CLIC4 최저 유도 HN4 세포 Apoptosis에서 체 외에 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 발견

요약

여기 선물이 rhodamine 123 미토 콘 드 리아 멤브레인 잠재적인 (MMP)를 식별 하 여 CLIC4 최저 유도 HN4 세포 apoptosis 체 외연구의 응용 프로그램에 대 한 자세한 프로토콜. 일반적인 형광 현미경, 공초점 레이저 스캐닝 형광 현미경 아래는 MMP의 실시간 변화 기록 했다.

초록

(MMP, ΔΨm) 잠재적인 미토 콘 드 리아 멤브레인의 고갈 apoptotic 캐스케이드에 초기 이벤트로 간주 됩니다. 그것은 심지어 핵 apoptotic 특성, chromatin 응축 및 DNA 파손 등 앞서 발생 합니다. 일단 MMP 붕괴, 세포 apoptosis 돌이킬 시작 됩니다. 질 성 양이온 염료의 일련 수 있습니다 세포 막 통과 mitochondrion, 매트릭스 내부 집계 및 MMP 변화를 평가 하기 위해 형광 마커 역할. Cl^- 세포내 채널 (클릭) 가족의 6 멤버 중 하나로 CLIC4 주로 미토 콘 드리 아 통로 통해 셀 apoptotic 과정에 참여합니다. 여기 우리가 Rhodamine 123 (Rh123),이 통해 우리가 공부 CLIC4 최저에 의해 유도 된 apoptosis의 형광 변동 모니터링 통해 MMP를 측정 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 장점과 confocal 레이저 스캐닝 및 세부 사항에, 일반 형광 현미경의 응용 프로그램의 한계를 토론 하 고 또한 다른 방법으로 그것을 비교 하 여.

서문

Rh123 막 횡단 잠재력을 위한 지시자로 봉사 하는 양이온 형광 염료 이다. Rh123은 세포 막을 관통 하 고 막¹내외의 잠재적인 차이 따라 미토 콘 드리 아 매트릭스 입력 가능 합니다. Apoptosis는 미토 콘 드 리아 멤브레인 무결성의 손상으로 이어집니다. Mitochondrion 침투성 전환 기 공 (MPTP) 열고에 미토 콘 드리 아의 바깥쪽에 Rh123의 방출 귀착되는 MMP의 축소로 이어질 것 이다. 마지막으로, 형광 현미경 강한 녹색 형광 신호를 감지 됩니다. 그것은 잘 MMP와 높은 막 침투성의 고갈 세포 apoptosis²의 초기 징후는 문서화 되어있다. 따라서, Rh123는 MMP 변화의 검출 및 세포 apoptosis의 발생에 적용할 수 있습니다.

세계에서 여섯번째 가장 일반적인 암으로 머리와 목 암 심각 하 게 사람의 건강³악화. 있지만 많은 접근은 최근 몇 년 동안에 개발 되었다, 머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC)에서 고통 받는 환자에 대 한 치료의 임상 결과 여전히 이상⁴. 새로운 치료 방법을 탐구 하는 것은 HNSCC⁵에 대 한 치료를 개선할 수 있습니다. 수많은 생물 학적 프로세스를 포함 하는 이온 채널 다른 암⁶의 개발에 중요 한 역할을 표시 합니다. Cl^- 채널의 부분 또는 전체 참여 매우 활성 마이그레이션, 확산 및 침해의 높은 비율을 포함 하 여 종양 약의 다양 한 속성에 포함 된다. 이 비추어 클릭, 비 발한 단백질 가족, 암 치료^6,7에 대 한 치료 목표의 유망한 클래스 나열 되었습니다. 최근 연구는 계시 했다 CLIC1, CLIC4, CLIC5, 등 클릭 가족의 심장 미토 콘 드리 아를 지역화 반응성 산소 종 (선생님) 레벨 이며 CLIC5에 의해 upregulated Cl ^{있는 미토 콘 드리 아의 기능 역할을 나타내는 -} apoptotic 응답⁸채널. CLIC4, (일컬어 mtCLIC, P64H1, 및 RS43), 클릭 가족의 한 구성원을 가장 광범위 하 게 암 세포 및 subcellular 위치 등 골, 바인딩과 그물 mitochondrion 인간의 apoptotic 규칙 속성에 대 한 공부 하고있다 keratinocytes^7,,910. CLIC4의 식 프로필 종양 괴 사 인자-α (TNF-α), P53, 그리고 외부 자극에 의해 규제 했다. Overexpression 및 CLIC4의 downregulation Bcl-2 가족 구성원의 불균형 caspase 캐스케이드의 활성화 및 시 토 크롬 C^11, 의 출시와 함께 미토 콘 드리 아 통로 통해 주로 apoptotic 응답 방 아 쇠 ^{12 , 13}. 따라서, MMP 측정 하는 중요 한 탐구 CLIC4 관련 apoptosis 그리고 Rh123 이상적인 형광 표시기로 제공.

