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Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para a aplicação de rodamina 123 para identificar o potencial de membrana mitocondrial (MMP) e estudar CLIC4 induzida por nocaute HN4 celular apoptose em vitro. Sob o microscópio de fluorescência comum e microscópio de fluorescência digitalização laser confocal, registou-se a mudança em tempo real do MMP.

Resumo

Depleção do potencial de membrana mitocondrial (MMP, ΔΨm) é considerada o evento mais antigo em cascata apoptótica. Mesmo ocorre antes do nucleares apoptotic características, incluindo a condensação da cromatina e quebra de DNA. Uma vez que os colapsos MMP, apoptose celular iniciará irreversivelmente. Uma série de corantes catiônicos lipofílicos pode passar através da membrana celular e agregar dentro da matrix da mitocôndria e servir como marcador de fluorescência para avaliar mudança MMP. Como um dos seis membros da família canal intracelular (CLIC), o Cl– CLIC4 participa no processo de apoptose celular, principalmente através da via mitocondrial. Aqui descrevemos um protocolo detalhado para medir MMP através de monitoramento a flutuação de fluorescência de rodamina 123 (Rh123), através da qual estudamos a apoptose induzida por nocaute de CLIC4. Podemos discutir as vantagens e limitações da aplicação do laser confocal varredura e microscópio de fluorescência normal em detalhe e também compará-lo com outros métodos.

Introdução

Rh123 é um corante catiônico de fluorescência, que serve como um indicador para o potencial transmembrana. Rh123 é capaz de penetrar a membrana celular e inserindo a matriz mitocondrial, dependendo da diferença de potencial dentro e fora da membrana1. Apoptose leva a danos da integridade da membrana mitocondrial. O poro de transição de permeabilidade de mitocôndria (MPTP) abrirá e ao colapso do MMP, que por sua vez, resulta na liberação de Rh123 para fora das mitocôndrias. Finalmente, sinal mais forte fluorescência verde será detectado sob microscópio de fluorescência. Está bem documentado que a depleção do MMP e permeabilidade da membrana elevados são sinais precoces de celular apoptose2. Portanto, o Rh123 pode ser aplicada para a detecção de mudança MMP e a ocorrência de apoptose celular.

Como o 6ª carcinoma mais comum no mundo, câncer de cabeça e pescoço deteriora gravemente saúde3 uma pessoa. Embora muitas abordagens foram desenvolvidas nos últimos anos, resultados clínicos do tratamento para pacientes que sofrem de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (HNSCC) é ainda não é o ideal4. Explorar novos métodos terapêuticos pode melhorar o tratamento para HNSCC5. Canais iônicos envolvendo inúmeros processos biológicos exibem um papel importante no desenvolvimento de diferentes tipos de câncer6. Participação parcial ou total dos canais de Cl– são altamente envolvidos em várias propriedades de transformação neoplásica, incluindo migração ativa, alta taxa de proliferação e invasão. Neste contexto, o CLIC, uma família de proteínas romance, foi listado como uma promissora classe de alvos terapêuticos para o tratamento de câncer6,7. Estudos recentes têm revelado que membros da família CLIC, incluindo CLIC1, CLIC4 e CLIC5, localizar a cardíaca mitocondrial e o nível de (ROS) de espécies reativas de oxigênio é upregulated por CLIC5, indicando o papel funcional de mitocondrial-localizado Cl - canais na resposta apoptótica8. CLIC4, um membros da família CLIC (também conhecido como mtCLIC, P64H1 e RS43), tem sido mais extensivamente estudada pelas suas propriedades de regulamento de apoptose em células cancerosas e Localização subcellular incluindo mitocôndria, retículo endoplasmático e Golgi em humanos queratinócitos7,9,10. O perfil de expressão de CLIC4 foi regulamentado pelo fator de necrose tumoral-α (TNF-α), P53 e estímulo externo. Superexpressão e downregulation de CLIC4 provocar uma resposta de apoptotic principalmente através da via mitocondrial, acompanhada com o desequilíbrio dos membros da família Bcl-2, ativação da cascata das caspases e liberação de citocromo C11, 12 , 13. portanto, medição de MMP é crucial para explorar a apoptose relacionadas com CLIC4, e Rh123 serve como um indicador de fluorescência ideal.

O presente estudo descreve um protocolo detalhado para a detecção de MMP para estudar CLIC4 induzida por nocaute apoptose nas células HN4. Rh123 é usado como uma sonda de fluorescência para observar a mudança do MMP. Sob o microscópio de fluorescência comum e microscópio de fluorescência digitalização laser confocal, a flutuação em tempo real do MMP pode ser resolvida. Podemos discutir as vantagens e limitações da aplicação do laser confocal microscópio de fluorescência em detalhe e também compará-lo com outros métodos. Este protocolo também pode ser aplicado a outros estudos relacionados ao apoptosis.

