Mesure de la lipolyse basale et stimulée par Forskolin dans des tampons de graisse adipeuse inguinale

Résumé

Ce protocole décrit la méthode de détermination de la lipolyse basale et stimulée par la forskoline dans des tampons de graisse inguinal obtenus à partir d'une alimentation normale (NCD) ou d'un régime alimentaire à forte teneur en graisse (HFD), la capsaicine alimentée avec des souris de type sauvage. En tant qu'indice pour la lipolyse, la libération de glycérol a été mesurée à partir de tampons de graisse adipeuse inguinale.

Résumé

La lipolyse est un processus par lequel les lipides stockés sous forme de triglycérides dans des tissus adipeux sont hydrolysés en glycérol et en acides gras. Cet article décrit la méthode de mesure de la lipolyse basique et de la forskoline (FSK) dans les tampons gras gras inguinaux isolés à partir de souris de type sauvage alimentées soit en régime alimentaire régulier (NCD), en alimentation à forte teneur en matière grasse (HFD), soit en alimentation à forte teneur en matières grasses contenant 0,01 % De la capsaïcine (PAC: agoniste de la sous-famille Vanilloid 1 (TRPV1) du récepteur transitoire pendant 32 semaines. La méthode décrite ici pour la réalisation de la lipolyse ex vivo est adoptée à partir de Schweiger et al. ¹ Nous présentons un protocole détaillé pour mesurer les niveaux de glycérol par spectrophotométrie UV-Visible (UV / VIS). La méthode décrite ici peut être utilisée pour isoler avec succès les tampons gras gras inguinaux pour des mesures de lipolyse afin d'obtenir des résultats cohérents. Le protocole décrit pour les tampons gras inguinaux peut facilement être étendu pour mesurer la lipolyse dans d'autres tissus.

Introduction

Les tissus adipeux stockent l'énergie en tant que matière grasse ² et l'oxydation des acides gras est requise pour la thermogenèse ^{3 , 4} . Les acides gras ingérés par les régimes sont emballés avec des apoprotéines dans des chylomicrons et livrés à différents tissus dans le corps par circulation sanguine. Bien que la plupart des cellules dans le corps stockent une réserve d'énergie, le tissu adipeux stocke l'excès d'énergie en tant que graisse ^{5 , 6} . La lipolyse dans le tissu adipeux est régulée par des processus complexes et les détails moléculaires de la lipolyse restent vagues ⁷ .

La lipolyse est un procédé par lequel les triglycérides (TGL) stockés dans des tissus adipeux sont hydrolysés pour produire du glycérol et des acides gras (FA) par l'enzyme lipolyse liposomique adipeuse (ATGL) ⁸ . Les modifications de la lipolyse basale et stimulée sont une caractéristique de l'obésité. Le bLa lipolyse asal est régulée par l'activation ATGL ⁹ , qui convertit TGL en diacylglycérol (DAG), qui est ensuite hydrolysé en monoacyl glycerol (MAG). L'activation de la lipase sensible aux hormones (HSL) par l' adenylyl cyclase active la stimulation de la protéine kinase A (PKA) dépendante de l'adénosine et du monophosphate cyclique (AMPc) et provoque une lipolyse. La mesure de la lipolyse, basale et stimulée, est donc importante pour analyser l'activité des protéines impliquées dans ce processus. En outre, la mise au point de la régulation moléculaire de la lipolyse peut être bénéfique pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre l'obésité ¹⁰ . Étant donné que les molécules qui stimulent la lipolyse et l'oxydation des acides gras sont des candidats potentiels pour diminuer les graisses stockées dans les dépôts, il est important d'utiliser un test robuste pour la reproductibilité.