현재 연구 HN4 셀에 CLIC4 최저 유도 된 apoptosis를 공부 하는 MMP의 검출에 대 한 자세한 프로토콜을 설명 합니다. Rh123 형광 프로브로는 MMP의 변화를 관찰 하는 데 사용 됩니다. 일반적인 형광 현미경, 공초점 레이저 스캐닝 형광 현미경 아래는 MMP의 실시간 변동 해결 될 수 있습니다. 우리는 장점과 confocal 레이저 스캐닝 자세히, 형광 현미경의 응용 프로그램의 한계를 토론 하 고 또한 다른 방법으로 그것을 비교 하 여. 이 프로토콜도 다른 apoptosis 관련 연구에 적용할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 세포 배양과 Transfection

1. 세포 배양
   참고: HN4, HNSCC 셀 라인, HNSCC¹⁴를 가진 환자에서 파생 되었다.
   1. Dulbecco의 문화 HN4 셀이 글 중간 (DMEM, 4.5 g/L 포도 당) 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 항생제 (100 U/mL 페니실린과 100 µ g/mL 스) 보완 수정. 셀 5% CO₂와 37 ° C에서 품 어.
2. 세포 transfection
   1. Transfection, 전에 1 일 플레이트 5 x 10⁵ 셀 2 mL/6 잘 플레이트에 항생제 없이 문화 매체의.
   2. 부드럽게 100 pmol CLIC4 siRNA 또는 감소 된 혈 청 미디어의 250 µ L에 스크램블 된 SiRNA를 희석. 감소 된 혈 청 미디어의 250 µ L에 5 µ L liposome 시 약을 희석 하 고 5 분 결합 희석된 liposome 시 약으로 희석된 siRNA에 품 어, 부드럽게, 혼합 실 온에서 20 분 동안 품 어.
   3. 각 잘 셀 및 매체를 포함 하는 혼합물을 추가 합니다. 뒤로-및-앞뒤 판 락으로 부드럽게 혼합. 다음 Rh123 라벨링 절차를 진행 하기 전에 24 h에 대 한 CO₂ 배양 기에서 37 ° C에서 세포를 품 어. Transfection 후 정상적인 성장 매체 4 h와 매체를 교체 합니다.

2. Rh123 라벨

참고: Rh123 HN4 셀¹MMP를 측정 하기 위하여 이용 되었다.

