Intraportal Transplantation der Bauchspeicheldrüse Inselchen im Mausmodell

Zusammenfassung

Pankreatischen inselversetzung ist eine Möglichkeit, Normoglycemia bei Diabetes Typ 1 zu erreichen. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Transplantation-Technik durch die intraportal Route weiterhin normale Blutzuckerwerte bei diabetischen Mäusen.

Zusammenfassung

Pankreatischen inselversetzung Hyperglykämie zu reduzieren ist sehr erfolgreich bei Nagetieren mit chemisch induzierte Diabetes. Die häufigste Lokalisation der Transplantation in experimentellen inselversetzung ist die Niere-Kapsel. Jedoch da weniger über das Zusammenspiel von pankreatischen kleinen Inseln mit Blut Bestandteile bekannt ist, ist es auch sinnvoll, die Pfortader Ansatz in experimentellen inselversetzung nutzen.

Dieses Protokoll zeigt eine intraportal Islet Transplantation Technik in NMRI nackte Mäuse. Streptozocin (180 mg/kg) ist intraperitoneal injiziert, um Hyperglykämie bei Empfänger Mäusen zu induzieren. Sie als Diabetiker auf ein nicht-Fasten Blutzuckerspiegel größer als 20 Mmol/l gelten als Einen Tag vor der Transplantation, sind Maus pankreatischen kleinen Inseln isoliert aus der Bauchspeicheldrüse Spender von Kollagenase Verdauung; mindestens 350 Inseln werden pro Diabetiker Empfänger eingesetzt. Abhängig von der kleinen Insel isoliert Ertrag, sind zwei oder mehrere Spender Mäuse pro Empfänger genutzt. Nach Übernachtung Kultur bei 37 ° C sind Inseln in den Empfänger Leber über die Pfortader verabreicht. Nach der Operation, die Mäuse in roter Makrolon Häuser geschützt und bis sind wach. Dieses Protokoll unterhält glykämische Kontrolle für 120 Tage in Phänomen Mäuse und 15 Tage bei allogenen Mäusen.

Einleitung

Inselversetzung ist ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung von Typ 1 Diabetes Mellitus¹. Der erste Versuch, ein Schaf Pankreas Fragment eines Diabetikers überweisen wurde 1893 von Watson Williams durchgeführt. Jedoch ein wichtiger Durchbruch in klinischen inselversetzung gelang mit dem Edmonton-Protokoll, und danach, waren eine Reihe von nationalen Programmen entwickelt². In der Vergangenheit mehrere Standorte, wie Knochenmark, omentalis Beutel, intramuskuläre Region, Magen-Schleimhautoberfläche, Milz und Niere Kapsel wurden in präklinischen Modellen erforscht, aber das Portal Venensystem gilt als eines der angemessenen und wirksamen Website für klinische Programme^3,4,5,6.

Exogene Verabreichung von Insulin kann durch kleine Insel Infusion in die Pfortader ersetzt werden. Dies gilt eine bevorzugte Seite, weil die Sauerstoffversorgung vergleichbar mit dem in der nativen Bauchspeicheldrüse aufgrund der Lage unterhalb des Zusammenflusses der Portal Arterie und Vene ist. Darüber hinaus könnte gibt es eine große Fläche, so dass die dreidimensionale Struktur der Inseln erhalten werden kann, und Vaskularisierung erleichterten⁵. In einer Empfänger Diabetische Maus, 2.000 Menschen oder Schweinen Inselchen Äquivalente oder 350 Maus genügen Inselchen hyperglykämischen Zustand^7,8rückgängig zu machen. Euglycemic Ebenen wurden für 15 Tage in dem Empfänger Mausmodell xenogene Inseln und in der allogenen Maus-Maus-Modell und für mehr als 120 Tage in das Phänomen Maus-Maus-Transplantation gemeldet.

