Eine einfache Fraktionierte Extraktionsmethode für die umfassende Analyse von Metaboliten, Lipiden und Proteinen aus einer einzigen Probe

Zusammenfassung

Ein Protokoll zur umfassenden Extraktion von Lipiden, Metaboliten und Proteinen aus biologischen Geweben mit einer Probe wird vorgestellt.

Zusammenfassung

Das Verständnis komplexer biologischer Systeme erfordert die Messung, Analyse und Integration mehrerer Verbindungsklassen der lebenden Zelle, die in der Regel durch transkriptomische, proteomische, metabolomische und lipidomische Messungen bestimmt wird. In diesem Protokoll stellen wir ein einfaches Verfahren zur reproduzierbaren Extraktion von Metaboliten, Lipiden und Proteinen aus biologischen Geweben mit einem einzigen Aliquot pro Probe vor. Das Extraktionsverfahren basiert auf einem Methyl- tert -butylether: Methanol: Wassersystem für flüssige: flüssige Partitionierung von hydrophoben und polaren Metaboliten in zwei unmischbare Phasen zusammen mit dem Ausfällen von Proteinen und anderen Makromolekülen als festem Pellet. Diese Methode liefert daher drei verschiedene Fraktionen der spezifischen molekularen Zusammensetzung, die vollständig mit den üblichen Hochleistungs-Omics-Technologien wie Flüssigchromatographie (LC) oder Gaschromatographie (GC), die an Massenspektrometer gekoppelt sind, kompatibel sind. Obwohl die Methode init warFür die Analyse verschiedener Pflanzengewebeproben entwickelt, hat es sich als voll kompatibel für die Extraktion und Analyse von biologischen Proben aus so vielfältigen Systemen wie Algen, Insekten und Säugetiergeweben und Zellkulturen erwiesen.

Einleitung

Die Systembiologie, die in der Mitte des letzten Jahrhunderts ¹ entstand und durch die umfangreiche Analyse der genomischen und transkriptomischen Datensätze ^{2 , 3} vorangebracht wurde, hat sich zu einem neuen und unentbehrlichen Ansatz für die Analyse komplexer biologischer Systeme entwickelt ^{4 , 5} . Das Hauptziel der Systembiologie ist es, die Komponenteninteraktionen und -abhängigkeiten in biologischen Systemen zu entschlüsseln und die Verbindung zwischen Genotypen, deren Realisierung, molekulare Transformationen und daraus resultierende Phänotypen zu überbrücken. Dementsprechend ist die Integration von umfassenden Datensätzen, die durch die vielfältigen analytischen Ansätze, nämlich Genomik, Transkriptomik, Metabolomik, Lipidomik und Proteomik und deren Berechnungsanalyse, hergestellt werden, eine Voraussetzung für die Beschreibung und das Verständnis komplexer biologischer Systeme.

Bas Über die enorme chemische Vielfalt und Komplexität der biologischen Komponenten in jedem lebenden System beruht die Produktion von großen und umfassenden "Omics" -Datensätzen stark auf die Qualität der angewandten Extraktionsmethode ⁹ . Neben der Qualität der Extraktionsmethode ist die Wirtschaftlichkeit der Methode wichtig; Dies bedeutet, dass es wünschenswert wäre, so viel molekulare Informationen von so wenig Stichprobeneingabe wie möglich zu erhalten. Oft können die Probenmengen begrenzt werden, und daher ist es höchst wünschenswert, eine Extraktionsmethode zu verwenden, die so viele Molekülklassen aus einer einzigen Extraktion einer gegebenen Probe ableiten kann. Dies bedeutet, dass anstelle der Verwendung mehrerer spezialisierter Extraktionsmethoden für die Extraktion verschiedener Compoundklassen aus verschiedenen Probenaliquoten derselben Probe ein sequentielles Extraktionsverfahren angewendet wird, das die molekularen Bestandteile eines einzelnen Aliquots in verschiedene molekulare Fraktionen fraktioniert.

_content "> Die übliche Methode, die für diese fraktionierten Extraktionsverfahren angewendet wird, basiert auf der Zwei-Phasen-Lipid-Extraktionsmethode von Folch et al. , Die 1957 entwickelt wurde. ^10. Diese Methode basiert auf einer Chloroform: Methanol / Wasser-Partitionierung von polaren und hydrophoben Metaboliten und war Beabsichtigt, die Proben für eine qualitativ hochwertige Lipidanalyse aufzuräumen und zu dekomplexieren. Mit der Entwicklung der Multi-Omics-Systembiologie wurde die Folch-Methode weiter schrittweise verbessert, indem sie für die Probenpartitionierung von Proteinen und polaren Metaboliten und Lipiden verwendet wurde Gas- und Flüssigchromatographie-basierte Metabolomik und Lipidomik von polaren und hydrophoben Verbindungen, zusätzlich zu Flüssigchromatographie-basierten Proteomik ^{11 , 12 , 13 , 14.} Leider sind alle diese Methoden auf eine Chloroform-basierte Extraktionsmethode angewiesen, die nicht nur Führt zu den unerwünschten foRmation des Proteinpellets als Zwischenphase zwischen der Polar- und der Lipidphase, die aber auch ein unerwünschtes Lösungsmittel aus der Perspektive der Grünchemie ^{15 , 16 ist} . Jedoch überwindet das Lösungsmittel Methyl- tert -butylether (MTBE) beide dieser vorgenannten Probleme und ist ein geeigneter Ersatz für Chloroform. Basierend auf diesen Anforderungen haben wir uns entschlossen, eine MTBE: methanol: wasserbasierte Extraktionsmethode zu etablieren, die alle vorgenannten Spezifikationen erfüllt und somit als idealer Ausgangspunkt für eine umfassende Multimedienanalyse dient ¹⁶ .