Les données publiées précédemment suggèrent que l'activation de la protéine TRPV1 exprimée dans le tissu adipeux blanc par CAP renforcé basalEt la lipolyse stimulée par FSK (adenylyl cyclase) dans des graisses inguinales ¹¹ . Des recherches antérieures suggèrent également que l'activation à long terme de TRPV1 par CAP active la PKA ¹² . Étant donné que l'activation de la PKA stimule la lipolyse ^{13 , 14} , mesurer à la fois la lipolyse stimulée basale et la PKA stimulée dans les graisses inguinales isolées à partir de souris NCD ou HFD (± CAP) après 32 semaines d'alimentation, les régimes respectifs valideront le rôle de TRPV1 Activation dans la lipolyse.

Cet article décrit une méthode efficace de détermination de la lipolyse basale et stimulée. Bien que d'autres méthodes qui utilisent des isotopes radioactifs de glycérol et une chromatographie en phase liquide abondante à haute performance ou une chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de masse pour les mesures ^{15 , 16} soient disponibles, cette méthode offre une plus directe, simple et rentableTechnique pour déterminer la lipolyse dans les tissus adipeux.

Protocole

Tous les protocoles suivent les lignes directrices sur les soins des animaux de l'Université du Wyoming.

1. Logement et alimentation animale

NOTE: Les souris de type sauvage adultes (C57BL / 6) (12 à 24 semaines) ont été élevées dans l'établissement d'élevage de recherche selon les protocoles approuvés par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux (IACUC).

1. À partir de l'âge de la semaine 6, habitent des souris dans des groupes de quatre dans des cages séparées et les assignent au hasard dans des groupes d'alimentation de NCD ou HFD (± 0,01% CAP) jusqu'à la semaine 38 de l'âge.
   NOTE: CAP est une agoniste de la protéine du canal TRPV1 exprimée dans les tissus adipeux ^{11 , 17} . Mélanger le CAP avec HFD dans un mélangeur à l'intérieur du capot et transférer le mélange mélangé dans un plateau contenant de petites cloisons de 1 sur ² . Gardez le plateau à l'intérieur d'un congélateur de -20 ° C. Retirez le plateau contenant le régime HFD + CAP du congélateur après 24 heures et rangez-le dans un récipient à -20 &# 176; C congélateur jusqu'à utilisation.
2. Les souris maison dans un environnement climatisé (22,8 ± 2,0 ° C, humidité de 45 à 50%) avec un cycle de 12/12 lumière / obscurité avec accès au régime désigné et à l'eau ad libitum .
3. Au bout de 38 semaines, disséquer les tissus adipeux inguinaux et utiliser pour les expériences de lipolyse (sections 2-7).

2. Préparation des souris pour les expériences

1. Anesthésier les souris en injectant du mélange de kétamine et de xylazine (10 mg / kg et 80 mg / kg de poids corporel, respectivement). Injecter 0,01 ml du mélange / 10 g de poids corporel de la souris.
2. Confirmez l'anesthésie profonde par une pincée ferme. S'il y a un réflexe de pédale, testez à nouveau la souris après au moins 30 s.
3. Utilisez une pommade oculaire pour prévenir la sécheresse des yeux pendant l'anesthésie. Ne laissez pas les souris sans surveillance lors de l'une des procédures.
4. Euthanasier les souris en injectant une dose élevée d'injection de mélange de kétamine et de xylazine (10 mg / kg et 80 mg / kg de poids corporel, respectivement)E (0,01 ml / 10 g de poids corporel) suivi d'une dislocation cervicale.
   NOTE: Cette méthode d'euthanasie est approuvée par l'IACUC de l'Université du Wyoming.