1. CLIC4 siRNA 치료 (제 1), 후 HN4 셀 6 잘 플레이트를 사용 하 여 다음과 같은 치료에 대 한. 각 HN4 셀의 양을 잘 coverslips에 10 번 실험을 반복에 충분 하다.
2. 새로운 12-잘 접시의 하단에 원형 coverslips를 넣어 핀셋을 사용 합니다. 격판덮개의 수는 실험 설계 (그림 1A)에 따라 설정 됩니다.
3. 12-잘 접시 안에 모든 coverslip의 중간에 100 µ g/mL polylysine의 150 µ L를 넣고 2 분 넣지는 coverslips 외부 polylysine에 주의 기 다. 다음 pipettor 여 polylysine를 철저 하 게 제거 (그림 1B).
4. 접시 안에 HN4 세포의 문화 매체를 제거 하 고 세포 분리를 1 mL 0.25 %trypsin 추가. 6 분 후 중화는 트립 신 2 mL 문화 매체를 추가 합니다. 부드럽게 믹스 pipettor에 의해 HN4 셀 5 번 및 씨앗 2-6 х 10⁴ 셀 원형 coverslips에. 5% CO₂ (그림 1C) 37 ° C에는 인큐베이터에 배치 합니다.
5. 8 h 부 화 후 37 ° c.에 40 분 동안 2 µ / l Rh123 HN4 셀을 품 어 부드럽게 혼합 매체 (그림 1D)에 Rh123의 동등한 배급을 보장 하기 위해 중간 위아래 여러 번.
6. 준비 하는 충분 한 정상 생리 염 분 해결책 (NPSS); 만들려고 NPSS (mmol/L): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl₂, 1 CaCl₂, 10 포도 당, 및 5 HEPES, pH 7.4). 물 욕조에 37 ° C로 예 열.
7. 핀셋을 사용 하 여 제거 하는 coverslips 고 나머지 세척 간단 preheated NPBS 버퍼 (그림 1E)에 coverslips를 배치를 통해 액체.
8. 500 µ L 스테인레스 스틸 챔버의 하단에는 coverslips를 배치 ( 재료의 표참조) 교체 25 m m 유리 coverslip 바닥 o-ring에 의해 장소에서 봉인. (그림 1E) 약 실의 뚜껑을 강화 하 여 그것을 해결.
9. 450 µ L NPSS 버퍼 조립된 챔버에 preheated confocal 레이저 스캐닝 형광 현미경 (그림 1E) 형광 현미경의 시야에서 목욕을 넣어 추가 합니다.

