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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für die Anwendung von Rhodamin 123 zu identifizieren das mitochondriale Membranpotential (MMP) und CLIC4 Zuschlag-induzierte HN4 Zelle Apoptosis in-vitro-Studie. Unter gemeinsamen Fluoreszenzmikroskop und konfokale Laser scanning Fluoreszenzmikroskop war die Änderung des Echtzeit-die MMP aufgezeichnet.

Zusammenfassung

Erschöpfung des mitochondrialen Membranpotentials (MMP, ΔΨm) gilt als das früheste Ereignis in der Apoptose-Kaskade. Es kommt sogar vor nuklearen apoptotische Merkmale, einschließlich der Chromatin-Kondensation und DNA-Bruch. Sobald der MMP zusammenbricht, zellapoptose irreversibel einleiten werden. Eine Reihe von lipophilen kationischen Farbstoffen kann durch die Zellmembran passieren und Aggregieren innerhalb der Matrix der Mitochondrien und dienen als Fluoreszenz Marker, MMP Veränderung zu bewerten. Als eines der sechs Mitglieder der CL– intrazelluläre Kanal (CLIC) Familie beteiligt CLIC4 Apoptotic zellprozess vor allem durch den mitochondrialen Weg. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der MMP durch monitoring der Fluoreszenz Fluktuation von Rhodamin 123 (Rh123), durch die wir, Apoptose induziert durch CLIC4 Zuschlag studieren. Wir diskutieren die Vorzüge und Grenzen der Anwendung der konfokalen Laser-scanning- und normal Fluoreszenzmikroskop im Detail und auch mit anderen Methoden vergleichen.

Einleitung

Rh123 ist ein kationischen Fluoreszenz-Farbstoff, dient als Indikator für transmembranen Potenzial. Rh123 ist in der Lage, die Zellmembran durchdringen und die Eingabe der mitochondrialen Matrix abhängig von der Potentialdifferenz von innerhalb und außerhalb der Membran-1. Apoptose führt um zu Schäden der Mitochondrien-Membran Integrität. Die Mitochondrium Permeabilität Übergang Pore (MPTP) öffnet und zum Zusammenbruch des MMP, wodurch wiederum die Freisetzung von Rh123 an der Außenseite der Mitochondrien führen. Zu guter Letzt wird stärkeres Signal grün fluoreszieren unter Fluoreszenzmikroskop erkannt werden. Es ist gut dokumentiert, dass die Erschöpfung der MMP und erhöhten Membranpermeabilität sind frühe Anzeichen von Zelle Apoptosis2. Daher kann Rh123 auf die Erkennung von MMP-Änderung und dem Auftreten von zellapoptose angewendet werden.

Als die 6. häufigste Karzinom in der Welt verschlechtert Kopf-und halskrebs stark eine Person Gesundheit3. Obwohl viele Ansätze in den letzten Jahren entwickelt wurden, ist klinische Ergebnisse der Behandlung von Patienten mit Kopf- und Halsbereich Squamous Zelle Krebsgeschwür (lokal) noch nicht ideal4. Erkundung neue Therapiemethoden kann die Behandlung für lokal5verbessern. Ionenkanäle, die mit zahlreichen biologischen Prozessen anzeigen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von verschiedenen Krebsarten6 Teilweise oder vollständige Teilnahme der Cl– Kanäle sind sehr verschiedene Eigenschaften der neoplastischen Transformation einschließlich aktive Migration, hohe Rate der Verbreitung und Invasivität beteiligt. Vor diesem Hintergrund wurde die CLIC, ein neuartiges Protein-Familie, als eine viel versprechende Klasse von therapeutischen Ziele für Krebs Behandlung6,7aufgeführt. Neuere Studien haben gezeigt, die Mitglieder der CLIC-Familie, einschließlich CLIC1, CLIC4 und CLIC5, zu lokalisieren, zu kardialen Mitochondrien und reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-Niveau hochreguliert durch CLIC5, zeigt die funktionale Rolle der mitochondrialen befindet sich Cl - in der Apoptotic Antwort8Kanäle. CLIC4, ein Mitglieder der CLIC-Familie (auch bekannt als MtCLIC, P64H1 und RS43), wurde weitgehend für seine Apoptotic Verordnung Eigenschaften in Krebszellen und subzelluläre Lage einschließlich Golgi, endoplasmatische Retikulum und Mitochondrium beim Menschen untersucht Keratinozyten7,9,10. Das Expressionsprofil des CLIC4 wurde von Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), P53 und äußeren Reiz geregelt. Überexpression und Downregulation der CLIC4 auslösen eine apoptotische Reaktion vor allem durch den mitochondrialen Weg begleitet mit dem Ungleichgewicht von Bcl-2 Familie Mitglieder, Aktivierung der Caspase-Kaskade und Freisetzung von Cytochrom C11, 12 , 13. daher MMP Messung ist entscheidend für die CLIC4 im Zusammenhang mit Apoptose zu erkunden und Rh123 dient als Indikator ideale Fluoreszenz.

