглатываемые через диеты, упаковываются вместе с апопротеинами в хиломикроны и доставляются в различные ткани в организме посредством кровообращения. Хотя большинство клеток в организме сохраняют запас энергии, жировая ткань сохраняет избыточную энергию как жир ^{5 , 6} . Липолиз в жировой ткани регулируется сложными процессами, а молекулярные детали липолиза все еще остаются неопределенными ⁷ .

Липолиз представляет собой процесс, посредством которого триглицериды (TGL), хранящиеся в жировой ткани, гидролизуются с получением глицерина и жирных кислот (FA) ферментной жировой триглицеридной липазой (ATGL) ⁸ . Изменения в базальном и стимулированном липолизе являются характерной чертой ожирения. БАсальный липолиз регулируют посредством активации ATGL ⁹ , которая превращает TGL в диацилглицерин (DAG), который затем гидролизуется до моноацилглицерина (MAG). Активация чувствительной к гормону липазы (HSL) посредством аденилилциклазы активирует циклическую аденозинмонофосфатную (цАМФ) зависимую протеинкиназу A (PKA) и вызывает липолиз. Поэтому измерение липолиза, базального и стимулированного, важно для анализа активности белков, участвующих в этом процессе. Кроме того, распутывание молекулярной регуляции липолиза может быть полезным для разработки новых терапевтических стратегий против ожирения ¹⁰ . Так как молекулы, которые стимулируют липолиз и окисление жирных кислот, являются потенциальными кандидатами для снижения содержания жира в хранилищах, важно использовать надежный анализ для воспроизводимости.

Ранее опубликованные данные свидетельствуют о том, что активация белка TRPV1, экспрессированного в белой жировой ткани с помощью CAP,И FSK (аденилатциклазный активатор) - стимулированный липолиз в паховых жировых подушечках ¹¹ . Предыдущие исследования также показывают, что долгосрочная активация TRPV1 с помощью CAP активирует PKA ¹² . Поскольку активация PKA стимулирует липолиз ^{13 , 14} , измеряя как базальный, так и PKA-зависимый стимулированный липолиз в паховых жировых подушечках, изолированных от мышей с НИЗ или HFD (± CAP) после 32 недель кормления соответствующих диет, подтвердит роль TRPV1 Активация в липолизе.

В этой статье описывается эффективный метод определения базального и стимулированного липолиза. Хотя доступны другие методы, в которых используются радиоактивные изотопы глицерина и утомительной высокоэффективной жидкостной хроматографии или газовой хроматографии / масс-спектрометрии для измерений ^{15 , 16} , этот метод предлагает более прямые, простые и экономичныеДля определения липолиза в жировых тканях.

протокол

Все протоколы следуют рекомендациям по уходу за животными в Университете штата Вайоминг.

1. Жилье и кормление животных

ПРИМЕЧАНИЕ. Взрослые самцы мышей дикого типа (C57BL / 6) (возраст от 12 до 24 недель) были разведены на исследовательском объекте животных в соответствии с утвержденными протоколами, утвержденными Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC).

1. Начиная с 6-й недели, домашние мыши в группах по четыре в отдельных клетках и случайным образом назначают их в группы кормления НИЗ или HFD (± 0,01% CAP) до 38-й недели.
   ПРИМЕЧАНИЕ. CAP является агонистом белка канала TRPV1, экспрессированного в жировых тканях ^{11 , 17} . Смешайте CAP с HFD в блендере внутри капота и перенесите смешанную смесь в лоток, содержащий небольшие 1 на ² перегородки. Держите лоток внутри морозильника -20 ° C. Удалите лоток с диетой HFD + CAP из морозильника через 24 часа и храните в контейнере при температуре -20 &# 176; C морозильник до использования.
2. Домашние мыши в климатически контролируемой среде (22,8 ± 2,0 ° C, влажность 45-50%) с циклом 12/12-свет / темнота с доступом к назначенной диете и воде ad libitum .
3. В конце 38 недель рассекают паховые жировые ткани и используют для экспериментов с липолизами (разделы 2-7).