3입니다.는 MMP의 탐지

1. 일반적인 형광 현미경
   1. 제조업체의 지침에 따라 형광 현미경을 켭니다.
      참고: 일반적인 형광 현미경 수은 램프 fiberoptic 광원, FITC 필터 Rh123에 대 한 설정으로 달성 되었다 (480/40 여기 필터, 505 LP dichroic 거울 및 535/40 방출 필터) 실내 온도에. 20 X 목표 수행 라이브 셀 이미징에 사용 되었다.
   2. 이미징 시스템 소프트웨어를 열고 (그림 2A) 새로운 실험을 시작 하려면 명령 모음에서 "새로 만들기" 버튼을 선택 합니다.
   3. 시야와 하얀 빛에 셀의 위치를 찾는 데 초점을 조정 합니다.
   4. 하얀 빛을 버튼을 빛을 끄고. 명령 모음에서 "초점" 버튼을 클릭 하 고 "시작 초점" 형광에 스위치를 선택 합니다. 507 nm 여기와 529 nm 긴 패스 방출 현미경을 통해 다시 셀의 위치를 찾아 파장 (실험 하기 전에 설정). (그림 2B) 필요한 경우 다시 시야 및 초점 조정 합니다.
   5. 만 20 ~ 30 분리 HN4 셀을 포함 하는 visual 필드를 선택 합니다. 각 셀에 대 한 세포내 형광 신호 변화는 정확 하 게 기록 됩니다.
   6. 일단 명확한 시야 달성 클릭 "닫기 초점" 초점 바에서. 한 세트의 이미지를 얻으려고 명령 모음에서 "취득 한"을 클릭 합니다. 명령 모음에서 "지역"을 클릭 하 고 측정 영역을 편집 하 고 "확인" 버튼을 클릭 합니다.
      참고: 편집 영역 바에서 다른 지역 모양 연구에 따라 사용할 수 있습니다.
   7. 개별 셀의 다른 모양에 맞게 "추적 영역" 도구와 동그라미 하나의 단일 셀의 영역 선택한 끝나면 두 번 클릭 합니다. 모든 셀 때까지 절차 동그라미 (그림 2C)를 반복 합니다. "완료"를 클릭 하 고 저장 된 위치를 찾으려면 "이미지 저장"을 선택 합니다.
   8. 클릭 "Zeroclock"그리고 신속 하 게 형광 강도의 변화를 모니터링을 시작 하려면 f 4를 밀어. 레코드는 실시간 변경 형광 강도의 모든 5 번 5 분 (그림 2D)에 대 한 s.
   9. 때 초기 안정 되 고, 추가 50 µ L NPSS pipettor 통해 상공 100 mmol/L ATP의 0.5 µ L와 혼합. 시야 (그림 2E)를 제거 하지 않으려면 챔버를 만지지를 기억 하십시오.
      참고: 20 분 기록 됩니다 형광 이미지 하 고 실험 수동 작업을 통해 고용할 수 있습니다. 시간 기간 정기적으로 전체를 관찰 하기 위해 20 분에 대 한 정착 형광 변화. 그러나, 예기치 않은 요인 때 전체 과정은 20 분 미만 또는 곡선의 안정성에 영향을 미칠 때 캡처를 중지 하려면 수동 작업이 적용 됩니다.
2. Confocal 레이저 스캐닝 형광 현미경
   1. 공초점 레이저 형광 현미경 제조업체의 지침에 따라 스캔 켜고 번들된 소프트웨어를 엽니다.
      참고: 여기, Rh123 488에서 설정 하는 아르곤 레이저에 의해 흥분 했다 및 내보낸된 신호 TD488/543/633 필터의 응용을 통해 545-700 nm의 범위에서 기록 되었다.
   2. 63 X를 선택 하 고 "취득" 메뉴에서 "목표"를 클릭 / 1.4 렌즈 없음 오일. 표본을 관찰 하 고 가벼운 분야에서 명확한 시야를 찾을.
   3. 형광 모드로 전환 하 여 현미경을 통해 어둠에서 셀의 위치를 찾을 올바른 형광 필터 선택 "TL/IL" 버튼을 눌러. "셔터" 표본 관찰이 끝나면 보호를 밀어.
   4. "취득" 메뉴에서 적합 한 PMT 채널 조정 하 고 "달성" 정착된 광학 경로 (그림 3A) 활성화를 클릭 합니다. "구성" 메뉴에서 클릭 하 고 필요한 레이저 종류를 확인 하려면 "레이저"를 선택 하십시오. "아르곤" (그림 3B)이이 프로토콜에 대 한 것이 좋습니다.
   5. "라이브" 실시간 이미지 고 시야만 20 ~ 30 분리 HN4 셀이 들어 있는지 확인을 클릭 합니다. 각 셀에 대 한 세포내 형광 신호 변화는 정확 하 게 기록 됩니다.
   6. (그림 3C) "취득" 메뉴에서 "인수" 하위 메뉴에 획득 모드에서 "xyt"를 선택 합니다. 설정 5 s와 20 분 시간 간격 및 기간, 각각. 클릭"적용" 모든 매개 변수는 침전 하는 때.
   7. "계량" 메뉴 아래 "폴리라인 그리기" 도구 사용 하 여 각 셀의 기록 영역을 원형. "선 프로 파일"을 선택 하 고 "시작" 관찰을 선택 합니다. 5 분 (그림 3D-E)에 대 한 형광 강도의 실시간 변화를 기록 합니다.
   8. 때 초기 안정 되 고, 추가 50 µ L NPSS pipettor 통해 상공 100 mmol/L ATP의 0.5 µ L와 혼합. 시야를 제거 하지 않으려면 챔버를 만지지를 기억 하십시오.
      참고: 형광 이미지 20 분 기록 됩니다 및 실험의 완료 다음.