3. Isolation des coussins de graisse adipeuse inguinale

1. Placez la souris (alimentée par NCD ou HFD (± CAP) pendant 32 semaines) située à gauche pour la procédure.
   REMARQUE: en plaçant la souris sur le côté gauche, l'avant antérieur gauche et le membre postérieur gauche seront sur la plate-forme de dissection, tandis que l'avant avant droit et le membre postérieur droit seront éloignés de la plate-forme.
2. Stériliser la surface de la peau avec un tampon de 2 pouces ² gaze trempé dans environ 2,5 ml d'éthanol à 70%. Faire une coupe latérale de 2 à 3 mm dans la peau à l'aide d'un scalpel pour révéler la couche grasse sous-jacente.
3. Faire une coupe de 1 cm (selon la taille de la souris) à travers la peau en utilisant un scalpel juste en dessous de la cage thoracique sur la surface dorsale joignant les deux incisions latérales.
4. Épluchez le volet de la peau en le faisant glisser avec précautionEn utilisant des pinces stériles et laisser le tampon sous-cutané intact en ne coupant pas les tampons gras. C'est le coussinet gras qui se trouve sous la peau.
5. Dissectionnez délicatement le coussinet gras du muscle sous-jacent et du fascia en utilisant une paire de ciseaux. Tirez sur le tampon gras car il est coupé du muscle sous-jacent.
   REMARQUE: Le poids et la taille des tampons gras dépendent du type de souris (NCD ou HFD (± CAP) -fed).
6. Utilisez une pince à épiler pour la transférer dans une boîte de Petri contenant de la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) jusqu'à l'expérience de lipolyse, à température ambiante (~ 15 min).
7. Isoler les tampons gras du côté droit de la souris comme décrit aux étapes 3.2-3.6.

4. Sortie basale de glycérine à partir de gousses inguinales

1. Utilisez des ciseaux pointus pour réduire environ 20 mg de tissu adipeux dans 5 à 8 pièces.
2. Incuber les morceaux coupés de graisses inguinales dans 200 μL de milieu d'incubation (Milieu d'Eagel Modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 2% d'acide grasAlbumine de sérum bovin libre (BSA)) à 37 ° C, 5% de CO ₂ et 95% d'humidité pendant 60 min.
   1. Recueillir le milieu d'incubation et congeler à -80 ° C pour un dosage de lipolyse.
      REMARQUE: Les morceaux coupés sont utilisés pour la détermination de la concentration de protéines après l'extraction des lipides.
   2. Transférer les morceaux de graisse coupée à l'aide de pincettes dans 1 mL de solution d'extraction (chloroforme: méthanol (2: 1, v / v) et 1% d'acide acétique glacial) et incuber pendant 60 minutes à 37 ° C sous agitation vigoureuse à 100 Rpm. Jeter la solution d'extraction des graisses.
      REMARQUE: Cette étape va extraire le gras des morceaux découpés. Jeter la solution d'extraction des graisses car elle entravera la détermination de la protéine.
   3. Transférer le tissu (à partir de l'étape 4.2.2) à l'aide de pincettes dans un tube de microcentrifugation stérile contenant 500 μl de solution de lyse (0,3 N de NaOH contenant 0,1% de dodécylsulfate de sodium, SDS) et incuber pendant une nuit (12 h) à 55 ° C sous une vibration vigoureuse À 100 tr / min.
3. Déterminer la concentration en protéines du tissu (étape 4.2.3) en utilisant le réactif à l'acide bicinconinique (BCA) et la BSA comme norme ¹⁸ .
4. Décongeler le milieu congelé (étape 4.2.1) sur la glace et déterminer la teneur en glycérol du milieu en utilisant un réactif de glycérol gratuit comme décrit dans les sections de protocole 6 et 7 ⁶ .
   1. Extrapoler la concentration de glycérol dans les échantillons de la courbe standard tracée en utilisant les normes de glycérol ¹⁹ et exprimer la lipolyse en nanomoles de glycerol par mg de protéine par h ²⁰ .