Die vorliegende Studie beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Detektion von MMP CLIC4 Zuschlag-induzierten Apoptose in HN4 Zellen zu studieren. Rh123 wird als Fluoreszenz Sonde verwendet, um die Änderung der MMP zu beobachten. Unter gemeinsamen Fluoreszenzmikroskop und konfokale Laser scanning Fluoreszenzmikroskop kann die Echtzeit-Schwankung der MMP gelöst werden. Wir diskutieren die Vorzüge und Grenzen der Anwendung der konfokalen Laser-scanning Fluoreszenzmikroskop im Detail und auch mit anderen Methoden vergleichen. Dieses Protokoll kann auch auf andere Apoptose-bezogene Studien angewendet werden.

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Protokoll

(1) Zell-Kultur und Transfektion

  1. Zellkultur
    Hinweis: HN4, ein lokal-Zell-Linie wurde von Patienten mit lokal14abgeleitet.
    1. Kultur HN4 Zellen in der Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM, 4,5 g/L Glukose) mit 10 % fötalen Rinderserum und Antibiotika (100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin) ergänzt. Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2Zellen.
  2. Zelle Transfektion
    1. Einen Tag vor Transfektion, Platte 5 x 105 Zellen in 2 mL/auch von Kulturmedium ohne Antibiotika in 6-Well Platten.
    2. Verdünnen Sie 100 Pmol CLIC4 SiRNA oder Rührei SiRNA in 250 µL reduzierte Serum Medien, sanft. 5 µL Liposomen Reagenz in 250 µL reduzierte Serum-Medien zu verdünnen und 5 min. kombinieren die verdünnte SiRNA mit dem verdünnten Liposomen-Reagenz inkubieren, vorsichtig mischen und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Fügen Sie die Mischung auf jeweils gut Zellen und Medium. Mischen Sie leicht von der Platte hin und her schaukeln. Inkubation der Zellen bei 37 ° C in einem CO-2 -Inkubator für 24 h vor dem Fortfahren mit der folgenden Rh123 Kennzeichnung Verfahren. Ersetzen Sie das Medium mit normalen Wachstumsmedium 4 h nach Transfektion.

2. Rh123 Kennzeichnung

Hinweis: Rh123 wurde eingesetzt, um die MMP in HN4 Zellen1messen.

  1. Verwenden Sie nach CLIC4 SiRNA Behandlung (Abschnitt 1) HN4 Zellen in 6-Well-Platten für die folgende Behandlung. Die Menge an HN4 Zellen in jedem ist gut genug, um das Experiment auf Deckgläsern 10mal wiederholen.
  2. Benutzen Sie eine Pinzette, kreisförmige Deckgläsern auf der Unterseite des neuen 12-Well-Platten setzen. Die Anzahl der Platten wird entsprechend den Versuchsplan (Abb. 1A) festgelegt.
  3. Legen Sie 150 µL 100 µg/mL Polylysin mittig auf jeder Deckglas innerhalb der 12-Well-Platten und warten Sie 2 min. Achten Sie darauf, nicht Polylysin außerhalb der Deckgläsern. Dann die Polylysin von Pipette gründlich entfernen (Abbildung 1B).
  4. Entfernen Sie das Kulturmedium HN4 Zellen im Inneren der Schale zu und fügen Sie 1 mL 0,25 % Trypsin um die Zellen zu lösen. Fügen Sie nach 6 min 2 mL Kulturmedium um die Trypsin zu neutralisieren. Mischen Sie vorsichtig die HN4 Zellen durch die Pipette für 5mal und Samen 2-6 х 104 Zellen auf die kreisförmige Deckgläsern. Legen Sie in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 (Abbildung 1C).
  5. Inkubieren Sie nach 8 h Inkubation die HN4 Zellen mit 2 µmol/L Rh123 für 40 min bei 37 ° c Mischen Sie vorsichtig die mittlere wechselvollen mehrmals, um gleichmäßige Verteilung der Rh123 im Medium (Abbildung 1D) zu gewährleisten.
  6. Bereiten Sie genügend normaler physiologischer Kochsalzlösung (NPSS); NPSS (in Mmol/L) zu: 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl21 CaCl2, 10 Glukose und 5 HEPES pH 7.4). Heizen Sie auf 37 ° C in einem Wasserbad vor.
  7. Benutzen Sie eine Pinzette entfernen die Deckgläsern und waschen Sie die verbleibende Flüssigkeit über kurz Platzierung der Deckgläsern in den vorgeheizten NFB-Puffer (Abbildung 1E).
  8. Legen Sie die Deckgläsern auf der Unterseite der 500 µL Edelstahlkammer (siehe Tabelle der Materialien) mit einem austauschbaren 25 mm Glasboden Deckglas in Platz durch einen o-Ring versiegelt. Durch das Anziehen der Deckel der Kammer (Abbildung 1E) zu beheben.
  9. Fügen Sie 450 µL NPSS Puffer an die versammelten Kammer vorgewärmt und legen das Bad unter dem Gesichtsfeld des Fluoreszenzmikroskop oder konfokale Laser-scanning Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 1E).