Dieses Protokoll führt den Anwender Schritt für Schritt durch den einfachen, schnellen und reproduzierbaren Arbeitsablauf der Probenvorbereitung, einschließlich der Fehlersuche bei häufig beobachteten Problemen. Weiterhin werden wir kurz beispielhafte analytische Daten aus der Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (UPLC-MS) -bas vorstellenEd Lipidomik, Metabolomik und Proteomik Profilierung von Pflanzengewebe Proben. Obwohl die angegebenen Beispiele aus 50 mg einer Arabidopsis-Thaliana-Blattgewebeprobe stammen, wurde dieses Protokoll für mehrere andere biologische Proben und Gewebe verwendet, darunter Algen ^{17 , 18} , Insekten ¹⁹ und Säugetierzellen, Organe und Gewebe ^{20 , 21 , 22} Der Umfang des präsentierten Extraktionsprotokolls soll eine klare und detaillierte Beschreibung der Vorbehandlung der Probenahme und des Extraktionsverfahrens selbst ermöglichen. Obwohl wir drei kurze Beispiele für die analytische Anwendung vorstellen, können detaillierte Informationen über die vor- und nachanalytische Datenverarbeitung aus unseren früheren Publikationen ^{16 , 23 , 24 ,} 25 ^{, 26} .

Protokoll

Achtung : Methanol (MeOH) und Methyl- tert -butylether (MTBE), die während der Extraktion verwendet werden, sind entflammbar und können bei längerer Exposition und / oder Kontakt-, Atem-, Augen- oder Hautreizung auftreten. Bitte behandeln Sie diese sorgfältig nur in einer Dunstabzugshaube und verwenden Sie bei der Extraktion die entsprechenden Sicherheitsmaßnahmen (Laborkittel, Schutzbrille, Handschuhe usw. ). Flüssiger Stickstoff und Trockeneis, die in mehreren Schritten dieses Protokolls verwendet werden, können schwere Verbrennungen durch längeren Hautkontakt verursachen. Bitte behandeln Sie sie sorgfältig, indem Sie Schutzhandschuhe und Gläser tragen. Benutzer können verschiedene Chemikalien, Reagenzien oder interne Standards für die Probenanalyse verwenden, von denen einige giftig sein können. Bitte prüfen Sie die relevanten Sicherheitsdatenblätter für alle verwendeten Materialien.

1. Sammlung und Ernte von biologischen Proben

1. Bereiten Sie markierte Ernterohre vor.
   HINWEIS: Hier ernten Sie biologische Proben in etikettierten, 2 mL, rund-unten, sichere locK Mikrozentrifugenröhrchen mit zwei 5 mm Durchmesser, Metallkugeln für den Gewebehomogenisator.
2. Einen gefüllten flüssigen Stickstoff-Dewar vorbereiten.
3. Ernte die biologische Probe und schnappt das Gewebe in flüssigem Stickstoff ein. Führen Sie diesen Schritt so schnell wie möglich innerhalb von wenigen Sekunden durch, um metabolische Veränderungen zu vermeiden, die durch Verwundung verursacht werden.
   Anmerkung: Für Demonstrationszwecke verwenden Sie Rosettenblätter von 30 Tage alten Wildtyp Arabidopsis thaliana (Col-0), die auf dem Boden unter langen Tagesbedingungen gewachsen sind.
4. Halten Sie die geernteten Proben auf Trockeneis für kurzfristige Pausen oder lagern Sie sie bei -80 ° C für längere Zeiträume.

2. Schleifen und Gewebeunterbrechung

1. Vorbereitung der Röhrchenhalter des Gewebehomogenisators in flüssigem Stickstoff für mindestens 10 min. Wenn ein Gewebehomogenisator nicht vorhanden ist, verwenden Sie saubere und vorgekühlte Mörser und Stößel.
2. Nehmen Sie die Proben aus dem flüssigen Stickstoff, Trockeneis oder -80 ° C Gefrierschrank und legen Sie sie in den vorgekühltenRohrhalter.
3. Schnell die Röhrchenhalter in den Gewebehomogenisator stellen.
4. Das biologische Material zu einem feinen und homogenen Pulver schleifen. Verwenden Sie 20 Hz für 1 min für Blätter.
   Hinweis; Die Homogenisierungszeit und -geschwindigkeit kann je nach Gewebe variiert werden, stellen Sie sicher, dass die Probe zu einem feinen Pulver homogenisiert wird und dass dieses Pulver bei jedem Schritt der Homogenisierung eingefroren wird.
5. Nehmen Sie die biologischen Proben aus den Röhrenhaltern und halten Sie sie bis zur weiteren Extraktion gefroren.