5. Lipolyse stimulée par FSK

1. Préincubez environ 20 mg de tampon gras inguinal (5 à 8 morceaux découpés) obtenus à partir de souris de type sauvage NCD ou HFD (± CAP) dans 200 μL de DMEM contenant 2% de BSA exempte d'acides gras, 10 kM de FSK et 5 μM de Triacsin C à 37 ° C dans 5% de CO ₂ et 95% d'humidité pendant 60 min.
   1. Transférer les morceaux de tissu en utilisant une pince à un milieu identique et incuber pendant encore 60 minutes à 37 ° C, 5% de CO ₂ et 95% d'humidité. Recueillir le milieu d'incubation et conserver à -80 ° C jusqu'à l'essai de lipolyse.
      NOTE: La stimulation de la lipolyse provoque une libération rapide d'acides gras et de glycérol dans les 15 minutes, ce qui est linéaire pendant la première heure et des plateaux par la suite. Comme le taux de lipolyse stimulée est plus élevé et stable entre la première et la deuxième heure de stimulation FSK, ce protocole a mesuré la lipolyse à l'état stimulé après la deuxième période d'incubation comme décrit précédemment ¹ . Donc, les deux étapes expérimentales (5.1 et 5.1.1) sont nécessaires.
2. Pour extraire la graisse des graisses inguinales, transférez les morceaux coupés de graisses inguinales (obtenus à partir des souris NCD ou HFD (± CAP) de l'étape 5.1 à l'aide de pinces dans 1 ml de solution d'extraction (chloroforme: méthanol (2 : 1. v /V) et 1% d'acide acétique glacial) et incuber pendant 60 min à 37 ° C sous agitation vigoureuse à 100 tr / min. Jeter le gras extrait.
3. Transférer le tissu (à partir de l'étape 5.2) en utilisant des pincettes dans un tube stérile de microcentrifugeuse contenant 500 μl de solution de lyse (0,3 N de NaOH contenant 0,1% de SDS) et incuber pendant une nuit (12 h) à 55 ° C sous agitation vigoureuse à 100 tr / min.
4. Déterminer la concentration en protéines et la teneur en glycérol du tissu comme décrit aux étapes 4.3 et 4.4, respectivement.

6. Préparation du réactif de glycérol gratuit

1. Reconstituer le réactif glycérol ¹⁹ dans 40 ml d'eau désionisée dans un flacon en verre couleur ambré, placer un bouchon sur le flacon et bien mélanger en inversant 10 fois. Ne pas mélanger en tremblant.
2. Conserver le flacon à 4 ° C dans un réfrigérateur protégé de la lumière en recouvrant complètement le flacon avec du papier d'aluminium.
3. Procédez à la préparation de la norme de glycérol (section 7).

7. Préparation du standard de glycérol et détermination du contenu en glycérol

1. Faire un stock de 1 mM en diluant 35 μL du stock fourni avec 65 μL d'eau désionisée.
   REMARQUE: Le produit standard fourni par le fabricant de glycérol est de 2,8 mM de glycerol.
2. Prenez cinq cuvettes à méthacrylate jetables de longueur de trajet de 1 cm. Étiquetez les cuvettes en utilisant un marqueur comme 0, 1.25, 2.5, 5 et 10 nmol standard.
3. Ajouter 0, 1,25, 2,5, 5 et 10 μL de 1 mM de glycerol standard aux cuvettes étiquetées respectives. Compléter le volume de chaque cuve à 10 μl avec de l'eau désionisée.
4. Faire une dilution de 1 à 10 de tous les échantillons (à partir de l'étape 4.4 ou 5.1.1) en ajoutant 10 μL de l'échantillon à 90 μL d'eau désionisée dans des tubes de centrifugation pré-marqués frais de 500 μL. Ajouter 10 μL des échantillons dilués dans les cuvettes étiquetées avec le numéro d'identification de l'échantillon respectif.
5. Allumer le spectrophotomètre UV-VIS et régler l'ondeLongueur jusqu'à 540 nm.
6. Réchauffer le réactif glycérol gratuit à température ambiante en maintenant le flacon (étape 6.2) à température ambiante pendant 15 min.
7. Mettre en place une série de cuvettes étiquetées en tant que norme nmol "0" (étape 7.3), normes (étape 7.3) et échantillons (étape 7.4).
8. Ajouter 10 μL de chacun de la norme et de l'échantillon dans la cuvette étiquetée respective. Utilisez "0" nmol standard en blanc.
9. Ajouter 0,8 ml de réactif glycérol gratuit dans chaque cuve contenant les éprouvettes de glycerol en utilisant une pipette de 1 ml.
10. Couvrir la cuvette avec un film de paraffine en plastique carré de 1,5 cm et mélanger le contenu en inversant la cuvette pendant 3 fois et mettre de côté à température ambiante pendant 10 min.
11. Placez la cuvette dans le spectrophotomètre UV-VIS et enregistrez l'absorbance (540 nm d'onde).
12. Tracez la courbe standard en utilisant les concentrations des normes (nmol) dans l'axe des X et l'absorbance enregistrée dans l'axe des Y.
13. Calculer la concentration de glYcérine dans les échantillons (nmol) par extrapolation en utilisant la courbe standard tracée à l'étape 7.12.
14. Multipliez la concentration d'échantillons (nmol / cuvette) avec le facteur de dilution 10 (voir étape 7.4) et 20 (volume total)
15. Diviser la concentration de glycérol dans chaque échantillon (étape 7.13) par le mg de protéine calculé par la méthode BCA.
    NOTE: Étant donné que les échantillons de tampon gras inguinal sont incubés pendant 60 min, représentent les résultats en tant que nmol de glycerol / mg de protéine / h.