3. Erkennung der MMP

  1. Gemeinsamen Fluoreszenzmikroskop
    1. Schalten Sie die Fluoreszenzmikroskop nach den Anweisungen des Herstellers.
      Hinweis: Gemeinsame Fluoreszenzmikroskop gelang mit einer Quecksilber-Lampe Glasfaser Lichtquelle, FITC Filter set für Rh123 (480/40 Erregung Filter, 505 LP dichroitischen Spiegel und 535/40 Emission Filter) bei Raumtemperatur. 20 X Objektiv wurde verwendet, um live Cell Imaging durchzuführen.
    2. Öffnen Sie die Systemsoftware zur Abbilderstellung und wählen Sie die Schaltfläche "Neu" in der Befehlsleiste zu beginnen ein neues Experiment (Abb. 2A).
    3. Passen Sie das Gesichtsfeld und den Fokus auf die Position der Zellen in weißes Licht zu finden.
    4. Schalten Sie das Licht, und drücken Sie die Taste, weißes Licht zu schließen. Klicken Sie in der Befehlsleiste auf "Focus" und wählen Sie "Starten mit Schwerpunkt" schalten Sie die Fluoreszenz. Suchen Sie den Speicherort der Zellen wieder per Mikroskop mit einem 507 nm Anregung und 529 nm langen Pass Emission Wellenlänge (Set vor dem Experiment). Stellen Sie die Gesichtsfeld und den Fokus wieder (Abbildung 2B).
    5. Wählen Sie ein Gesichtsfeld mit nur 20 bis 30 getrennten HN4 Zellen. Die Änderung der intrazellulären Fluoreszenzsignal für jede Zelle wird genau aufgezeichnet werden.
    6. Sobald ein klares Sichtfeld erreicht ist, klicken Sie auf "Enge Fokussierung" von der Focus-Bar. Klicken Sie auf "Acq One" in der Befehlsleiste, eine Reihe von Bildern zu erwerben. Klicken Sie auf "Regionen" in der Befehlsleiste und klicken Sie auf "OK", um die Messung Regionen bearbeiten.
      Hinweis: Aus der Region bearbeiten Bar können verschiedene Region Formen je nach Studie verwendet werden.
    7. Angepasst für verschiedene Formen von Einzelzellen, wählen Sie das Werkzeug "Trace" und Kreisen der Region aus einer einzigen Zelle und klicken Sie doppelt, wenn Sie fertig sind. Wiederholen Sie die Prozedur, bis alle Zellen sind (Abbildung 2C) eingekreist. Klicken Sie auf "Fertig" und wählen Sie "Bilder speichern", um den Speicherort zu finden.
    8. Klicken Sie auf "Zeroclock"und schnell drücken Sie F4, um die Änderung der Fluoreszenzintensität Überwachung starten. Die Echtzeit-Datensatz ändern der Fluoreszenzintensität einmal alle 5 s für 5 min (Abbildung 2D).
    9. Wenn die Basislinie stabil wird, fügen Sie 50 µL NPSS gemischt mit 0,5 µL von 100 Mmol/L ATP an die Kammer per Pipette. Denken Sie daran, die Kammer um zu vermeiden, entfernen das Gesichtsfeld (Abb. 2E) nicht berühren.