2. Подготовка мышей к экспериментам

1. Анестезируйте мышей путем инъекции смеси кетамина и ксилазина (10 мг / кг и 80 мг / кг массы тела, соответственно). Внесите 0,01 мл смеси / 10 г массы тела мыши.
2. Подтвердите глубокую анестезию твердым пальцем. Если есть рефлекс педали, снова проверьте мышь по меньшей мере через 30 секунд.
3. Используйте ветеринарную мазь для предотвращения сухости глаз во время анестезии. Не оставляйте мышей без присмотра во время любой процедуры.
4. Усыплять мышей путем инъекции высокой дозы инъекции смеси кетамина и ксилазина (10 мг / кг и 80 мг / кг массы тела соответственно) смесейE (0,01 мл / 10 г массы тела), за которым следует дислокация шейки матки.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Этот метод эвтаназии одобрен IACUC Университета Вайоминга.

3. Выделение паховых жировых жировых подушек

1. Поместите мышь (питание с NCD или HFD (± CAP) в течение 32 недель), лежащих слева от нее для процедуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Поместив мышь на левую сторону, левая передняя лапка и левая задняя конечность будут находиться на платформе рассечения, а правая передняя лапка и правая задняя лапка будут направлены в сторону от платформы.
2. Стерилизовать поверхность кожи с 2 дюйма ² марлевым тампоном , пропитанным 2,5 мл 70% -ного этанола. Сделайте 2 - 3 мм боковое разрез через кожу с помощью скальпеля, чтобы выявить лежащий в основе жировой слой.
3. Сделайте отрезок 1 см (в зависимости от размера мыши) через кожу, используя скальпель чуть ниже грудной клетки через дорсальную поверхность, соединяющую два боковых разреза.
4. Очистите лоскут кожи, тщательно перетаскивая егоИспользуя стерильные щипцы и оставлять подкожную клетку неповрежденной, не разрезая жировые прокладки. Это жирная подушечка, лежащая под кожей.
5. Просеивайте жироуловитель осторожно из основной мышцы и фасции, используя пару ножниц. Потяните жироуловитель, поскольку он вырезается из основной мышцы.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Вес и размер жировых подушечек зависят от типа мышей (NCD или HFD (± CAP) -fed).
6. Используйте пинцет, чтобы перенести его в чашку Петри, содержащую забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), до экспериментов по липолизу при комнатной температуре (~ 15 мин).
7. Изолируйте жировые прокладки с правой стороны мыши, как описано в шагах 3.2-3.6.

4. Освобождение базального глицерина от пагубных жировых подушек

1. Используйте острые ножницы, чтобы вырезать около 20 мг жировой ткани на 5-8 единиц.
2. Инкубируйте разрезанные части паховых жировых прокладок в 200 мкл инкубационной среды (модифицированная Дульбекко среда Игеля (DMEM), содержащая 2% жирной кислоты(BSA)) при 37 ° С, 5% СО ₂ и 95% влажности в течение 60 мин.
   1. Собирают среду для инкубации и замораживают при -80 ° C для анализа липолиза.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Разрезанные куски используются для определения концентрации белка после экстракции липидов.
   2. Перенесите отрезанные кусочки жира с помощью пинцета в 1 мл экстракционного раствора (хлороформ: метанол (2: 1, об. / Об.) И 1% ледяной уксусной кислоты) и инкубируйте в течение 60 мин при 37 ° С при энергичном встряхивании при 100 оборотов в минуту. Отбросьте раствор для удаления жира.
      ПРИМЕЧАНИЕ. На этом этапе извлекается жир из срезанных кусочков. Отбросьте раствор для извлечения жира, поскольку он будет мешать определению белка.
   3. Перенесите ткань (с этапа 4.2.2) с помощью пинцета в стерильную микроцентрифужную пробирку, содержащую 500 мкл раствора для лизиса (0,3 н. NaOH, содержащего 0,1% додецилсульфата натрия, SDS) и инкубируйте в течение ночи (12 часов) при 55 ° С при энергичном встряхивании При 100 об / мин.
3. Определите концентрацию белка в ткани (этап 4.2.3), используя реагент бицинхониновой кислоты (BCA) и BSA в качестве стандарта ¹⁸ .
4. Разморозить замороженные среды (этап 4.2.1) на лед и определяет содержание глицерина в среде с использованием реагента , свободный глицерином , как описано в разделах протокола 6 и 7 ^6.
   1. Экстраполировать концентрацию глицерина в образцах по стандартной кривой, нанесенной с использованием стандартов глицерина ^19, и выразить липолиз в виде наномолей глицерина на мг белка в час ²⁰ .