3. Wiegen von Geweben

1. Verwenden Sie eine Analysenwaage mit ausreichender Genauigkeit für die benötigten Probenmengen.
2. Bereiten Sie ein beschriftetes 2-mL-Rundboden-Safe-Lock-Mikrozentrifugenröhrchen vor.
3. Die Röhrchen und Spatel in flüssigem Stickstoff vorkühlen.
4. Aliquotieren Sie die erforderliche Menge an Gewebepulver in das 2 ml-Sicherheitsschloss-Mikrozentrifugenröhrchen.
   Achtung: Vermeiden Sie das Auftauchen des Pflanzenmaterials durch Minimierung der Zeit, die auf w genommen wirdAcht die Proben.
5. Geben Sie die Aliquotten sofort nach dem Wiegen auf flüssigen Stickstoff zurück.
6. Aufzeichnung für jede Probe das genaue Gewicht. Verwenden Sie 10-50 mg ± 10% für die meisten pflanzlichen Gewebe.
7. Lagern Sie die aliquotierten Proben bei -80 ° C bis zur weiteren Extraktion.

4. Reagenz-Setup

1. Verwenden Sie eine Extraktionsmischung aus Methyl- tert -butylether (MTBE) / Methanol (MeOH).
   1. Zur Herstellung von 100 ml Extraktionslösungsmittel werden 75 ml MTBE auf 25 ml MeOH gegeben, um eine Mischung aus MTBE: MeOH (3: 1, vol / vol) herzustellen.
   2. Hinzufügen von internen Standards für die Nachanalyse Normalisierung nach analytischen Bedürfnissen. In der Regel werden 50 μl 1,2-Diheptadecanoyl- sn- glycero-3-phosphocholin (1 mg / ml in Chloroform) als interner Standard für die UPLC-MS-basierte Lipidanalyse zugegeben, während 50 μl ¹³ C Sorbit ( 1 mg / ml in Wasser) als interne Standards für die GC-MS-basierte Analyse der primärenMetaboliten Interne Standards für die UPLC-MS-basierte Metabolitanalyse sind 50 μl Corticosteron (1 mg / ml in Methanol) und 25 μl Ampicillin (1 mg / ml in Methanol).
   3. Übertragen Sie das Lösungsmittel auf eine saubere Glasflasche, die mit MTBE: MeOH-Mischung gespült wurde.
   4. Die Extraktionsmischung bis zu 1 Woche bei 4 ° C aufbewahren.
      HINWEIS: Die Extraktionsmischung längere Zeit nicht aufbewahren, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.
2. Um die Phasentrennung zu induzieren, verwenden Sie Wasser (H ₂ O) / Methanol (MeOH).
   1. Zur Herstellung von 100 ml H & _sub2 ; O: MeOH werden 75 ml H & _sub2 ; O zu 25 ml MeOH gegeben, um H & _sub2 ; O: MeOH (3: 1, vol / vol) zu ergeben.
   2. Übertragen Sie das Lösungsmittel auf eine saubere Glasflasche, die mit H ₂ O: MeOH-Mischung gespült wurde. Dieses Lösungsmittel kann mehrere Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.

5. Extraktion von Proben

1. Vorbereitung der Extraktion m(MTBE: MeOH, 3: 1, vol / vol) bis -20 ° C mit einem Flüssigkeitskühlsystem oder einem Gefrierschrank von -20 ° C.
2. Nehmen Sie die aliquotierten Proben einzeln heraus und geben Sie 1 ml des vorgekühlten Extraktionsgemisches zu jedem Probenröhrchen hinzu. Achtung: Führen Sie diesen Schritt schnell durch die niedrige Viskosität von MTBE durch.
3. Mischen Sie sofort auf einen Vortex-Mischer, bis das Gewebe innerhalb der Extraktionsmischung gut homogenisiert ist.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist sehr wichtig, da es erforderlich ist, die Proteine ​​auszufällen und ihre enzymatischen Aktivitäten zu inaktivieren.
4. Inkubieren Sie alle Proben auf einem Orbitalschüttler bei 100 U / min für 45 min bei 4 ° C.
5. Sonden Sie die Proben für 15 min in einem eisgekühlten Beschallungsbad.

6. Fraktionierung durch Phasentrennung

1. Füge 650 μl H ₂ O: MeOH (3: 1, vol / vol) zu jedem Probenröhrchen hinzu.
2. Mischen Sie gut durch Vortexen für 1 min.
3. Die Proben mit einer Geschwindigkeit von 20.000 x g für 5 min bei 4 ° C zentrifugieren.
   HINWEIS: Nach diesem Schritt gibt es zwei unmischbare flüssige Phasen mit einem festen Pellet im Boden des Röhrchens.
   Achtung: Die Rohre sorgfältig behandeln, um das Mischen der beiden flüssigen Phasen zu vermeiden und das ausgefällte Pellet zu vermeiden.