Für die Wirksamkeit der inselversetzung über Pfortader relevanten Faktoren sind geeignete Anästhesie, Methode der Punktion und Blutstillung⁹. Betäubung durch Inhalation (5 % Isofluran) oder Injektion (Ketamin, Xylazin oder Pentobarbital) induziert werden kann, und die Stoffe werden häufig kombiniert. Zur Steuerung der Tiefe und Zeit der Narkose sollte den Zustand der Maus, wie die Farbe der Schleimhaut, Auge Deckel, Hornhaut Reflex, Atemfrequenz und Temperatur des Körpers geachtet. Es ist darauf zu achten, dass das Tier nicht zu kämpfen hat und dass er die Operation überlebt. Die Temperatur kann durch verschiedene Heizgeräte wie Heizkissen, Rotlicht-Lampen erhalten, etc. A warm Thermoplatte verwendet wurde, um eine Temperatur von 25-30 ° C zwischen der Maus und dem OP-Tisch, der verhindert das Auftreten von Hypothermie. Die Dosierungen der Anästhetika sind wichtig, da alle von ihnen von der Leber metabolisiert werden und Leberfunktion vorübergehend werden, durch die Infusion der Insel Suspension. gestört kann Die ideale Einstichstelle für die Pfortader ist die Position zwischen der ersten und zweiten Nebenfluss Ader.

Die Anzahl der Inseln und der beabsichtigten Injektionsvolumen auch Einfluss auf den Ausgang des Transplantats, da übermäßiger Lautstärke die Scherspannung verstärken kann. 0,2 mL Volumen gilt für inselversetzung in die Pfortader geeignet. Die Punktion Wunde (26-Gauge-Nadel) induziert, Blutungen aus der Pfortader, die zeitnah und effektiv gestoppt werden muss. Steriler Gaze oder einem Finger einsetzbar mit minimalem Druck auf dem Gelände der Punktion für ca. 6 min., die Blutung zu stoppen. Genommen zusammen, Portal Inselchen Injektion ist effektiv und bietet Verordnung über den Blutzuckerspiegel bei chemisch induzierten Diabetische Mausmodellen.

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Protokoll

Alle Verfahren in diesem Protokoll wurden von deutschen Tierschutzgesetz und Richtlinien genehmigt. Verwenden Sie 10 bis 12 Wochen alten NMRI nackte Mäuse und C57Bl/6 Mäusen (Spender: alte weiblich; Empfänger: männliche) während der Experimente. Verwenden Sie nackt NMRI Mäuse für Insel isoliert. Halten Sie die Mäuse unter definierten Bedingungen gemäß den Vorschriften der örtlichen Tierhaus.

1. Induktion von Diabetes durch die Streptozocin

1. Am Tag-4 Messen Sie das Körpergewicht von 10 bis 12 Wochen alten NMRI nackten Mäusen und C57Bl/6 Mäusen mit einer Waage.
2. Bereiten Sie nach dem die gemessenen Körpergewicht eine 180 mg/kg-Dosis von Streptozocin in 0,1 mL Kochsalzlösung per Mausklick.
   Hinweis: Streptozocin sollten werden frisch zubereitet vor Gebrauch und abgedeckt mit Alufolie, da sie lichtempfindlich ist.
3. Phänomen und allogene Mäuse zu injizieren, jeweils mit einer einzigen Dosis von 0,1 mL Streptozocin (180 mg/kg) intraperitoneal mit einer 26-G-Nadel.
4. Am Tag-3 sammeln-2 und-1 2-4 µL Blut durch Punktion die Rute Venen von Mäusen nicht gefastet.
5. Verwenden Sie 2-4 µL Blutprobe pro Teststreifen, um den Blutzucker bei NMRI nackte Mäuse und C57Bl/6 Mäusen Messen
   Hinweis: An diesem Punkt, 80 % der Mäuse sollte werden Diabetiker (20 Mmol/L).
   1. Verwenden Sie Mäuse für inselversetzung, wenn ihre Blutzuckerwerte 20 Mmol/L erreichen.