5. ФСК-стимулированный липолиз

1. Предварительно инкубировать около 20 мг паховой жировой прокладки (от 5 до 8 срезов), полученных от мыши с диким типом NCD или HFD (± CAP), в 200 мкл DMEM, содержащей 2% свободной жирной кислоты BSA, 10 мкМ FSK и 5 мкМ Triacsin C при 37 ° C в 5% CO ₂ и 95% влажности в течение 60 минут.
   1. Перенесите кусочки ткани с помощью пинцета на идентичную среду и инкубируйте еще в течение 60 мин при 37 ° С, 5% СО ₂ и 95% влажности. Собрать инкубационную среду и хранить при -80 ° C до анализа липолиза.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Стимуляция липолиза вызывает быстрое высвобождение жирных кислот и глицерина в течение 15 мин, что является линейным в течение первого часа, а затем плато. Поскольку скорость стимулированного липолиза выше и стабильна между первым и вторым часами стимуляции FSK, этот протокол измерял липолиз в стимулированном состоянии после второго периода инкубации, как описано ранее ¹ . Итак, необходимы экспериментальные этапы (5.1 и 5.1.1).
2. Чтобы извлечь жир из пастиковых жировых подушечек, перенесите кусочки паховых жировых подушечек (полученных от мышей с NCD или HFD (± CAP)) с этапа 5.1 с помощью пинцета в 1 мл экстракционного раствора (хлороформ: метанол (2) : 1. v /V) и 1% ледяной уксусной кислоты) и инкубируют в течение 60 мин при 37 ° С при энергичном встряхивании со скоростью 100 об / мин. Отбросьте извлеченный жир.
3. Перенесите ткань (с шага 5.2) с помощью пинцета в стерильную микроцентрифужную пробирку, содержащую 500 мкл раствора для лизиса (0,3 н. NaOH, содержащего 0,1% SDS) и инкубируйте в течение ночи (12 часов) при 55 ° С при энергичном встряхивании со скоростью 100 об / мин.
4. Определите концентрацию белка и содержание глицерина в ткани, как описано в шагах 4.3 и 4.4 соответственно.

6. Получение свободного глицеринового реагента

1. Восстановите глицериновый реагент ¹⁹ в 40 мл деионизированной воды в стеклянном флаконе янтарного цвета, положите пробку на флакон и хорошо перемешайте, инвертируя 10 раз. Не перемешивайте, встряхивая.
2. Хранить флакон при температуре 4 ° C в холодильнике, защищенном от света, полностью закрывая флакон алюминиевой фольгой.
3. Приступить к подготовке стандарта глицерина (раздел 7).