Résultats

Pour évaluer l'effet de la PAC sur la lipolyse basique et stimulée, cette étude a permis de mesurer la lipolyse dans des tampons de graisse adipeuse inguinale isolés à partir de souris sauvages de type NCD ou HFD (± CAP). Les résultats représentatifs de la lipolyse basale et stimulée par FSK pour les tampons gras gras inguinaux sont donnés dans le tableau I. La libération de glycérol stimulée basale et FSK en présence de Triacsine C, qui inhibe l'ac...

Discussion

Le processus de dégradation de TGL dans le glycérol et les acides gras est catalysé par ATGL ⁹ lors de la lipolyse basale et orchestré par un ensemble de protéines, y compris l'activation de la voie dépendante de l'adénylyl cyclase / PKA pendant la lipolyse stimulée ^{21 , 22 , 23} . L'amélioration de la lipolyse augmente les niveaux plasmatiques d'acides gras pour le transport et l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Capsaicin	Sigma, USA	M2028	TRPV1 agonist
Forskolin	Sigma, USA	F6886	Adenylyl cyclase activator
DMEM	GE healthcare and life sciences, UT, USA	SH30081.01
High fat diet	Research diets, New Brunswick, USA	D12492	Abbreviated as HFD
Tris	Amresco, USA	O497
Sodium chloride	Thermofisher Scientific	BP358-212
Sodium deoxycholate	Sigma, USA	D6750
Dithiothreitol	Sigma, USA	D9163
Sodium orthovanadate	Sigma, USA	S6508
Protease inhibitor cocktail	Sigma, USA	P8340
Free Glycerol reagent	Sigma USA	F6428
DMSO	Sigma, USA	D8779
Triacsin C	Sigma, USA	T4540	Acyl CoA transferase inhibitor
Bovine serum albumin	Sigma, USA	A7030
Chloroform	Sigma Aldrich	31998-8
Methanol	Thermofisher Scientific, USA	A412-1
Sodium hydroxide	Amresco, USA	O583
Sodium dodecyl sulfate	Sigma, USA	L3371
Bicinchoninic acid reagent	Sigma, USA	BCA1-1KT
UV-VIS Spectrophotometer	Pharmacia Biotech, NJ, USA	Ultrospec 2000
Normal chow diet	Labdiet.com	500I	abreviated as NCD
C57BL/6 mice	Jackson Laboratory, CT, USA	Stock number000664	wild type mice
Parafilm	Heathrow Scientific, USA	HS 234526A
Glycerol standard	Sigma, USA	G7793