7. Aliquotierung von polaren und hydrophoben Fraktionen

1. Übertragen Sie 500 μl des Lösungsmittels aus der oberen, lipidhaltigen Phase in ein markiertes 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Die aliquotierten Lipidproben können direkt zur sofortigen UPLC-MS-Analyse konzentriert werden (Schritt 8.1) oder mehrere Wochen bei -80 ° C gelagert werden.
2. Sobald die 500 μl aus der Probe entfernt wurden, entfernen Sie die verbleibende Lipidphase mit einer 200 μl Pipette.
3. Übertragen Sie 400 μl des Lösungsmittels aus der unteren Phase (polare und halbpolare Metaboliten) in ein markiertes 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Die aliquotierten Polarproben können direkt zur sofortigen UPLC-MS-Analyse konzentriert werden (Schritt 8.2) oder gelagert werdenR mehrere Wochen bei -80 ° C.
4. Nehmen Sie ein zusätzliches Aliquot von 200 μl, um eine zusätzliche Analyse durchzuführen, z. B. Gaschromatographie-basierte Metabolitanalyse, wie es kostbar beschrieben ist.
5. Entfernen Sie den Rest der wässrigen Phase durch Abpumpen des überschüssigen Volumens.
6. Waschen des erhaltenen Proteins, Stärke, Zellwandpellets mit 500 μl Methanol durch gründliches Vortexen für 1 min.
7. Die Proben mit einer Geschwindigkeit von 10.000 x g für 5 min bei 4 ° C zentrifugieren.
8. Führen Sie die Proteinextraktion und den Verdau (Schritt 11) oder die Stärke / Zellwandanalyse wie zuvor beschrieben durch.
   HINWEIS: Wenn nicht sofort verwendet, können diese Pellets für mehrere Wochen bei -80 ° C gelagert werden.

8. Konzentration und Lagerung von Fraktionen

1. Verdampfe das Lösungsmittel aus Lipidproben (aus Schritt 7.1) entweder in einem Vakuumkonzentrator ohne Erhitzen (für 1-2 Stunden) oder vorzugsweise ein NitrDurchflussverdampfer zur Vermeidung oxidativer Modifikationen der Lipide.
   HINWEIS: Getrocknete Proben sollten sofort analysiert werden. Zur Aufbewahrung von Proben in MTBE-Lösung, idealerweise in Glasfläschchen (Schritt 7.1).
2. Verdampfe das Lösungsmittel aus den wässrigen Proben (ab Schritt 7.3 oder 7.4) über Nacht in einem Vakuumkonzentrator ohne Erwärmung. HINWEIS: Die getrockneten Proben können für mehrere Wochen bei -80 ° C vor der Analyse gelagert werden.

9. Analyse der Lipide mit UPLC-MS ²⁴

1. Die getrockneten Lipidfraktionen (aus Schritt 8.1) in 400 μl Acetonitril: 2-Propanol (7: 3, vol / vol) erneut suspendieren.
2. Übertragen Sie genügend Flüssigkeit in Glasfläschchen und Kappe fest.
3. Setzen Sie die Glasfläschchen in einen gekühlten Autosampler (4 ° C).
4. 2 μl pro Probe injizieren und die Lipide auf einer Umkehrphase (RP) C ₈ -Säule, die bei 60 ° C gehalten wird, unter Verwendung eines UPLC-Systems, das mit einer Flussrate von 400 & mgr; l / min läuft, trennen.
5. Benutze das HandyPhasen, die in Tabelle 1 für die chromatographische Trennung beschrieben sind.
6. Erfassen Sie die Massenspektren im positiven und negativen Ionisationsmodus mit einem geeigneten MS-Instrument, das den Massenbereich zwischen 150 und 1.500 m / z abdeckt.

10. Analyse von polaren und semipolaren Metaboliten mit UPLC-MS ²⁵ .

1. Die polare Phase (ab Schritt 8.2) in 200 μl UPLC-Klasse Methanol: Wasser (1: 1, vol / vol) erneut suspendieren.
2. Übertragen Sie genügend Flüssigkeit in Glasfläschchen und Kappe fest.
3. Setzen Sie die Glasfläschchen in einen gekühlten Autosampler (4 ° C).
4. 2 & mgr; l von jeder Probe injizieren und die Metaboliten auf einer RP C ₁₈ -Säule, die bei 40 ° C gehalten wird, unter Verwendung eines UPLC-Systems, das mit einer Flussrate von 400 & mgr; l / min läuft, trennen.
5. Verwenden Sie die mobilen Phasen für die chromatographische Trennung mit den in Tabelle 2 angegebenen Parametern.
6. Erwerben Sie vollständige Scan-Massenspektren im positiven und negativen IonisationsmodusEin geeignetes Massenspektrometer mit einem Massenbereich zwischen 50 und 1.500 m / z.