2. Isolierung des Pankreas Inselchen von Mäusen

1. Die Mäuse mit Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (20 mg/kg Körpergewicht) durch intraperitoneale Injektion mit einer 26-G-Nadel zu betäuben.
   Hinweis: Die Mengen an Ketamin und Xylazin wurden entsprechend dem Körpergewicht der Tiere (0,10 mL/10 g) ermittelt.
2. Halten Sie die Mäuse in Rückenlage und desinfizieren mit Povidon-Jod-Lösung. Bestätigen Sie richtige Euthanasie durch Überprüfung des Pedalen Reflexes.
   Hinweis: Bei C57Bl/6 rasieren der Bauchregion.
3. Halten Sie die Haut mit feinen Zangen und machen Sie einen Mittellinie Schnitt mit der Schere, die Bauchhöhle verfügbar zu machen. Legen Sie den Darm Situs auf der linken Seite und außerhalb der Bauchhöhle auf eine sterile Gaze-Kompresse.
4. Passen Sie den Magen in eine andere Richtung Auffinden der Bauchspeicheldrüse und anderen verbundenen Geweben.
5. Erreichen Sie die Aorta zu und machen Sie einen kleinen Schnitt das Blut abfließen. Verwenden Sie sterilen Gaze für Blut-Absorption.
6. Entfernen Sie vorsichtig den Darm. Trennen Sie die Bauchspeicheldrüse aus dem Magen und Milz.
7. Verbrauchsteuern Sie die Bauchspeicheldrüse und legen Sie sie in eine frische Petrischale. Entfernen Sie die unerwünschten Materialien, wie Fett, mit Pinzette.
8. Füllen Sie eine 5 mL Spritze mit 4 mL der Kollagenbildung und injizieren in die Bauchspeicheldrüse mit einer 26-G-Nadel (Lösung auf Lager: 30 mg Kollagenase in 12 mL Hank Lösung).
9. Blatt vor den Mund die Bauchspeicheldrüse mit einer Schere, die Fläche für eine verbesserte Verdauung und Übertragung auf eine rote Kappe Tube 12 mL erhöhen.
   Hinweis: Hank es ausgewogen Salzlösung: HBSS 10 x (100 mL), Penicillin-Streptomycin (10 mL), Gentamycin (1 mL), Ciprofloxacin (10 mL), HEPES (35 mL), destilliert H₂O (900 mL)
10. Führen Sie eine Verdauung für 10 min bei 37 ° C im Wasserbad schütteln. Wirbel der Probe dreimal in regelmäßigen Abständen für 15 s.
11. Mischen Sie die verdaute Bauchspeicheldrüse kräftig von Hand für 3 min und legen Sie es auf dem Eis für 10 s.
12. Fügen Sie 6 mL kalte Hank-Lösung, die Verdauung Reaktion und Zentrifuge bei 560 X g für 3 min bei Raumtemperatur zu stoppen.
13. Den überstand zu entfernen und das Pellet in 10 mL Parker/fetale Kalb Serum (P/FCS) Medium bei Raumtemperatur auflösen.
    Hinweis: P/FCS-Medium: TCM-199 10 x (100 mL), FCS (50 mL), Penicillin-Streptomycin (10 mL), HEPES (20 mL), destilliert H₂O (900 mL)
14. Identifizieren Sie die Inseln anhand ihrer Morphologie (Sphäroid, goldbraune Farbe) unter einem Lichtmikroskop. Vermeiden Sie Inselchen mit dunklen Zentren. Prüfung auf Reinheit und Lebensfähigkeit durch Ausführen Dithizone Färbung unter einem Lichtmikroskop.
    Hinweis: Dithizone bindet an Zink-Ionen und Rote Fleck zu den kleinen Inseln bietet.
15. Verwenden Sie eine 1-mL-Pipette zu zählen und Inseln unter einem Lichtmikroskop aussuchen und dazu eine frische Petrischale (60 mm x 15 mm) mit 4 mL P/FCS-Medium zu übertragen.
    Hinweis: Die Lautstärke des P /FCS-Medium in der Petrischale sollte nicht mehr als 4 mL um sauerstoffverfügbarkeit zu gewährleisten.
16. Halten Sie die isolierte Inseln in 4 mL P/FCS-Medium über Nacht bei 37 ° C im Brutschrank.

