JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем подробный протокол для применения родамин 123 для выявления потенциальных митохондриальной мембраны (СПП) и изучения CLIC4 сногсшибательно индуцированной HN4 клеток апоптоз в пробирке. Под общим флуоресцентным микроскопом и конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресценции был записан в реальном времени изменение системы СПП.

Аннотация

Истощение митохондриальной мембраны потенциальных (СПП, ΔΨm) считается раннее событие в apoptotic Каскад. Это происходит даже впереди ядерных apoptotic характеристики, включая конденсацию хроматина и поломки ДНК. После того, как рушится ММП, апоптоз клеток будет инициировать необратимо. Ряда липофильных Катионные красители можно пройти через клеточные мембраны и агрегировать внутри матрицы митохондрий и служить флуоресценции маркер для оценки изменения ММП. Как один из шести членов семьи внутриклеточных канал (клик), Cl– CLIC4 участвует в процессе apoptotic клетки главным образом через Митохондриальные пути. Здесь мы описываем подробный протокол для измерения MMP через мониторинга флуоресценции колебания родамин 123 (Rh123), через который мы изучаем апоптоз, CLIC4 нокдаун. Мы обсудить преимущества и недостатки применения конфокальное лазерное сканирование и нормальной флуоресцентным микроскопом в деталях, а также сравнить его с другими методами.

Введение

Rh123 является красителя катионного флуоресценции, который служит индикатором для трансмембранного потенциала. Rh123 способна проникающим клеточной мембраны и ввода митохондриальной матрицы в зависимости от потенциального разница внутри и за пределами мембраны1. Апоптоз приводит к повреждению целостности митохондриальной мембраны. Митохондрии поры проницаемости перехода (MPTP) будет открыт и привести к краху системы СПП, которая в свою очередь приводит в выпуске Rh123 вне митохондрий. Наконец сильный сигнал зеленый флуоресценции будет обнаружен под флуоресцентным микроскопом. Это хорошо документированы, что истощение ММП и повышенные мембран проницаемости являются ранние признаки апоптоз клеток2. Таким образом Rh123 может применяться для обнаружения изменений ММП и возникновение апоптоза клеток.

Как 6 наиболее распространенным раком в мире головы и шеи рак сильно ухудшается здоровье человека3. Хотя в последние годы были разработаны многие подходы, клинические исходы лечения для пациентов, страдающих от головы и шеи плоскоклеточный рак (HNSCC)-до сих пор не идеальный4. Изучение новых терапевтических методов может улучшить лечение HNSCC5. Каналы иона с участием многочисленных биологических процессов отображать важную роль в развитии различных видов рака6. Частичное или полное участие Cl– каналов очень участвуют в различных свойств неопластической трансформации, в том числе активной миграции, высокий уровень распространения и инвазии. В свете этого CLIC, Роман белка семьи, были перечислены как перспективный класс терапевтических целей для рака лечение6,7. Недавние исследования показали, что члены семьи CLIC, включая CLIC1, CLIC4 и CLIC5, локализация для сердечной митохондриальных и уровень реактивнооксигенных видов (ров), upregulated, CLIC5, указывающий функциональную роль митохондриальной расположен Cl - каналы в ответ apoptotic8. CLIC4, один из членов семьи CLIC (также известный как mtCLIC, P64H1 и RS43), наиболее широко изучены для регулирования свойств его apoptotic в раковые клетки и внутриклеточных местоположения, включая Гольджи, эндоплазматический ретикулум и митохондрий в человека кератиноциты7,9,10. Выражение профиль CLIC4 регулируется фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), P53 и внешний раздражитель. Сверхэкспрессия и Даунрегуляция CLIC4 спровоцировать реакцию apoptotic главным образом через Митохондриальные пути сопровождается дисбаланс Bcl-2 члены семьи, активацию caspase Каскад и выпуск цитохрома C11, 12 , 13. Таким образом, ММП измерение имеет решающее значение для изучения связанных с CLIC4 апоптоза, и Rh123 служит индикатором идеальной флуоресценции.

Настоящее исследование описывает подробный протокол для обнаружения ММП для изучения CLIC4 сногсшибательно индуцированного апоптоза в HN4 клетках. Rh123 используется в качестве флуоресценции зонда для наблюдения за изменением ММР. Под общим флуоресцентным микроскопом и конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресценции реального времени колебания МЦП могут быть решены. Мы обсудить преимущества и недостатки применения конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресценции в деталях, а также сравнить его с другими методами. Этот протокол также может применяться для других исследований, связанных с апоптоз.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Культура и Transfection клетки