11. Protein Extraktion, Verdauung und Analyse ¹⁶

1. Das gewaschene Protein / Stärke / Zellwandpellet (ab Schritt 7.8) in 200 μl des Proteinextraktionspuffers der Wahl erneut suspendieren. Anmerkung: Wir verwenden Harnstoff / Thioharnstoffpuffer (5 M Harnstoff, 2 mM Thioharnstoff, 15 mM DTT, 2% CHAPS und Protease und Phosphataseinhibitoren) ²⁷ .
2. Sonden Sie die Proben für 10 min in einem eisgekühlten Schallbad.
3. Inkubieren Sie die Proben für 30 min auf einem Orbitalschüttler (100 U / min) bei Raumtemperatur.
4. Zentrifugieren der gelösten Proteine ​​bei 10.000 x g für 5 min.
5. Sammle den Proteinüberstand in einem neuen Röhrchen.
6. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration aus dem gesammelten Überstand ²⁸ .
7. 50 μg Protein in-Lösung mit einem Protokoll der Wahl verdauen. Verwenden Sie typischerweise die Trypsin / Lys-C-MischungNg zur Bedienungsanleitung.
8. Nach der Verdauung die Entsalzung der Peptide vor der Massenspektrometrie unter Verwendung von C ₁₈ -Stufentests durchführen und die verdauten Peptide ²⁹ eluieren.
9. Konzentrieren Sie die Proben in nahezu Trockenheit in einem Vakuumkonzentrator ohne Erwärmung.
10. Die Proben in einem geeigneten Beladungspuffer (z. B. 5% Acetonitril, 0,5% Ameisensäure) erneut suspendieren und die Peptidmischungen durch LC-MS / MS unter Verwendung eines hochauflösenden Massenspektrometers, das mit einem Nano-LC-System verbunden ist, analysieren.
    HINWEIS: In dem beispielhaften Proteomik-Datensatz, der in diesem Protokoll vorgestellt wurde, verwendeten wir einen Gradienten, wie in Tabelle 3 beschrieben.
11. Stellen Sie das Massenspektrometer mit einer Top-15-Strategie ein, bei der ein voller Scan (FS) bis zu 15 datenabhängige MS / MS-Scans verfolgt wurde, auf folgende Parameter: Der FS lag im Massenbereich von 200 - 2.000 m / z an Eine Auflösung von 70.000 mit einem Zielwert von 3x10 ⁶ Ionen. Erhalten Sie die datenabhängigen MS / MS-Scans von höheremKlinische Dissoziation (HCD). Setzen Sie die Zielwerte für die MS / MS auf 1e ⁵ Ionen mit einer maximalen Ionenfüllzeit von 50 ms, einem Isolationsfenster von 4,0 m / z, einer normalisierten Kollisionsenergie (NCE) von 30% und einem Unterfüllungsverhältnis von 1%. Messen Sie die MS / MS-Ionen mit einer Auflösung von 17.500 und der dynamische Ausschluss wurde auf 60 s gesetzt.

Ergebnisse

Umfassende multimediale Datensätze sind für das Verständnis komplexer biologischer Systeme von unschätzbarem Wert. Die Strategie für ein erfolgreiches biologisches Experiment beginnt in der Regel von einem sinnvollen experimentellen Design, Experimentaufbau und Performance, gefolgt von Probenahme, Extraktion, analytische Datenerfassung, Rohdatenverarbeitung, statistische Datenanalyse, Identifizierung relevanter Metaboliten und biologischer Dateninterpretation Einschließlich Wegweiser und Visualisierung (Abbildung 1 ).

In dem hier vorgestellten Extraktionsprotokoll konzentrieren wir uns auf die Stichproben-, Handling- und -Extraktionsschritte, die in der detaillierten Workflow-Übersicht in Abbildung 2 dargestellt sind. Zu Demonstrationszwecken wurden 50 mg Arabidopsis-Blattgewebe ausgewählt. Dieses Material wurde geerntet, geschliffen und extrahiert, bevor es drei ausgesetzt wurdeBeispielhafte analytische UPLC-MS-Plattformen, die Daten liefern, die für gezielte und ungezielte lipidomische, metabolomische und proteomische Analysen genutzt werden können. Die Fig. 2 und 6 enthalten zusätzlich repräsentative Bilder, wie unter Standardbedingungen das Extraktionslösungsmittel aussehen sollte. Zusätzlich werden Beispiele von Proben, die übermäßige Mengen an ausgefällten Makromolekülen (Proteine ​​und Stärke) und Proben mit ungeeigneter Probenhomogenisierung enthalten, gezeigt (Abbildung 3 ). Die Fehlersuche für diese beiden gemeinsamen Probleme ist in Abbildung 3 kurz dargestellt, aber es wird auch in unserer früheren Publikation näher erläutert.

Die Fig. 4 und 5 beschreiben Beispiele von drei analytischen Chromatogrammen, die aus dem Lipid, dem Polar / SemI-polare Metaboliten und Proteinanalysen. Lipide, die aus der oberen MTBE-Phase (Abbildung 2 ) entnommen wurden, wurden durch Umkehrphasen- (RP) C _8- Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie analysiert, die mit einer hochauflösenden Massenspektrometrie gekoppelt war. Lipide können mit positiven und negativen MS-Ionisationsmodi (Abbildung 4 , obere Scheibe) ^{16 , 24 gewonnen werden} .