      Hinweis: Die fluoreszenzbild wird für 20 Minuten aufgezeichnet werden und dann kann das Experiment am Ende per Handbetrieb. Die Zeitdauer ist routinemäßig für 20 min erledigt, um das ganze zu beobachten Fluoreszenz ändern. Allerdings ist Handbetrieb bis die Aufnahme beendet werden angewendet, wenn unerwartete Faktoren die Stabilität der Kurve oder beeinflussen wenn der gesamte Prozess weniger als 20 Minuten dauert.
  2. Konfokale Laser scanning Fluoreszenzmikroskop
    1. Schalten Sie die konfokale Laser-scanning Fluoreszenzmikroskop nach den Anweisungen des Herstellers, und öffnen Sie die mitgelieferte Software zu.
      Hinweis: Hier Rh123 war begeistert durch eine Argonlaser am 488 nm und das ausgegebene Signal wurde über den Bereich von 545-700 nm durch Anwendung der TD488/543/633 Filter aufgenommen.
    2. Klicken Sie auf "Ziel" im Menü "Acquire" 63 X auswählen / 1.4 Objektiv N.A Öl. Beobachte die Probe und finde ein klares Sichtfeld unter das Lichtfeld.
    3. Drücken Sie auf "TL/IL", um Fluoreszenz-Modus zu wechseln und wählen die richtige Fluoreszenz-Filter, die Position der Zelle unter Dunkelheit über Mikroskop zu finden. Drücken Sie "Auslöser" Probe zu schützen, wenn Beobachtung abgeschlossen ist.
    4. Stellen Sie unter dem Menüpunkt "Acquire" geeignete PMT-Kanal, und klicken Sie auf "Erreichen" aktivieren den sesshaften Strahlengang(Abbildung 3). Klicken Sie im Menü "Konfiguration" und wählen Sie "Laser", die benötigten Lasertyp zu bestimmen. "Argon" empfiehlt sich für dieses Protokoll (Abbildung 3B).
    5. Klicken Sie auf "Live" Echtzeit-Bild erhalten und sicherstellen, dass das Gesichtsfeld enthält nur 20 bis 30 getrennte HN4 Zellen. Die Änderung der intrazellulären Fluoreszenzsignal für jede Zelle wird genau aufgezeichnet werden.
    6. Wählen Sie "Xyt" im Akquisitionsmodus im Untermenü "Acquisition" im Menü "Acquire" (Abb. 3C). Legen Sie 5 s und 20 min für Zeit-Intervall und Dauer, jeweils. Klicken Sie auf"Apply" Wenn alle Parameter werden abgerechnet.
    7. Verwenden Sie unter dem Menüpunkt "Quantify" das "Polylinie zeichnen" Werkzeug um den Aufnahmebereich der einzelnen Zellen zu umrunden. Wählen Sie "Line Profile" und wählen Sie "Start", um die Beobachtung durchzuführen. Notieren Sie die Echtzeit-Änderung der Fluoreszenzintensität für 5 min (Abbildung 3-D - E).
    8. Wenn die Basislinie stabil wird, fügen Sie 50 µL NPSS gemischt mit 0,5 µL von 100 Mmol/L ATP an die Kammer per Pipette. Denken Sie daran, die Kammer um zu vermeiden, entfernen das Gesichtsfeld nicht zu berühren.
      Hinweis: Die fluoreszenzbild für 20 min aufgezeichnet werden und dann das Experiment abgeschlossen.