  1. Культура клеток
    Примечание: HN4, линия клетки HNSCC, была получена от больных с HNSCC14.
    1. Культура HN4 клетки в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM, глюкоза 4,5 г/Л) с 10% плода бычьим сывороточным и антибиотики (100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл). Инкубируйте клетки при 37 ° C с 5% CO2.
  2. Transfection клетки
    1. Один день перед трансфекции, пластина 5 x 105 клеток в 2 мл/о питательной среды без антибиотиков в 6-ну пластины хорошо.
    2. Разбавляют 100 пмоль CLIC4 siRNA или омлет малых интерферирующих РНК в 250 мкл сокращение сыворотке СМИ, аккуратно. Разбавить 5 мкл Реагента липосомы в 250 мкл сокращение сыворотке СМИ и инкубировать на 5 мин комбинат разреженных siRNA с реактивом разреженных липосом, осторожно перемешать и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре.
    3. Добавьте смесь в хорошо содержащих клеток и среднего. Смешайте нежно покачиваясь пластины обратно и вперед. Инкубируйте клетки при 37 ° C в инкубатор CO2 на 24 часа, прежде чем с помощью следующей процедуры маркировки Rh123. Замените средний нормальный рост среднего 4 h после transfection.

2. Rh123 маркировки

Примечание: Rh123 был использован для измерения ММП в HN4 клетки1.

  1. После CLIC4 лечения малых интерферирующих РНК (раздел 1) используйте HN4 клетки в 6-ну пластины для следующих лечения. Количество HN4 клеток в каждом хорошо достаточно, чтобы повторить эксперимент в 10 раз на coverslips.
  2. Используете пинцет поставить круговой coverslips на нижней части новой 12-ну пластин. Количество пластин устанавливается согласно экспериментальный дизайн (рис. 1А).
  3. Положите 150 мкл 100 мкг/мл polylysine на середину каждого coverslip внутри плиты 12-Ну и подождать 2 мин Обратите внимание не поставить polylysine вне coverslips. Затем тщательно удалить polylysine, дозаторов (рис. 1Б).
  4. Удалите средство культуры клеток HN4 внутри блюдо и добавьте трипсин 0.25% 1 мл для отсоединения клетки. После 6 мин добавьте 2 мл питательной среды для нейтрализации трипсина. Осторожно Смешайте HN4 клетки, дозаторов для 5 раз и семян 2-6 х 104 клетки на круговой coverslips. Место в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO2 (рис. 1C).
  5. После 8 ч инкубации инкубации клеток HN4 с 2 мкмоль/Л Rh123 40 мин при температуре 37 ° C. Аккуратно перемешайте средних вверх и вниз несколько раз, чтобы обеспечить равномерное распределение Rh123 в среде (рис. 1D).
  6. Готовят раствор достаточно нормального физиологического раствора (технология); чтобы сделать технология (в ммоль/Л): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 глюкозы и 5 HEPES, рН 7,4). Разогрейте до 37 ° C на водяной бане.
  7. Использовать пинцет, чтобы удалить coverslips и мыть оставшиеся жидкость через кратко размещение coverslips в разогретой NPBS буфер (рис. 1E).
  8. Место coverslips на нижней части камеры из нержавеющей стали 500 мкл (см. Таблицу материалы) с дном coverslip сменных 25 мм стекла запечатаны в место уплотнительное кольцо. Исправить это, затянув крышку камеры (рис. 1E).
  9. Добавление 450 мкл разогретую технология буфера в собранном виде Палату и поставить ванна под поле зрения микроскопа флуоресценции или конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресцирования (рис. 1E).