7. Получение стандарта глицерина и определение содержания глицерина

1. Сделайте запас 1 мМ, разбавив 35 мкл поставляемого материала 65 мкл деионизированной воды.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Изготовитель поставил глицерин стандартного запаса 2,8 мМ глицерина.
2. Возьмите пять однометровых метакрилатных кювет длиной 1 см. Наклейте кюветы маркером как 0, 1.25, 2.5, 5 и 10 нмоль.
3. Добавьте 0, 1.25, 2.5, 5 и 10 мкл 1 мМ глицеринового стандарта в соответствующие меченые кюветы. Составьте объем каждой кюветы до 10 мкл деионизированной водой.
4. Сделайте от 1 до 10 разведений всех образцов (начиная со стадии 4.4 или 5.1.1), добавив 10 мкл образца к 90 мкл деионизированной воды в свежие 500 мкл предварительно маркированные пробирки для центрифуг. Добавьте 10 мкл разбавленных образцов в кюветы, помеченные соответствующим идентификационным номером образца.
5. Включите спектрофотометр UV-VIS и установите волнуДлиной до 540 нм.
6. Прогрейте свободный реагент глицерина до комнатной температуры, удерживая флакон (этап 6.2) при комнатной температуре в течение 15 мин.
7. Настройте серию меченых кювет в качестве стандартного стандарта «0» нмоль (шаг 7.3), стандартов (шаг 7.3) и образцов (шаг 7.4).
8. Добавьте 10 мкл каждого стандарта и образца в соответствующую маркированную кювету. Используйте «0» нмоль стандарт как пустой.
9. Добавить 0,8 мл свободного глицеринового реагента в каждую кювету, содержащую глицериновые стандарты с использованием 1 мл пипетки.
10. Накройте кювету квадратной пластиковой парафиновой пленкой размером 1,5 см и смешайте содержимое, повернув кювету 3 раза и отложив при комнатной температуре в течение 10 мин.
11. Поместите кювету в спектрофотометр UV-VIS и зафиксируйте поглощение (длина волны 540 нм).
12. Постройте стандартную кривую, используя концентрации стандартов (нмоль) по оси Х и записанную абсорбцию по оси Y.
13. Вычислить концентрацию glИцерола в образцах (нмоль) экстраполяцией с использованием стандартной кривой, построенной на этапе 7.12.
14. Умножьте концентрацию образцов (нмоль / кювету) с коэффициентом разбавления 10 (см. Шаг 7.4) и 20 (общий объем)
15. Разделите концентрацию глицерина в каждом образце (этап 7.13) на мг белка, вычисленный методом BCA.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Поскольку образцы паховой жировой пробы инкубируют в течение 60 мин, результаты представлены в виде нмоль глицерина / мг белка / ч.

Результаты

Чтобы оценить влияние CAP на базальный и стимулированный липолиз, в этом исследовании был измерен липолиз в паховых жировых жировых подушках, выделенных из мышей дикого типа с NCD или HFD (± CAP). Репрезентативные результаты для базального и FSK-стимулированного липолиза для ...

Обсуждение

Процесс распада TGL в глицерин и жирные кислоты катализируется ATGL ⁹ во время базального липолиза и организован группой белков, включая активацию аденилилциклазы / PKA-зависимого пути во время стимулированного липолиза ^{21 , 22 , 23}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capsaicin	Sigma, USA	M2028	TRPV1 agonist
Forskolin	Sigma, USA	F6886	Adenylyl cyclase activator
DMEM	GE healthcare and life sciences, UT, USA	SH30081.01
High fat diet	Research diets, New Brunswick, USA	D12492	Abbreviated as HFD
Tris	Amresco, USA	O497
Sodium chloride	Thermofisher Scientific	BP358-212
Sodium deoxycholate	Sigma, USA	D6750
Dithiothreitol	Sigma, USA	D9163
Sodium orthovanadate	Sigma, USA	S6508
Protease inhibitor cocktail	Sigma, USA	P8340
Free Glycerol reagent	Sigma USA	F6428
DMSO	Sigma, USA	D8779
Triacsin C	Sigma, USA	T4540	Acyl CoA transferase inhibitor
Bovine serum albumin	Sigma, USA	A7030
Chloroform	Sigma Aldrich	31998-8
Methanol	Thermofisher Scientific, USA	A412-1
Sodium hydroxide	Amresco, USA	O583
Sodium dodecyl sulfate	Sigma, USA	L3371
Bicinchoninic acid reagent	Sigma, USA	BCA1-1KT
UV-VIS Spectrophotometer	Pharmacia Biotech, NJ, USA	Ultrospec 2000
Normal chow diet	Labdiet.com	500I	abreviated as NCD
C57BL/6 mice	Jackson Laboratory, CT, USA	Stock number000664	wild type mice
Parafilm	Heathrow Scientific, USA	HS 234526A
Glycerol standard	Sigma, USA	G7793