3. Vorbereitung der Tiere auf Inselversetzung

1. Entfernen der isolierten Inseln aus dem Inkubator 37 ° C und unter der Sitzbank an einem Fluss. Zentrieren Sie die Inseln mit einer schwingenden Kreisbewegung der Petrischale.
2. Füllen Sie eine 1-mL-Spritze (blaue 23-G-Nadel) mit 0,1 mL P/FCS-Medium. Fügen Sie 350 Inseln in 0,3 mL Hank es Lösung. Halten Sie die Spritze in eine vertikale Position erlauben die Inselchen zu begleichen.
3. Verringern Sie die Lautstärke bis 0,05 mL und ersetzen Sie die blauen 23-G-Nadel mit einer braunen 26 G-Nadel. Die gleiche Spritze fügen Sie 0,15 mL Ficoll (Dichte Gradienten Medium hinzu) an die Spitze zu einem Endvolumen von 0,2 mL in der Spritze zu erreichen. Vermeiden Sie Luftblasen.
4. Halten Sie die Spritze in einer vertikalen Position und drehen Sie ihn leicht, um zu vermeiden, die Verklumpung von Inselchen. Die kleinen Inseln werden auf der Konus der Spritze innerhalb von 2 – 3 min. zu begleichen.
5. Messen Sie den Körper Gewicht und Blut Blutzuckerspiegel der Empfänger Mäuse; der Blutzuckerspiegel sollte rund 20 Mmol/L.
6. Die Mäuse mit Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (20 mg/kg Körpergewicht) durch intraperitoneale Injektion mit 26 G-Nadel zu betäuben.
7. Legen Sie die Mäuse in Rückenlage auf eine warme Thermoplatte (37 ° C). Prüfen Sie die Tiefe der Narkose durch Kneifen der Zehs.
8. Reinigen Sie die Bauchregion mit Povidon-Jod-Lösung (Haut-Desinfektionsmittel). Um die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern, halten sie feucht mit Augensalbe.
   Hinweis: Bei C57Bl/6 rasieren der Bauchregion.

4. Inselversetzung über die Intraportal Route

1. Am Tag 0, beginnen Sie mit einer Laparotomie hält die Haut mit einer Pinzette und eine 2-3 cm-langen Mittellinie Schnitt mit einer Schere. Statt ein steriler feuchter Gaze zu komprimieren, um die Wundränder um es feucht zu halten.
2. Legen Sie den Darm Situs auf der linken Seite und außerhalb der Bauchhöhle auf die sterile Gaze-Kompresse.
   Hinweis: Halten Sie den Darm feucht während des Verfahrens mit vorgewärmten 0,9 % NaCl-Lösung oder steriler Gaze in normalen Kochsalzlösung getaucht.
3. Bewegen Sie den Zwölffingerdarm und lokalisieren der Bauchspeicheldrüsenkrebs. Suchen Sie die Pfortader befindet sich auf der ventralen Seite Empordringen der Bauchspeicheldrüsenkrebs. Verwenden Sie einen Finger und Daumen, um die Pfortader verfügbar zu machen und einmal ausgesetzt, Punktion es in der Nähe der Leber.
4. Innerhalb von 1 min injizieren Sie langsam und stetig die Inselchen (0,2 mL ab Schritt 3.4) in die Pfortader unter die Kontrolle der Lupe, um Undichtigkeiten Inselchen zu vermeiden.
   Hinweis: Nach der Injektion, überprüfen Sie immer für die restlichen Inseln in der Spritze. Nehmen Sie 1 mL P/FCS-Medien in einer Spritze, bündig in eine frische Petrischale und Graf unter dem Mikroskop.
5. Legen Sie eine sterile Manometer an der Einstichstelle und Druck mit dem Zeigefinger (Eindringtiefe: 0,5-1 cm) für 6 min um die Blutung zu stoppen.
   Hinweis: Das Volumen injiziert sollte 0,2 mL nicht überschreiten. Übermäßiger Lautstärke und Druck können die Inseln durch Scherbeanspruchung beschädigen.
6. Legen Sie vorsichtig den Darm Situs, Peritoneum, Abdominal-Muskelschicht und Faszien wieder in Position.
7. Mit Pinzette, heben Sie die Haut, in der Nähe der Muskel-Schnitt mit resorbierbarem Nahtmaterial Seide und obere Hautschicht mit 2-3 Clips.
8. Reinigen Sie die Oberfläche mit einem Haut-Desinfektionsmittel, wenden Sie einen Wunde Heiler an und platzieren Sie die Mäuse in einzelnen Käfigen zu. Wunde Heiler bietet eine wasserabweisende Acrylat-Schicht und schützen vor Mazeration und Sekundärinfektion.
   Hinweis: Beobachten Sie die Mäuse zu, bis sie ausreichend Bewusstsein wiedererlangt haben, bieten Sie Tramadol (0,2 mg / Maus) zusammen mit Flüssigkeiten. In diesem Protokoll Mäuse erholten sich schnell von Anästhesie und Tramadol Verwaltung reduziert den Schmerz. Nach 7 Tagen sollte die Wunde heilen.
9. Die Mäuse mit regelmäßigen Nahrung und Wasser zu ernähren. Nahrung und Wasser Verbrauch und Urin-Ausscheidung erhöht sich nach der Streptozotocin-Injektion.
10. Messung der Blutzuckerwerte jeden Tag für die erste Woche und dann einmal pro Woche in Phänomen Mäuse. Bei allogenen Mäusen Messen des Blutzuckerspiegels dreimal pro Woche für bis zu 15 Tage.