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Protocolo

1. cultura e transfecção de células

  1. Cultura celular
    Nota: O HN4, uma linha de celular HNSCC, derivou-se de pacientes com HNSCC14.
    1. Células de cultura HN4 em de Dulbecco modificado Eagle suplementado (DMEM, glicose de 4,5 g/L) com 10% de soro fetal bovino e antibióticos (100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL). Incube as células a 37 ° C com 5% de CO2.
  2. Transfecção celular
    1. Um dia antes de transfeccao, placa 5 x 105 células em 2 mL/bem do meio de cultura sem antibióticos em placas 6-boas.
    2. Dilua 100 pmol CLIC4 siRNA ou mexido SiRNA em 250 µ l de mídia soro reduzida, suavemente. Diluir o reagente de lipossoma 5 µ l em 250 µ l de mídia soro reduzida e incubar durante 5 min. Combine o siRNA diluído com o reagente diluído em lipossomas, misture delicadamente e incubar durante 20 min à temperatura ambiente.
    3. Adicione a mistura de bem contendo células e médio. Misture delicadamente agite-a placa de volta-e-vem. Incube as células a 37 ° C numa incubadora de CO2 para 24 h antes de prosseguir com o seguinte procedimento de rotulagem de Rh123. Substitua o meio meio de crescimento normal 4 h depois do transfection.

2. Rh123 de rotulagem

Nota: O Rh123 foi utilizado para medir a MMP em células de HN41.

  1. Após o tratamento de siRNA CLIC4 (secção 1), use HN4 células em placas de 6-poços para o tratamento a seguir. A quantidade de células HN4 em cada bem é o suficiente para repetir o experimento 10 vezes em lamelas.
  2. Use uma pinça para colocar lamelas circulares na parte inferior da novas 12-poços de placas. O número de placas é definido de acordo com o projeto experimental (Figura 1A).
  3. Coloque 150 µ l de 100 µ g/mL polylysine no meio de cada lamela dentro as placas 12-poços e aguarde 2 min. Preste atenção para não colocar a polylysine fora as lamelas. Em seguida, Retire cuidadosamente o polylysine por pipeta (Figura 1B).
  4. Remover o meio de cultura das células HN4 dentro do prato e adicionar tripsina de 0,25% 1 mL para desprender as células. Depois de 6 min, adicione 2 mL de meio de cultura para neutralizar a tripsina. Misture suavemente as células HN4 por pipeta para 5 vezes e sementes 2-6 х 104 células em lamelas a circular. Coloque em uma incubadora a 37 ° C com 5% CO2 (Figura 1C).
  5. Após a incubação de 8 h, Incube as celulas de HN4 com 2 µmol/L Rh123 por 40 min a 37 ° C. Misture suavemente os médios altos e baixos, várias vezes para garantir uma distribuição uniforme de Rh123 no meio (Figura 1D).
  6. Prepare-se bastante normal fisiológico (NPSS); tornar NPSS (em mmol/L): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, glicose 10 e 5 HEPES, pH 7,4). Pré-aqueça a 37 ° C em banho-maria.
  7. Use uma pinça para remover as lamelas e lave o restante líquido através de colocação brevemente as lamelas para o buffer NPBS pré-aquecido (Figura 1E).
  8. Coloque as lamelas na parte inferior da câmara de aço inoxidável de 500 µ l (veja a Tabela de materiais) com um fundo de lamela de vidro 25mm substituível selada no lugar por um-Ring. Corrigi-lo apertando a tampa da câmara (Figura 1E).
  9. Adicione 450 µ l pré-aquecido tampão NPSS à câmara montada e colocar o banho sob o campo visual do microscópio de fluorescência ou laser confocal microscópio de fluorescência (Figura 1E).