3. Обнаружение МЦП

  1. Общие флуоресцентным микроскопом
    1. Включите флуоресцентным микроскопом следуя инструкциям производителя.
      Примечание: Общий флуоресцентным микроскопом было достигнуто с ртутью лампа оптоволоконные источником света, FITC фильтра для Rh123 (480/40 возбуждения фильтр, 505 LP дихроичное зеркало и фильтр выбросов 535/40) при комнатной температуре. 20 X цель был использован для выполнения клеток.
    2. Откройте системного программного обеспечения обработки изображений и выберите кнопку «New» из панели команд, чтобы начать новый эксперимент (рисA).
    3. Настройка визуального поля и фокус, чтобы найти расположение ячеек в белый свет.
    4. Выключите свет и нажмите на кнопку, чтобы закрыть белый свет. Нажмите кнопку «Фокус» из панели команд и выберите пункт «Начать упором «переключиться на флуоресценции. Найти местоположение клетки снова через микроскоп с 507 возбуждения Нм и 529 Нм длинный пас выбросов волны (набор до эксперимента). Настройте поле зрения и фокус снова при необходимости (рис. 2B).
    5. Выберите visual поле, содержащее только 20-30, раздельный HN4 клеток. Изменение сигнала внутриклеточных флуоресценции для каждой ячейки будут записаны точно.
    6. Как только достигается ясно поля зрения, нажмите «Закрыть сосредоточена» из панели фокус. Нажмите кнопку «Acq один» из панели команд, чтобы получить один набор изображений. Нажмите кнопку «Регионы» из панели команд и нажмите кнопку «ОК», чтобы редактировать регионы измерения.
      Примечание: На панели редактирования региона разных регионе формы может использоваться в зависимости от исследования.
    7. Подходят для различных форм отдельных ячеек, выберите инструмент «След региона» и обведите региона одной одной ячейки и дважды щелкните после завершения. Повторите процедуру до тех пор, пока все клетки кружил (рис. 2C). Нажмите кнопку «Готово» и выберите «Сохранить изображения», чтобы найти его месторасположения.
    8. Нажмите кнопку «Zeroclock «и быстро нажать F4, чтобы начать мониторинг изменения интенсивности флуоресценции. Запись в реальном времени изменение интенсивности флуоресценции один раз каждые 5 s 5 минут (рис. 2D).
    9. Когда базовый становится стабильным, добавьте 50 мкл технология смешать с 0,5 мкл 100 ммоль/Л АТФ в камеру через дозаторов. Помните, чтобы не прикасаться камеры, чтобы избежать удаления поля зрения (Рисунок 2E).
      Примечание: Флуоресценции изображение будет записан на 20 минут и затем эксперимент может закончиться через ручной работы. Продолжительность времени регулярно поселились на 20 минут для того чтобы наблюдать весь флуоресценции изменения. Однако руководство по эксплуатации, чтобы остановить захват применяется, когда неожиданные факторы влияют на стабильность кривой или когда весь процесс занимает менее 20 минут.
  2. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресцирования
    1. Включите конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресценции следуя инструкциям производителя и открыть комплекте программное обеспечение.
      Примечание: Здесь, Rh123 возбуждалась Аргонового лазера на 488 нм и передаваемый сигнал был записан в диапазоне 545-700 Нм через применение фильтра TD488/543/633.
    2. Нажмите кнопку «Задача» в меню «Получить», чтобы выбрать 63 X / 1.4 н.а. масло объектива. Наблюдать за образец и найти четкие поля зрения под светового поля.
    3. Нажмите кнопку «TL/IL» для переключения в режим флюоресценции и выберите правильный флуоресценцией фильтры, чтобы найти расположение ячейки под тьмы через микроскоп. Нажимаем «Затвор» для защиты образца по окончании наблюдения.
    4. В меню «Получить» настроить подходящий ПЛТ канал и нажмите кнопку «Достижения» для того чтобы активировать поселились оптического пути (рисA). Нажмите в меню «Настройка» и выберите «Лазер», чтобы определить тип необходимой лазерной. «Аргон» рекомендуется для этого протокола (рис. 3B).
    5. Нажмите «Live», чтобы получить в реальном времени изображение и убедитесь, что поле содержит только 20-30, раздельный HN4 клетки. Изменение сигнала внутриклеточных флуоресценции для каждой ячейки будут записаны точно.
    6. Выберите «xyt» в режиме приобретения в подменю «Приобретение» в меню «Приобретение» (рис. 3C). Набор 5 s и 20 минут для интервала времени и продолжительности, соответственно. Нажмите кнопку» применить» когда решаются все параметры.
    7. Под «Quantify» меню используйте средство «Рисовать полилинии» окружить области записи каждой ячейки. Выберите «Линия профиля» и выберите «Старт» для проведения наблюдения. Запись в реальном времени изменение интенсивности флуоресценции для 5 минут (рис. 3D - E).
    8. Когда базовый становится стабильным, добавьте 50 мкл технология смешать с 0,5 мкл 100 ммоль/Л АТФ в камеру через дозаторов. Помните, чтобы не прикасаться камеры, чтобы избежать удаления поля зрения.
      Примечание: Флуоресценции изображение будет записан на 20 минут и затем завершения эксперимента.