4. 통계 분석

1. 일반적인 형광 현미경
   1. 연산자의 설명서에 따라 정기적으로 형광 현미경을 켭니다. 이미징 시스템 소프트웨어 열고 저장 된 실험을 열려면 명령 모음에서 "열기" 버튼을 선택 합니다. ' 명령 모음 '에서 "지역"을 클릭 하 고 측정 영역을 편집 하려면 "확인" 버튼을 클릭 합니다.
   2. "추적 영역" 도구 선택 및 동그라미 하나의 단일 셀의 영역을 더블 클릭 할 때. 절차를 반복 하 여 모든 셀 원이 되었습니다. "완료"를 클릭 하 고 선택 합니다 "F4: 앞으로"를 형광 강도 보여주는 추적 버튼.
   3. 완료 되 면, 그래프의 오른쪽 아래 모서리에 있는 아래쪽 화살표 단추를 클릭 하 고 "그래프 데이터 표시" (그림 2F)을 클릭 합니다. "확인"을 두 번 클릭 하 고 데이터 처리 소프트웨어의 인터페이스를 열고 "로그 데이터" 버튼을 선택 합니다. "로그 데이터"를 다시 클릭 하 고 실시간으로 변동 형광 강도의 레코드가 스프레드시트에 찾을.
      참고: 각 셀에 대 한 MMP에 변화 ATP 또는 TG (F1/F0)의 응용 프로그램 전에 강도 기준으로 형광의 비로 표시 했다. 형광 강도 데이터 각 20-30 셀의 평균 했다. Rh123에 대 한 데이터는 평균 ± SE. 결과 2 그룹에서 양측 독립 t 검정 및 P 값에 의해 테스트로 제시 < 0.05 통계적 의미도 고려 되었다. 통계 분석 소프트웨어는이 실험에서 통계 분석을 적용 했다.
2. Confocal 레이저 스캐닝 형광 현미경
   1. 공초점 레이저 현미경 켜고 제조업체의 지침에 따라 번들된 소프트웨어에 로그인.
   2. "화재" 기록 된 실험을 열을 선택 합니다.
   3. "계량" 메뉴 아래 "스택 프로 파일" 도구를 선택, 선택 "모두 하나" "채널 및 ROIs 정렬 차트."에서
   4. 원 셀 영역 "무승부 다각형" 도구를 사용 하 여 관찰에 대 한.
   5. "그래프" 메뉴를 선택 마우스 오른쪽 버튼을 클릭 하 고 "excel로 내보내기" 선택 스프레드시트 형광 강도의 값을 추가 하려면. 다음과 같은 분석은 일반 형광 현미경 (그림 3F) 일치 합니다.

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결과

현재 연구에서 Rh123는 MMP 감지에 적용 되었습니다. 처음, HN4 셀 다음 형광 실험을 얼룩에 대 한 교양 했다. 핀셋 6 잘 플레이트(그림 1)의 하단에 원형 coverslips를 넣어 사용 했다. 5 분에 대 한 polylysine는 coverslips 코팅 했다 고는 polylysine pipettor (그림 1B)를 통해 제거 하는 다음. 다음 HN4 셀 trypsinized 되었고 6 ?...

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토론

잘 Cl⁻ 채널 hemostasis 내부 환경의 유지에 필수적 이며 세포 증식 및 apoptosis^15,16에 중요 한 역할을 문서화 되어있다. 따라서, 다양 한 암¹⁷에 대 한 더 나은 치료 방법의 찾을 큰 필요와 중요성의은 이온 채널 대상 개입 및 apoptosis의 관계를 이해. 미토 콘 드리 아 세포의 정상적인 생물학적 상태를 유지 하 고 기능 높은 막 침투성 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
HNSCC cells	ATCC	CRL-3241
Polylysine	Thermo Fisher Scientific	P4981
Specific siRNA for human CLIC4	Biomics	NM_013943	(accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000-015
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Rhodamine 123, FluoroPure grede	Thermo Fisher Scientific	R22420
Dulbecco’smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose)	Gibco	11965-084
Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin	Gibco	10099141
Trypsin-EDTA Solution	Beyotime	C0201
Antibiotic-Antimycotic, 100X	Gibco	15240062
Laser Scanning Confocal Microscopy	Leica Microsystems GmbH	LEICA.SP5-DMI6000-DIC
Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope	Nikon	N/A
Metaflour, V7.5.0.0	Universal Imaging Corporation	N/A
Leica application suite, v2.6.0.7266	Leica Microsystems GmbH	N/A
Microsoft office Excel 2007	Microsoft	N/A
Sigma Plot 12.5	Systat Software	N/A
Attofluor Cell Chamber	Thermo Fisher Scientific	A7816