3. detecção do MMP

  1. Microscópio de fluorescência comum
    1. Ligue o microscópio de fluorescência, seguindo as instruções do fabricante.
      Nota: O microscópio de fluorescência comum foi realizado com uma mercúrio abajur fibra óptica fonte de luz, um filtro FITC definido para Rh123 (filtro de excitação de 480/40, 505 espelho dicroico LP e filtro de emissão 535/40) à temperatura ambiente. Objectivo de X 20 foi usado para executar a imagem latente da viver-pilha.
    2. Abra o software de sistema de imagem e selecione o botão "New" da barra de comando para iniciar uma nova experiência(Figura 2).
    3. Ajuste o campo visual e foco para encontrar o local das células em luz branca.
    4. Apague a luz e aperte o botão para fechar a luz branca. Clique no botão da barra de comando "Foco" e selecione "Iniciar com foco" para ligar a fluorescência. Encontrar a localização das células novamente através do microscópio com uma excitação 507 de nm e emissão de passe longo 529 nm comprimento de onda (conjunto antes do experimento). Ajuste o campo visual e foco novamente se necessário (Figura 2B).
    5. Selecione um campo visual que contém células de HN4 separadas somente 20 a 30. A mudança do sinal de fluorescência intracelular para cada célula será gravada com precisão.
    6. Uma vez que o campo visual é alcançado, clique em "Concentrar-se perto" da barra de foco. Clique em "Acq One" da barra de comando para adquirir um conjunto de imagens. Clique em "Regiões" da barra de comando e clique no botão "Okey" para editar a regiões de medição.
      Nota: Na barra Editar região, formas diferentes de região podem ser usadas dependendo do estudo.
    7. Para caber para diferentes formas de células individuais, selecione a ferramenta "Região de rastreamento" e círculo da região de uma única célula e dê um duplo clique quando terminar. Repita o procedimento até que todas as células estejam dentro de um círculo (Figura 2C). Clique em "Concluído" e selecione "Salvar imagens" para encontrar o local salvo.
    8. Clique em "Zeroclock"e rapidamente pressione F4 para iniciar o monitoramento da mudança da intensidade de fluorescência. Registo do tempo real mudança de intensidade de fluorescência uma vez a cada 5 s por 5 min (Figura 2D).
    9. Quando a linha de base torna-se estável, adicionar 50 µ l NPSS misturado com 0,5 µ l de 100 mmol/L ATP à câmara através de pipeta. Lembre-se de não tocar a câmara para evitar a remoção do campo visual(Figura 2).
      Nota: A imagem de fluorescência será gravada por 20 min e em seguida o experimento pode acabar através de operação manual. O tempo de duração é rotineiramente resolvido por 20 min para observar toda a mudança de fluorescência. No entanto, operação manual para parar a captura é aplicada quando inesperados fatores influenciam a estabilidade da curva, ou quando o processo todo leva menos de 20 min.
  2. Microscópio de fluorescência digitalização laser confocal
    1. Ligue o laser confocal microscópio de fluorescência, seguindo as instruções do fabricante e, em seguida, abra o software empacotado.
      Nota: Aqui, Rh123 estava animado por um laser de argônio em 488 nm e o sinal emitido foi gravado na faixa de 545-700 nm, através da aplicação do filtro TD488/543/633.
    2. Clique em "Objetivo" no menu "Adquirir" para selecionar 63 X / 1.4 N.A. óleo da lente objetiva. Observar a amostra e encontrar um campo visual limpo sob o campo de luz.
    3. Aperte o botão "TL/IL" alternar para modo de fluorescência e selecione os filtros de fluorescência correto para encontrar o local da célula sob a escuridão através de microscópio. Empurre o "SHUTTER" para proteger a amostra quando for concluída a observação.
    4. Sob o menu de "Adquirir", ajuste adequado canal de PGTO e clique em "Alcançar" para ativar o caminho óptico estabelecido(Figura 3). Clique no menu "Configuração" e escolha "Laser" para determinar o tipo de laser necessária. "Argônio" é recomendado para este protocolo (Figura 3B).
    5. Clique em "Live" para obter a imagem em tempo real e certifique-se de que o campo visual contém apenas 20 a 30 células de HN4 separadas. A mudança do sinal de fluorescência intracelular para cada célula será gravada com precisão.
    6. Selecione "xyt" no modo de aquisição no submenu "Aquisição" no menu "Adquirir" (Figura 3C). Conjunto 5 s e 20 min para o intervalo de tempo e duração, respectivamente. Clique em"Apply" quando todos os parâmetros são resolvidos.
    7. Sob o menu "Quantify", use a ferramenta de "Desenhar polilinha" para um círculo no local de gravação de cada célula. Selecione "Linha perfil" e escolha "Start" para realizar a observação. Grave a mudança em tempo real da intensidade de fluorescência por 5 min (Figura 3D - E).
    8. Quando a linha de base torna-se estável, adicionar 50 µ l NPSS misturado com 0,5 µ l de 100 mmol/L ATP à câmara através de pipeta. Lembre-se de não tocar a câmara para evitar a remoção do seu campo visual.
      Nota: A imagem de fluorescência será gravada por 20 min e então o experimento é concluído.

4. análise estatística

  1. Microscópio de fluorescência comum
    1. Ligue o microscópio de fluorescência, rotineiramente, seguindo o manual do operador. Abra o software de sistema de imagem e selecione o botão "Abrir" da barra de comando para abrir um experimento salvo. Clique em "Regiões" da barra' comando' e clique "Okey" botão para editar as regiões de medição.
    2. Selecione a ferramenta "Região de rastreamento" e círculo da região de uma única célula e dê um duplo clique quando feito. Repita o procedimento até que todas as células têm sido circuladas. Clique em "Concluído" e selecione o "F4: forward" botão para obter um rastreamento mostrando a intensidade de fluorescência.
    3. Uma vez terminado, clique no botão de seta para baixo localizado no canto inferior direito do gráfico e clique em "Mostrar dados de gráfico" (Figura 2-F). Clique duas vezes o "Okey" e escolha o botão "Dados de Log" para abrir a interface do software de processamento de dados. Clique novamente em "Dados de Log" e encontrar que os registros de tempo real de flutuação da intensidade de fluorescência aparecem na planilha.
      Nota: Para cada célula, alterações no MMP foram exibidas como a razão de fluorescência em relação a intensidade antes da aplicação do ATP ou TG (F1/F0). Cada dados de intensidade de fluorescência foram a média de 20-30 células. Dados para Rh123 são apresentados como média ± SE. resultados dos 2 grupos foram testados pelo teste bicaudal independentes t e P valor < 0,05 foi considerado como significância estatística. Software de análise estatística foi aplicado para realizar as análises estatísticas neste experimento.
  2. Microscópio de fluorescência digitalização laser confocal
    1. Ligue o microscópio confocal laser e logar o software empacotado seguindo as instruções do fabricante.
    2. Selecione "Fogo" para abrir um experimento gravado.
    3. Selecione a ferramenta "Pilha de perfil" no menu "Quantify", escolha "tudo em um" de "Gráficos de classificação por canais e ROIs."
    4. Use a ferramenta "Draw polygon" para regiões de célula de círculo para observação.
    5. Selecione o menu "Graph" e clique no botão direito do mouse e escolha "Exportar para excel" para adicionar os valores de intensidade fluorescente para uma planilha. A seguinte análise é consistente com microscópios de fluorescência normal (Figura 3-F).

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Resultados

No presente estudo, aplicou-se Rh123 para detectar o MMP. Inicialmente, HN4 as células foram cultivadas por fluorescência seguinte experiências de coloração. Pinça foram usada para colocar lamelas circulares no fundo do poço-6 placas (Figura 1A). As lamelas foram revestidas com polylysine por 5 min... e então o polylysine removido através da pipeta (Figura 1B). Então as células HN4 for...

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Discussão

Está bem documentado que o Cl− canais são essenciais na manutenção da hemostasia do ambiente interno e desempenham um papel importante na proliferação celular e apoptose15,16. Portanto, compreender a relação entre a intervenção orientada para o canal de íon e apoptose é de grande necessidade e importância de encontrar uma melhor abordagem terapêutica para vários cânceres17. As mitocôndrias mantenham estado bio...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Gentilmente agradecemos Sr. Chao Fang para cultura de células. Este trabalho foi financiado por doações da Fundação ciência Natural da China (Grant no. 81570403, 81371284); Fundação de Anhui Provincial de ciências naturais (Grant No. 1408085MH158); Excelente jovem investigador da universidade médica de Anhui; Programa de apoio para excelentes jovens talentos nas universidades da província de Anhui.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
HNSCC cellsATCCCRL-3241
PolylysineThermo Fisher ScientificP4981
Specific siRNA for human CLIC4BiomicsNM_013943(accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence
5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher ScientificL3000-015
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAXThermo Fisher Scientific51985-042
Rhodamine 123, FluoroPure gredeThermo Fisher ScientificR22420
Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose)Gibco11965-084
Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia OriginGibco10099141
Trypsin-EDTA SolutionBeyotimeC0201
Antibiotic-Antimycotic, 100XGibco15240062
Laser Scanning Confocal MicroscopyLeica Microsystems GmbHLEICA.SP5-DMI6000-DIC
Nikon Eclipse TE300 Inverted MicroscopeNikonN/A
Metaflour, V7.5.0.0Universal Imaging CorporationN/A
Leica application suite, v2.6.0.7266Leica Microsystems GmbHN/A
Microsoft office Excel 2007MicrosoftN/A
Sigma Plot 12.5Systat SoftwareN/A
Attofluor Cell ChamberThermo Fisher ScientificA7816

Referências

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