4. Статистический анализ

  1. Общие флуоресцентным микроскопом
    1. Включите флуоресцентным микроскопом регулярно после руководство оператора. Откройте системного программного обеспечения обработки изображений и выберите кнопку «Открыть» из панели команд, чтобы открыть сохраненный эксперимент. Нажмите кнопку «Регионы» из панели команд и нажмите кнопку «OK» для редактирования областей измерения.
    2. Выберите инструмент «След региона» и обведите региона одной одной ячейки и дважды щелкните когда сделано. Повторите процедуру до тех пор, пока кружили все клетки. Нажмите кнопку «Готово» и выберите «F4: вперед» кнопку для получения трассировки показаны интенсивности флуоресценции.
    3. После завершения, нажмите кнопку со стрелкой вниз, расположенный на нижнем правом углу диаграммы и нажмите кнопку «Показать граф данных» (Рисунок 2F). Дважды нажмите кнопку «OK» и выберите «Данные журнала» кнопку, чтобы открыть интерфейс программного обеспечения для обработки данных. Снова нажмите кнопку «Данные журнала» и найти записи реального времени колебаний интенсивности флуоресценции отображаются на листе.
      Примечание: Для каждой ячейки, как отношение флуоресценции относительно интенсивности до применения СПС или тг (F1/F0) были представлены изменения в СПП. Каждый данных интенсивности флуоресценции были в среднем 20-30 ячеек. Данные для Rh123 представлены как среднее ± SE. результаты из 2 групп были протестированы двустороннее независимое t -тест и P значение < 0,05 считался статистической значимости. Программное обеспечение для статистического анализа был применен для проведения статистического анализа в этом эксперименте.
  2. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп флуоресцирования
    1. Включите конфокальный лазерный микроскоп и войти в комплекте программное обеспечение следуя инструкциям производителя.
    2. Выберите «Огонь», чтобы открыть записанные эксперимент.
    3. Выберите инструмент «Стек профиль» в меню «Quantify», выберите «все в одном» от «Сортировка диаграммы каналы и трансформирования.»
    4. Используйте инструмент «Рисовать многоугольник» круг ячейки регионов для наблюдения.
    5. Выберите в меню «Граф» и щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Экспорт в excel» для добавления значений интенсивности флуоресценции в электронную таблицу. Приводимый ниже анализ согласуется с нормальной флуоресценции микроскопы (рис. 3F).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В настоящем исследовании Rh123 был применен для обнаружения ММП. Первоначально HN4 клетки были культивировали для следующих флуоресценции, окрашивание экспериментов. Пинцет были использованы положить круглые coverslips на нижней части 6-ну пластины (рис. 1...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Это хорошо документировано что Cl− каналы имеют важное значение в поддержании гемостаз внутренней среды и играют важную роль в клеточной пролиферации и апоптоза15,16. Таким образом понимание взаимосвязи между ионного канала целевой вмешательства и ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы любезно благодарим г-н Chao Fang на культуры клеток. Эта работа была поддержана гранты от фонда естественных наук Китая (Грант № 81570403, 81371284); Аньхой провинциального природного научный фонд (Грант № 1408085MH158); Выдающийся молодой следователь Аньхой медицинского университета; Программа поддержки для отличные молодых талантов в университетах провинции Аньхой.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
HNSCC cellsATCCCRL-3241
PolylysineThermo Fisher ScientificP4981
Specific siRNA for human CLIC4BiomicsNM_013943(accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence
5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher ScientificL3000-015
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAXThermo Fisher Scientific51985-042
Rhodamine 123, FluoroPure gredeThermo Fisher ScientificR22420
Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose)Gibco11965-084
Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia OriginGibco10099141
Trypsin-EDTA SolutionBeyotimeC0201
Antibiotic-Antimycotic, 100XGibco15240062
Laser Scanning Confocal MicroscopyLeica Microsystems GmbHLEICA.SP5-DMI6000-DIC
Nikon Eclipse TE300 Inverted MicroscopeNikonN/A
Metaflour, V7.5.0.0Universal Imaging CorporationN/A
Leica application suite, v2.6.0.7266Leica Microsystems GmbHN/A
Microsoft office Excel 2007MicrosoftN/A
Sigma Plot 12.5Systat SoftwareN/A
Attofluor Cell ChamberThermo Fisher ScientificA7816

Ссылки

  1. Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload. Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).
  2. Gogol, P., Trzcińska, M., Bryła, M. Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide. Pol J Vet Sci. 17, (2014).
  3. Machiels, J. P., et al. Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck. F1000Prime Rep. 6, 44(2014).
  4. Behera, M., et al. Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review. Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).
  5. Pancari, P., Mehra, R. Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck. Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).
  6. Peretti, M., et al. Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets. Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).
  7. Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. Molecular structure and physiological function of chloride channels. Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).
  8. Ponnalagu, D., et al. Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes. Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).
  9. Fernandez-Salas, E., et al. mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53. Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).
  10. Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy. J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).
  11. Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation. PloS one. 7, 39378(2012).
  12. Ponnalagu, D., Singh, H. Anion Channels of Mitochondria. Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).
  13. Leanza, L., et al. Intracellular ion channels and cancer. Front Physiol. 4, 227(2013).
  14. Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines. Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).
  15. Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PloS one. 10, 0136584(2015).
  16. Xu, Y., et al. Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells. Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).
  17. Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells. Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).
  18. McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A neurological perspective on mitochondrial disease. Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).
  19. Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease. J Pathol. 241, 236-250 (2017).
  20. Zhang, W., Wang, X., Chen, T. Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells. Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).
  21. Bernardi, P., Rasola, A. Calcium and cell death: the mitochondrial connection. Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).
  22. Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells. Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).
  23. Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).
  24. Paddock, S. W. To boldly glow... applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1371234

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены