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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'applicazione della rodamina 123 per identificare il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) e studiare CLIC4 HN4 di atterramento-indotta delle cellule apoptosi in vitro. Sotto il microscopio di fluorescenza comune e microscopio a fluorescenza confocale, la modifica in tempo reale di MMP è stata registrata.

Abstract

Lo svuotamento del potenziale di membrana mitocondriale (MMP, ΔΨm) è considerato l'evento più iniziale nella cascata apoptotica. Essa si verifica anche davanti le caratteristiche nucleari apoptotiche, tra cui la condensazione della cromatina e rottura del DNA. Una volta che i crolli MMP, apoptosi avvierà irreversibilmente. Una serie di coloranti cationici lipofilici può passare attraverso la membrana cellulare e di aggregazione all'interno della matrice del mitocondrio e servire da indicatore di fluorescenza per valutare il cambiamento MMP. Come uno dei sei membri di Cl– famiglia canale intracellulare (clicca), CLIC4 partecipa al processo di apoptosi cellulare principalmente attraverso la via mitocondriale. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per misurare MMP, attraverso il monitoraggio della fluttuazione di fluorescenza di rodamina 123 (Rh123), attraverso il quale studiamo l'apoptosi indotta da atterramento di CLIC4. Discutiamo i vantaggi e i limiti dell'applicazione di scansione laser confocale e microscopio a fluorescenza normale in dettaglio e anche confrontarlo con altri metodi.

Introduzione

Rh123 è un colorante cationico di fluorescenza, che serve come un indicatore per il potenziale transmembrana. Rh123 è in grado di penetrare la membrana cellulare e inserendo la matrice mitocondriale a seconda della differenza di potenziale di dentro e fuori la membrana1. Apoptosi porta a danni di integrità della membrana mitocondriale. Il poro di transizione di permeabilità (MPTP) di mitocondrio per aprire e condurre al collasso di MMP, che a sua volta provoca il rilascio di Rh123 verso l'esterno dei mitocondri. Infine, verrà rilevati più forte segnale di fluorescenza verde con microscopio a fluorescenza. È ben documentato che lo svuotamento delle MMP e permeabilità della membrana elevati sono i primi segni di apoptosi di cellule2. Di conseguenza, Rh123 può essere applicato per la rilevazione del cambiamento MMP e l'avvenimento di apoptosi delle cellule.

Come il 6a carcinoma più comune nel mondo, cancro del collo e della testa si deteriora gravemente salute3 una persona. Anche se molti approcci sono stati sviluppati negli ultimi anni, il risultato clinico del trattamento per i pazienti affetti da carcinoma di cellule squamous di testa e del collo (HNSCC) è ancora non ideale4. Esplorare nuovi metodi terapeutici può migliorare il trattamento per HNSCC5. Canali ionici che coinvolgono numerosi processi biologici visualizzano un ruolo importante nello sviluppo dei cancri differenti6. Partecipazione parziale o totale dei canali del Cl– sono altamente coinvolti in varie proprietà di trasformazione neoplastica tra cui migrazione attiva, alto tasso di proliferazione e l'invasività. Alla luce di ciò, il CLIC, una famiglia nuova proteina, è stato indicato come una promettente classe di bersagli terapeutici per il cancro trattamento6,7. Recenti studi hanno rivelato che membri della famiglia dei CLIC compresi CLIC1, CLIC4 e CLIC5, si localizzano cardiaco mitocondriale e livello di specie (ROS) reattive dell'ossigeno è aumentato da CLIC5, che indica il ruolo funzionale di mitocondriale trova Cl - canali nella risposta apoptotica8. CLIC4, membra della famiglia CLIC (noto anche come mtCLIC, P64H1 e RS43), è stato più ampiamente studiato per le sue proprietà di regolamento apoptotico nelle cellule tumorali e subcellulare posto tra cui Golgi, reticolo endoplasmatico e mitocondrio in umani cheratinociti7,9,10. Il profilo di espressione di CLIC4 era regolato dal fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α), P53 e stimolo esterno. Sovraespressione e downregulation di CLIC4 innescare una risposta apoptotica principalmente attraverso la via mitocondriale accompagnata con lo squilibrio dei membri della famiglia Bcl-2, l'attivazione della cascata di caspase e rilascio di citocromo C11, 12 , 13. Pertanto, misura di MMP è cruciale per esplorare CLIC4-correlati apoptosis e Rh123 serve come un indicatore di fluorescenza ideale.

Lo studio presente descrive un protocollo dettagliato per la rilevazione di MMP per studiare CLIC4 indotta da atterramento di apoptosi in cellule di HN4. Rh123 viene utilizzato come una sonda a fluorescenza per osservare il cambiamento di MMP. Sotto il microscopio di fluorescenza comune e microscopio a fluorescenza confocale, la fluttuazione in tempo reale di MMP può essere risolta. Discutiamo i vantaggi e le limitazioni dell'applicazione del laser confocale, microscopio a fluorescenza in dettaglio e anche confrontarlo con altri metodi. Questo protocollo può essere applicato anche ad altri studi di apoptosis-relativi.

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Protocollo

1. cultura e transfezione delle cellule

  1. Coltura cellulare
    Nota: HN4, una linea cellulare HNSCC, è stato derivato dai pazienti con HNSCC14.
    1. Cellule di HN4 cultura in di Dulbecco per volta supplementato Eagle (DMEM, glucosio di 4,5 g/L) con 10% siero bovino fetale e gli antibiotici (100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina). Incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO2.
  2. Transfezione delle cellule
    1. Un giorno prima di transfezione, piastra 5x105 celle in 2 mL/bene di terreno di coltura senza antibiotici in piastre da 6 pozzetti.
    2. Diluire 100 pmol CLIC4 siRNA o strapazzata SiRNA in 250 µ l di media riduttori del siero, delicatamente. Diluire 5 µ l di reagente di liposomi in 250 µ l di media riduttori del siero e incubare per 5 min, combinare gli siRNA diluito con il reagente di liposomi diluito, mescolare delicatamente e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
    3. Aggiungere la miscela ben contenenti cellule e mezzo ciascuna. Mescolare delicatamente a dondolo avanti e indietro la piastra. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore a CO2 per 24 h prima di procedere con la procedura di etichettatura Rh123 seguente. Sostituire il mezzo con il mezzo di crescita normale 4 h dopo la trasfezione.

2. Rh123 etichettatura

Nota: Rh123 è stato utilizzato per misurare la MMP in HN4 cellule1.

  1. Dopo CLIC4 trattamento del siRNA (sezione 1), è necessario utilizzare HN4 cellule in piastre da 6 pozzetti per il trattamento seguente. La quantità di cellule HN4 in ogni bene è sufficiente per ripetere l'esperimento 10 volte sulle lamelle.
  2. Utilizzare una pinzetta per mettere il coprioggetti circolari sul fondo di nuovi 12-pozzetti. Il numero dei piatti è impostato secondo il disegno sperimentale (Figura 1A).
  3. Mettere 150 µ l di 100 µ g/mL polilisina sulla metà di ogni vetrino coprioggetti all'interno delle piastre 12-pozzetti e attendere 2 min. prestare attenzione a non mettere polilisina fuori i coprioggetti. Quindi rimuovere la polilisina di pipettatore accuratamente (Figura 1B).
  4. Rimuovere il terreno di coltura delle cellule HN4 dentro il piatto e aggiungere tripsina 0,25% 1ml per staccare le cellule. Dopo 6 min, aggiungere 2 mL di coltura per neutralizzare la tripsina. Mescolare delicatamente le cellule HN4 di pipettatore per 5 volte e х 2-6 semi 104 celle su lamelle circolari. Posto in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 (Figura 1C).
  5. Dopo 8 ore di incubazione, incubare le cellule HN4 con 2 µmol/L Rh123 per 40 min a 37 ° C. Mescolare delicatamente il medio alti e bassi più volte per garantire la distribuzione uniforme di Rh123 nel medio (Figura 1D).
  6. Preparare soluzione abbastanza normale fisiologica (NPSS); per rendere NPSS (in mmol/L): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, glucosio di 10 e 5 HEPES, pH 7.4). Preriscaldare a 37 ° C in un bagno d'acqua.
  7. Utilizzare una pinzetta per rimuovere i coprioggetti e lavare il rimanente liquido tramite immissione brevemente i coprioggetti nel buffer NPBS preriscaldato (Figura 1E).
  8. Posizionare i vetrini coprioggetto sul fondo della camera 500 µ l in acciaio inox (Vedi Tabella materiali) con un fondo di coprioggetto sostituibile 25 mm vetro sigillato in posto da un o-ring. Fissarlo stringendo il coperchio dell'alloggiamento (Figura 1E).
  9. Aggiungere 450 µ l preriscaldato buffer NPSS alla camera assemblata e mettere il bagno sotto il campo visivo del microscopio a fluorescenza o laser confocale, microscopio a fluorescenza (Figura 1E).

3. rilevamento di MMP

  1. Comune microscopio a fluorescenza
    1. Accendere il microscopio di fluorescenza seguendo le istruzioni del produttore.
      Nota: Il comune microscopio a fluorescenza è stata compiuta con sorgente di luce di un mercurio lampada a fibre ottiche, un filtro FITC impostato per Rh123 (filtro di eccitazione di 480/40, 505 specchio dicroico LP e filtro di emissione 535/40) a temperatura ambiente. 20 X obiettivo è stata usata per effettuare la formazione immagine della vivere-cella.
    2. Aprire il software di sistema di imaging e selezionare il pulsante "Nuovo" dalla barra di comando per iniziare un nuovo esperimento (Figura 2A).
    3. Regolare il campo visivo e la messa a fuoco per trovare la posizione delle cellule in luce bianca.
    4. Spegnere la luce e premere il pulsante per chiudere la luce bianca. Fare clic sul pulsante "Focus" dalla barra dei comandi e selezionare "Start messa a fuoco" per accendere la fluorescenza. Trovare la posizione delle cellule nuovamente tramite microscopio con un 507 nm eccitazione e di emissione di passaggio lungo 529 nm di lunghezza d'onda (Set prima dell'esperimento). Regolare il campo visivo e la messa a fuoco nuovamente se necessario (Figura 2B).
    5. Selezionare un campo visivo contenente cellule HN4 separate solo da 20 a 30. Il cambiamento del segnale intracellulare di fluorescenza per ogni cella sarà registrato con precisione.
    6. Una volta ottenuto un campo visivo chiaro, fare clic su "Messa a fuoco vicino" dalla barra di messa a fuoco. Fare clic su "One Acq" dalla barra di comando per acquisire una serie di immagini. Fare clic su "Regioni" dalla barra di comando e fare clic sul pulsante "OK" per modificare regioni di misurazione.
      Nota: Dalla barra degli strumenti area di modifica, forme di regione diversa possono essere utilizzati a seconda dello studio.
    7. Per adattare per le varie forme delle singole celle, selezionate lo strumento "Traccia regione" e della regione di una singola cella del cerchio e fare doppio clic quando finito. Ripetere la procedura fino a quando tutte le celle sono cerchiato (Figura 2C). Fare clic su "Fatto" e selezionare "Salva immagini" per trovare la posizione salvata.
    8. Fare clic su "Zeroclock"e rapidamente premere F4 per iniziare a monitorare il cambiamento di intensità di fluorescenza. Registrazione in tempo reale cambiamento di intensità di fluorescenza una volta ogni 5 s per 5 min (Figura 2D).
    9. Quando la linea di base diventa stabile, aggiungere 50 µ l NPSS mescolato con 0,5 µ l di 100 mmol/L ATP alla camera tramite pipettatore. Ricordate di non toccare l'alloggiamento per evitare la rimozione del campo visivo (Figura 2E).
      Nota: L'immagine di fluorescenza sarà registrato per 20 min e poi l'esperimento può finire tramite funzionamento manuale. La durata di tempo ordinariamente è depositata per 20 min al fine di osservare l'intero cambiamento di fluorescenza. Tuttavia, funzionamento manuale per interrompere la cattura viene applicata quando imprevisto i fattori che influenzano la stabilità della curva o quando l'intero processo richiede meno di 20 min.
  2. Microscopio a fluorescenza confocale laser
    1. Accendere il laser confocale, microscopio a fluorescenza seguendo le istruzioni del produttore e aprire il software in dotazione.
      Nota: Qui, Rh123 era eccitato da un laser ad Argon a 488 nm e il segnale emesso è stato registrato sopra la gamma di 545-700 nm attraverso l'applicazione del filtro TD488/543/633.
    2. Fare clic su "Obiettivo" sotto il menu "Acquire" per selezionare 63 X / 1.4 N.A. olio dell'obiettivo. Osservare il campione e trovare un campo visivo chiaro sotto il campo di luce.
    3. Premere il pulsante "TL/IL" per passare alla modalità di fluorescenza e selezionare i filtri di fluorescenza corretto per trovare la posizione della cella sotto buio tramite microscopio. Spingere "Otturatore" per proteggere il campione al termine dell'osservazione.
    4. Sotto il menu "Acquire", regolare adatto PMT canale e fare clic su "Ottenere" per attivare il percorso ottico costante (Figura 3A). Fare clic sul menu "Configurazione" e scegliere "Laser" per determinare il tipo di laser necessari. "Argon" è consigliato per questo protocollo (Figura 3B).
    5. Fare clic su "Live" per ottenere immagini in tempo reale e assicurarsi che il campo visivo contiene cellule HN4 separate solo da 20 a 30. Il cambiamento del segnale intracellulare di fluorescenza per ogni cella sarà registrato con precisione.
    6. Selezionare "xyt" in modalità di acquisizione nel sottomenu "Acquisizione" sotto il menu "Acquire" (Figura 3C). Impostare 5 s e 20 min per intervallo di tempo e di durata, rispettivamente. Fare clic su"applica" quando tutti i parametri sono depositati.
    7. Sotto il menu "Quantificare", è necessario utilizzare lo strumento "Disegna polilinea" per l'area di registrazione di ogni cella del cerchio. Selezionare "Linea profilo" e scegliere "Avvia" per condurre l'osservazione. Registrare la modifica in tempo reale dell'intensità di fluorescenza per 5 min (Figura 3D - E).
    8. Quando la linea di base diventa stabile, aggiungere 50 µ l NPSS mescolato con 0,5 µ l di 100 mmol/L ATP alla camera tramite pipettatore. Ricordate di non toccare l'alloggiamento per evitare la rimozione del campo visivo.
      Nota: L'immagine di fluorescenza sarà registrato per 20 min e poi l'esperimento è completato.

4. elaborazione statistica

  1. Comune microscopio a fluorescenza
    1. Accendere il microscopio di fluorescenza ordinariamente seguendo il manuale dell'operatore. Aprire il software di sistema di imaging e selezionare il pulsante "Apri" dalla barra dei comandi per aprire un esperimento salvato. Fare clic su "Regioni" dalla barra dei comandi e fare clic sul pulsante "OK" per modificare regioni di misurazione.
    2. Selezionare lo strumento "Traccia regione" e della regione di una singola cella del cerchio e fare doppio clic quando fatto. Ripetere la procedura fino a quando tutte le celle hanno state cerchiate. Fare clic su "Fatto" e selezionare il "F4: avanti" pulsante per ottenere una traccia che mostra l'intensità di fluorescenza.
    3. Una volta terminato, fare clic sul pulsante freccia giù si trova nell'angolo inferiore destro del grafico e fare clic su "Visualizza dati grafico" (Figura 2F). Fare clic su "OK" due volte e scegliere il pulsante "Dati di Log" per aprire l'interfaccia del software di elaborazione dati. Fare nuovamente clic su "Dati di Log" e trovare che i record di tempo reale fluttuazione dell'intensità di fluorescenza vengono visualizzati nel foglio di calcolo.
      Nota: Per ogni cella, modifiche in MMP sono state visualizzate come il rapporto della fluorescenza rispetto l'intensità prima dell'applicazione di ATP o TG (F1/F0). Ogni dati di intensità di fluorescenza sono stati la media di 20-30 cellule. I dati per Rh123 sono presentati come media ± SE. risultati da 2 gruppi sono stati testati con il test a due code indipendente t e il valore di P < 0,05 è stato considerato come significatività statistica. Software di analisi statistica è stato applicato per svolgimento di analisi statistiche in questo esperimento.
  2. Microscopio a fluorescenza confocale laser
    1. Accendere il microscopio confocale e accedere al software in dotazione seguendo le istruzioni del produttore.
    2. Selezionare "Fire" per aprire un esperimento registrato.
    3. Selezionare lo strumento «Pila profilo» sotto il menu "Quantificare", scegli "All in one" da "Tabelle di ordinamento da canali e ROIs".
    4. Utilizzare lo strumento "Draw poligono" per regioni cella cerchio per l'osservazione.
    5. Selezionare il menu "Grafico" e fare clic sul pulsante destro del mouse e scegliere "Esporta excel" per aggiungere i valori di intensità di fluorescenza in un foglio di calcolo. L'analisi seguente è coerenza con microscopi a fluorescenza normale (Figura 3F).

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Risultati

Nello studio presente, Rh123 è stato applicato per rilevare le MMP. Inizialmente, le cellule HN4 sono state coltivate per la fluorescenza seguente esperimenti di colorazione. Pinzette sono state utilizzate per mettere il coprioggetti circolari sul fondo di piastre da 6 pozzetti (Figura 1A). Le lamelle sono state rivestite con polilisina per 5 min e poi la polilisina rimosso via pipettatore (Figura 1B

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Discussione

È ben documentato che Cl− canali sono essenziali per mantenere l'emostasi dell'ambiente interno e giocano un ruolo importante nella proliferazione cellulare e apoptosi15,16. Quindi, comprendere la relazione tra intervento di targeting canale ionico e apoptosi è di grande necessità e importanza di trovare un migliore approccio terapeutico per vari cancri17. Mitocondri mantengono il normale stato biologico di una cella e la s...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo Mr. Chao Fang per colture cellulari. Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio dalla Fondazione Scienza naturale della Cina (Grant n. 81570403, 81371284); Anhui Provincial Natural Science Foundation (Grant No. 1408085MH158); Eccezionale giovane ricercatore dell'Università medica di Anhui; Programma di sostegno per talenti eccellenti giovani nelle Università della provincia di Anhui.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
HNSCC cellsATCCCRL-3241
PolylysineThermo Fisher ScientificP4981
Specific siRNA for human CLIC4BiomicsNM_013943(accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence
5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher ScientificL3000-015
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAXThermo Fisher Scientific51985-042
Rhodamine 123, FluoroPure gredeThermo Fisher ScientificR22420
Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose)Gibco11965-084
Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia OriginGibco10099141
Trypsin-EDTA SolutionBeyotimeC0201
Antibiotic-Antimycotic, 100XGibco15240062
Laser Scanning Confocal MicroscopyLeica Microsystems GmbHLEICA.SP5-DMI6000-DIC
Nikon Eclipse TE300 Inverted MicroscopeNikonN/A
Metaflour, V7.5.0.0Universal Imaging CorporationN/A
Leica application suite, v2.6.0.7266Leica Microsystems GmbHN/A
Microsoft office Excel 2007MicrosoftN/A
Sigma Plot 12.5Systat SoftwareN/A
Attofluor Cell ChamberThermo Fisher ScientificA7816

Riferimenti

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