Polare und halbpolare primäre und sekundäre Metaboliten wurden aus der polaren (Wasser / Methanol) Phase (Abbildung 2 ) durch Umkehrphase (RP) C ₁₈ UPLC-MS ²⁵ analysiert. Das dargestellte Verfahren, das die Umkehrphasenchromatographie verwendet, ist in hohem Maße kompatibel zur Analyse von halbpolaren Metaboliten (nämlich Metaboliten aus dem sekundären Stoffwechsel), die mit positiven und negativen Ionisationsmodi in der MS analysiert werden können( Abbildung 4 , untere Scheibe) ¹⁶ . Mehr hydrophile Metaboliten aus dieser Fraktion (Zucker, polare Aminosäuren etc.), die keine gute Retention auf dem umgekehrten Phasenmaterial zeigen, können durch andere analytische Methoden wie GC-MS ¹⁶ oder hydrophile Wechselwirkungs-Flüssigkeitschromatographie ³⁰ analysiert werden.

Die Proteine, die aus dem festen Pellet im Boden des Extraktionsröhrchens ( Fig. 2 ) gewonnen wurden, wurden in der Lösung verdaut und unter Verwendung der Schrotflinte LC-MS ( Fig. 5 ) analysiert, während das Protokoll für die Extraktion von Stärke und Zellwand Material kann aus unserem bisher veröffentlichten Protokoll ^{16 gewonnen werden} .

Zusammenfassend zeigten sich mehr als 200 Lipidarten, 50 annähernd halbpolare Metaboliten und mehrere tausend ProteiNs können routinemäßig aus Proben des in unserem Beispiel verwendeten Typs identifiziert werden. Zusätzlich zeigte das Verfahren eine breite Anwendbarkeit unter Verwendung verschiedener Gewebe, Organe und Zellkulturmaterial ( 6 ).

Abbildung 1: Allgemeiner Workflow für Großmaßstab Ungezielte Omics-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2 : Probenvorbereitung und Extraktions-Workflow zur Analyse von Lipiden, Metaboliten und Proteinen aus einem einzigen Aliquot einer biologischen Probe.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3 : Beispielhafte Beispiele für häufig beobachtete Probleme mit zweiphasigen Partitionierungs-Extraktionsprotokollen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4 : Repräsentative Chromatogramme von Lipid- und Semipolmetaboliten aus Arabidopsis thaliana-Blätterextrakten . Basis-Peak-ChromatogrammS von Lipiden (oberer Scheibe) und halbpolaren Metaboliten (untere Scheibe), die im positiven Ionisationsmodus analysiert wurden ¹⁶ . Die Kreisdiagramme in der oberen rechten Ecke jedes Chromatogramms zeigen die Anzahl der identifizierten Lipide und Metaboliten, die verschiedenen chemischen Klassen zugeordnet sind. Chl, Chlorophylle; DAG, Diacylglycerid; DGDG, Digalactosyldiacylglycerin; FA, Fettsäure; LysoPC, Lysophosphatidylcholin; MGDG, Monogalactosyldiacylglycerin; PC, Phosphatidylcholin; PE, Phosphatidylethanolamin; PG, Phosphatidylglycerin; PI, Phosphatidylinositol; PS, Phosphatidylserin; SP, Sphingolipid; SQDG, Sulfoquinovosyldiacylglycerin; TAG, Triacylglycerid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5 Trong>: Repräsentatives Basis-Peak-Chromatogramm von Peptiden aus Arabidopsis thaliana-Blätterextrakten .
Das Kreisdiagramm zeigt in der oberen rechten Ecke die Anzahl der identifizierten Proteine, die verschiedenen biologischen Prozessen zugeordnet sind ¹⁶ . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6 : Repräsentative Extraktionsbeispiele für verschiedene Gewebetypen aus Wildtyp- Arabidopsis thaliana .
Alle Proben wurden mit 50 mg Frischgewicht aus den angegebenen Geweben extrahiert."> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Zeit (min)	% Puffer A zu Puffer B
0 bis 1 min	45% A	Puffer A: 1% 1M NH4-Acetat, 0,1% Essigsäure in UPLC MS-Wasser
1 bis 4 min	Linearer Gradient von 45% A bis 25% A	Puffer B: 1% 1M NH4-Acetat, 0,1% Essigsäure in Acetonitril / Isopropanol 7: 3, (v: v)
4 bis 12 min	Linearer Gradient von 25% A bis 11% A	Durchflussrate 400 μl / min
12 bis 15 min	Linearer Gradient von 11% A bis 0% A	Einspritzvolumen 2 μl
15 bis 19,5 min	Die Säule für 4,5 min mit 0% A waschen
19,50 bis 19,51 min	Zurück zu 45% A
19,51 bis 24 min	Equilibrieren mit 45% A

Tabelle 1: Gradientenparameter für RP-UPLC Trennung von Lipiden RP, umgekehrte Phase. UPLC, Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie.

Zeit (min)	% Puffer A zu Puffer B
0 bis 1 min	99% A	Puffer A: 0,1% Ameisensäure in UPLC-Grad Wasser
1 bis 11 min	Linearer Gradient von 99% A bis 60% A	Puffer B: 0,1% Ameisensäure in UPLC-Acetonitril
11 bis 13 min	Linearer Gradient von 60% A bis 30% A	Durchflussrate 4001; L / min
13 bis 15 min	Linearer Gradient von 30% A bis 1% A	Einspritzvolumen 2 μl
15 bis 16 min	Die Säule 1 min mit 1% A waschen
16 bis 17 min	Linearer Gradient von 1% A bis 99% A
17 bis 20 min	Äquilibrieren für 3 min bei 99% A

Tabelle 2: Gradientenparameter für die RP-UPLC-Trennung von polaren und semipolaren Metaboliten. RP, umgekehrte Phase. UPLC, Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie.

Zeit (min)	% Puffer B zum Puffer A
0 bis 5 min	Linearer Gradient von 0 bis 10%	Puffer A: 0,1% Ameisensäure in UPLC-Grad Wasser
5 bis 80 min	Linearer Gradient von 10% bis 40%	Puffer B: 0,1% Ameisensäure in 60% Acetonitril der UPLC-Klasse
80 bis 85 min	Linearer Gradient von 40% bis 60%	Durchflussmenge 300 nL / min
85 bis 86 min	Linearer Gradient von 60% bis 95%	Einspritzvolumen 5 μl
86 bis 91 min	Säule für 5 min mit 95%
91 bis 92 min	Linearer Gradient von 95% bis 0%
93 bis 110 min	Äquilibrieren Sie die Säule für 17 min bei 0%

Tabelle 3: Gradientenparameter für die Nano-LC-Trennung von Peptiden LC, Flüssigchromatographie.

Diskussion

In diesem Artikel beschreiben und illustrieren wir ein einfaches und hoch anwendbares Extraktionsprotokoll für eine umfassende lipidomische, metabolomische und proteomische Analyse aus einer einzigen 50 mg Blattprobe. Die Methode wurde bisher in mehreren Studien verwendet, die in verschiedenen Artikeln ^{17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 veröffentlicht wurden} Und erwies sich, zusätzlich zu seinem geradlinigWorkflow und hohe Anwendbarkeit robust und reproduzierbar.

Die hier bereitgestellten Anwendungen zeigen einige Routineverfahren für das anfängliche Screening einer komplexen biologischen Probe. Diese veranschaulichten metabolomischen und lipidomischen Datensätze können umfangreiche Informationen über die breiten oder spezifischen Veränderungen des Stoffwechsels des analysierten biologischen Systems liefern, während die aus der Analyse von Proteinen gewonnenen Daten Einblicke in die quantitativen (Fülle) und qualitativen (Modifikationen) liefern ) Veränderungen von Enzymen, Strukturproteinen oder Transkriptionsfaktoren (TFs), die zelluläre Funktionen und Maschinen steuern. Dementsprechend haben integrative Omikendaten das Potenzial, erste Informationen über mögliche Veränderungen, die durch genetische oder biotische und / oder abiotische Störungen eines biologischen Systems induziert werden, zu offenbaren, indem molekulare Veränderungen verschiedener Moleküle, die mit spezifischen Stoffwechselwegen oder zellulären Prozessen assoziiert sind, aufgeklärt werden.

Na sicherLangfristig ist es für eine erfolgreiche systembiologische Analyse von grundlegender Bedeutung, die Anzahl der analysierten und kommentierten molekularen Einheiten zu maximieren und so die Überwachung von zellularen Funktionen und Aktivitäten möglichst vollständig zu ermöglichen. Zu diesem Zweck können die erhaltenen Fraktionen zusätzlich zu verschiedenen analytischen Methoden angewendet werden, wobei auf weitere Verbindungen oder Verbindungsklassen geachtet werden (Abbildung 4 ).

Dabei ist zu erwähnen, dass die globale Analysestrategie der gewonnenen Daten durch zwei verschiedene Strategien verfolgt werden kann: Einerseits haben wir die Aufklärung zellulärer Funktionen durch Quantifizierung bekannter Verbindungen hervorgehoben. Auf der anderen Seite sind viele der gemessenen Metaboliten und Lipide noch nicht bekannt oder kommentiert. Diese noch nicht kommentierten zusammengesetzten Messungen enthalten auch viele aussagekräftige Informationen, die durch statistische Methoden zur Klassifizierung oder Diskriminierung genutzt werden können. BZwischen Gruppen oder Behandlungen ^{20 , 21 , 22} .

Dennoch müssen diese unbekannten Verbindungen, insbesondere diejenigen, die für die Gruppenklassifizierung relevant sind oder als Biomarker dienen, identifiziert werden. Dieser Identifikationsvorgang ist leider recht mühsam und kann ohne zusätzliche analytische Messungen oder Strategien nicht erreicht werden ³⁸ . Wie aus Fig. 4 ersichtlich ist, ist die Anzahl der nicht annotierten Verbindungen ziemlich hoch (eigentlich die überwiegende Mehrheit). Dennoch können diese chromatographischen Peaks, wie oben erwähnt, innerhalb der Datenanalyse gehandhabt werden, und daher können signifikant beeinflusste Entitäten aufgeklärt und weiteren Identifikationsstrategien unterworfen werden.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass das hier eingeführte Protokoll mehrere Vorteile für die experimentelle Systembiologie sowie für klassische statistische Anwendungen bietetAtions

Zunächst wird, da alle Fraktionen aus einer einzigen Probe extrahiert werden, die Variation zwischen den verschiedenen experimentellen Datensätzen (Lipide, Metaboliten, Proteine) signifikant reduziert, da jeder Datensatz aus dem gleichen Probenaliquot abgeleitet wird. Dies führt eindeutig zu einer erhöhten Vergleichbarkeit der erzielten Ergebnisse.

Zweitens ist das Verfahren leicht skalierbar und macht es daher sehr kompatibel mit kleinen bis großen Probenmengen. Wir verwenden routinemäßig 10-100 mg Gewebeproben, aber erfolgreiche lipidomische Studien wurden auch auf so wenig wie 20 Arabidopsis Samen durchgeführt ³¹ . Vor allem die Kompatibilität mit kleinen Probenmengen macht dieses Verfahren anwendbar, wenn begrenzte Mengen an biologischen Geweben oder Proben verfügbar sind. Dennoch, auch wenn genügend Probenmaterial vorhanden ist, bietet die hier vorgestellte Methode den Vorteil, diese Proben in einer größeren Anzahl von experimentellen Replikaten anstelle von u zu nutzenSingen sie für verschiedene Extraktionsverfahren. Dies ermöglicht eine bessere und verfeinerte statistische Datenanalyse.

Drittens stellt das Verfahren, da das Verfahren auf einer Flüssig-Flüssig-Fraktionierung von polaren und nichtpolaren Molekülen basiert, im Gegensatz zu einfachen Einphasenextraktionsverfahren ( z. B. Methanol-Extraktionen) einen signifikanten dekomplexierenden Schritt im Verfahren dar. Diese effiziente Probenentkomplexierung führt zu einer partiellen Reinigung der einzelnen Fraktionen aufgrund der Trennung von chemisch interferierenden Molekülen voneinander. Dementsprechend bietet der chemische Partitionierungsprozess nicht nur einen praktischen Vorteil für die systematische Aliquotierung der extrahierten Proben in verschiedene chemische Klassen, sondern verbessert auch die einzelnen analytischen Messungen, da sie kontaminierende Verbindungen aus den verschiedenen Fraktionen entfernt. Klar können wir beobachten, dass vor allem die Lipide, die auf die organische Phase aufgeteilt sind und die sich meist negativ beeinflussenChromatographische Analyse von polaren Verbindungen, wird nahezu vollständig aus der polaren Fraktion fehlen. Das gleiche gilt für die Analyse der hydrophoben Lipide, die an den polaren Verbindungen abgebaut werden. Neben der Reinigung von polaren und unpolaren Verbindungen auseinander entleeren und sammeln wir Proteine ​​und andere Makromoleküle aus der Probe, die nicht nur eine separate Fraktion liefert, die für die Protein-, Stärke- und Zellwandanalyse ¹⁶ genutzt werden kann, sondern auch Führt zu einer saubereren Probe innerhalb der einzelnen Fraktionen. Dies ist besonders relevant, da bekannt ist, dass das Vorhandensein großer Makromoleküle zu einer Beschädigung oder zumindest einer kürzeren Lebensdauer der analytischen Säulen führt.

Last but not least wurde die beschriebene MTBE-Extraktionsmethode, die auf dem weniger gefährlichen und günstigeren Chloroform-Ersatzlösungsmittel ¹⁵ beruht, bereits in mehreren Studien aus unserer Gruppe gezeigt worden, um weit verbreitet zu seinIcability für verschiedene biologische Proben aus Pflanzen ¹⁶ , Algen ^{17 , 18} , Fliegen ^19, aber auch mehrere Säugetiergewebe, Organe oder Zellen ^{20 , 21 , 22} .

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and standards
Ampicillin	Sigma Aldrich	A9393-5G	Internal standard for metabolites
Corticosterone	Sigma Aldrich	27840-500MG	Internal standard for metabolites, HPLC grade
13C Sorbitol	Sigma Aldrich	605514	Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC)	Avanti Polar Lipids	850360P	Internal standard for lipids
Methanol (MeOH)	Biosolve Chemicals	13684102	ULC-MS grade
Water	Biosolve Chemicals	23214102	ULC-MS grade
Methyl tert-butyl ether (MTBE)	Biosolve Chemicals	13890602	HPLC grade
Trypsin/Lys-C mix	Promega	V5072	Enzymatic digestion of proteins
Equipment
Balance	Sartorius Corporation	14 557 572
Tissue grinding mixer mill	Retsch, Mixer Mill MM 300	20.746.0001
Mortar and pestle	Sigma Aldrich	Z247464-1EA
Vortex mixer	Vortex-Genie 2, Model G560	SI-0236
Vacuum concentrator	Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators	7.008.500.002
2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes	Eppendorf	30120094	Used for sample extarction
1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes	Eppendorf	30120086	Used for fractions
Shaker	Eppendorf Thermomixer 5436	2050-100-05
Sonicator	USC 300 TH	142-0084
Refrigerated microcentrifuge	Eppendorf, model 5427R	22620701
UPLC system	Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK)
MS system	Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Germany).
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm × 2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles)	Waters, Machester, UK	186002878	Analysis of lipids
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm × 2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles)	Waters, Machester, UK	186003539	Analysis of metabolites
Q ExactivePlus high resolution mass spectrometer connected to an EASY-nLC 1000 system	Thermo-Fisher, Bremen, Germany		Analysis of peptides