4. statistische Analyse

  1. Gemeinsamen Fluoreszenzmikroskop
    1. Schalten Sie die Fluoreszenzmikroskop routinemäßig nach der Bedienungsanleitung. Öffnen Sie die Systemsoftware zur Abbilderstellung und wählen Sie die Schaltfläche "Öffnen" in der Befehlsleiste, öffnen Sie eine gespeicherte Experiment. Klicken Sie auf "Regionen" von der "Befehlsleiste" und klicken Sie auf "OK"-Taste, um die Messung Regionen bearbeiten.
    2. Wählen Sie das Werkzeug "Trace" und Kreisen der Region aus einer einzigen Zelle und klicken Sie doppelt, wenn fertig. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Zellen eingekreist worden. Klicken Sie auf "Fertig" und wählen Sie die "F4: nach vorne"-Taste, um eine Ablaufverfolgung zeigt Fluoreszenzintensität zu erhalten.
    3. Sobald Sie fertig sind, klicken Sie auf den nach unten Pfeil befindet sich auf der unteren rechten Ecke des Diagramms und klicken Sie auf "Diagrammdaten anzeigen" (Abbildung 2F). Klicken Sie zweimal auf "OK" und wählen Sie die Schaltfläche "Log-Daten", die Datenverarbeitungs-Software-Schnittstelle zu öffnen. Klicken Sie erneut auf "Log-Daten" und finden Sie die Aufzeichnungen der Echtzeit-Schwankung der Fluoreszenzintensität auf dem Arbeitsblatt angezeigt.
      Hinweis: Für jede Zelle wurden Änderungen in MMP als das Verhältnis der Fluoreszenz im Verhältnis zu der Intensität vor der Anwendung von ATP oder TG (F1/F0) angezeigt. Jede Fluoreszenz-Intensität-Daten wurden im Durchschnitt von 20-30 Zellen. Daten für Rh123 sind als Mittelwert ± SE. Ergebnisse aus 2 Gruppen wurden durch die zweiseitige unabhängigen t -Test und P -Wert getestet präsentiert < 0,05 galt als statistische Signifikanz. Software zur statistischen Analyse wurde angewandt, um die statistischen Analysen in diesem Experiment durchzuführen.
  2. Konfokale Laser scanning Fluoreszenzmikroskop
    1. Schalten Sie das konfokale Laser-Mikroskop und loggen Sie sich in der mitgelieferten Software nach den Anweisungen des Herstellers.
    2. Wählen Sie "Feuer", eine aufgezeichnete Experiment zu öffnen.
    3. Wählen Sie das Werkzeug "Stack Profil" im Menü "Quantify", wählen Sie "All in one" von "Art Charts durch Kanäle und ROIs."
    4. Verwenden Sie das Tool "Draw Polygon" Kreis Zelle Regionen zur Beobachtung.
    5. Wählen Sie das Menü "Diagramm" und klicken Sie die Rechte Maustaste und wählen Sie "Export Excel" die Werte der Fluoreszenz Intensität zu einer Tabelle hinzufügen. Die folgende Analyse steht im Einklang mit normalen Fluoreszenz Mikroskope (Abbildung 3F).

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Ergebnisse

In der vorliegenden Studie wurde Rh123 angewandt, um die MMP zu erkennen. Zunächst wurden für die folgenden Fluoreszenz Färbung Experimente HN4 Zellen kultiviert. Pinzette wurden zur kreisförmige Deckgläsern unter 6-Well-Platten (Abb. 1A) zu legen. Die Deckgläsern wurden beschichtet mit Polylysin für 5 min und dann die Polylysin per Pipette (Abbildung 1B) entfernt. Dann HN4 Zellen wurden t...

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Diskussion

Es ist gut dokumentiert, dass Cl− Kanäle wesentlich bei der Aufrechterhaltung der Hämostase der internen Umwelt und spielen eine wichtige Rolle in der Zell-Proliferation und Apoptose15,16. Verständnis der Beziehung zwischen Ionen-Kanal gezielt eingreifen und Apoptose ist daher von großer Bedarf und Bedeutung, einen bessere therapeutische Ansatz für verschiedene Krebsarten17zu finden. Mitochondrien behalten Sie den normale...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken Herrn Chao Fang für die Zellkultur. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus der Natural Science Foundation of China (Grant Nr. 81570403, 81371284); Anhui Provinz Natural Science Foundation (Grant No. 1408085MH158); Herausragende junge Ermittler der medizinischen Universität Anhui; Rahmenprogramm für exzellente junge Talente an Universitäten der Provinz Anhui.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
HNSCC cellsATCCCRL-3241
PolylysineThermo Fisher ScientificP4981
Specific siRNA for human CLIC4BiomicsNM_013943(accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence
5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher ScientificL3000-015
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAXThermo Fisher Scientific51985-042
Rhodamine 123, FluoroPure gredeThermo Fisher ScientificR22420
Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose)Gibco11965-084
Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia OriginGibco10099141
Trypsin-EDTA SolutionBeyotimeC0201
Antibiotic-Antimycotic, 100XGibco15240062
Laser Scanning Confocal MicroscopyLeica Microsystems GmbHLEICA.SP5-DMI6000-DIC
Nikon Eclipse TE300 Inverted MicroscopeNikonN/A
Metaflour, V7.5.0.0Universal Imaging CorporationN/A
Leica application suite, v2.6.0.7266Leica Microsystems GmbHN/A
Microsoft office Excel 2007MicrosoftN/A
Sigma Plot 12.5Systat SoftwareN/A
Attofluor Cell ChamberThermo Fisher ScientificA7816

Referenzen

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