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Ergebnisse

Die Kompetenz der verpflanzten kleinen Inseln wurde in chemisch induzierten diabetischen Mäusen untersucht. Die Inseln wurden über das Portal Venensystem in diabetischen Mäusen Modell transplantiert. Der Geber-nehmer-Anteil betrug 2:1. In dem Phänomen Mausmodell wurden zwei Spender Mäuse eingesetzt, um 350 Inseln zu erhalten. Die Inseln wurden dann in diabetischen Mäusen verpflanzt. Ein Rückgang der Blutzuckerspiegel war am 1. Tag nach der Transplantation, was eine Rolle des transp...

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Diskussion

In dieser Studie wird die intraportal Route der inselversetzung untersucht. Dieses Protokoll ist hocheffizient in diabetischen Stress abbauen und bietet eine ausführliche Gelegenheit Islet Transplantation Studien zu erkunden. Dieses Protokoll bestätigt, dass ca. 350 murine Inselchen hyperglykämischen Zustand umkehren können. Darüber hinaus keine der Mäuse starben während des Verfahrens und glykämische Kontrolle wurde in alle Empfänger erreicht. Körper-Gewicht und Blut-Glukosespiegel verzeichneten regelmäßig u...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 mice	Charles River (Sulzfeld, Germany)		(10-12 weeks)
BALB/c mice	Charles River (Sulzfeld, Germany)		(10-12 weeks)
NMRI nude mice	Charles River (Sulzfeld, Germany)		(10-12 weeks)
Ketamine	Bela-pharm
Xylazine	CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH
Syringe, 23G and 26G needle	BD
Petri Dish	Falcon	303800
NaCl	Carl Roth	351007
Sterile Gauze	Fuhrmann	7647-14-5
Shaking Water bath	Kotterman	1501
Scissors	Braun	1501
Glucose Meter	One Touch
Warm Thermal Plate	Thermo Fisher
Braunol (povidone-iodide solution)	B.Braun Melsungen AG	3864154
Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment)	Dr. G Mann Chem.-Pharm.  GmbH
Incubator	Fa. Roth
Flow Bench	Herdus
Ficoll	Sigma-Aldrich	10771
5-0 Silk Suture Vicryl	Braun		(7.5 *1.75mm)
Michel Clamps (clips)	Aesculap	BN507R
P/FCS Solution	Gibco	21180-021
TCM-199 (10x)	Gibco	21180-021
FCS	Biowest	S1810-500
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
HEPES (1 M)	Biochrom	L 1613
Gentamycin	Ratiopharm
Ciprofloxacin	Fresenius Kabi
Hank's Solution	Gibco	14060-040
Collagenase	Roche	11213865001
Streptozotocin	Calbiochem	572204
OPSITE-spray (wound healer)	Smith and nephew	66004978
Reugular food	Altromin
Head light LED 16042 (magnifying glass)	Eschenbach	16042
Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody	Millipore, Chemicon	CBL1337	Dilution (1:100)
Donkey anti-rat secondary antibody	Dianova	712095153	Dilution (1:400)
Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody	Dako	A0564	Dilution (1:500)
Donkey anti-guinea pig secondary antibody	Dianova	706-259-148	Dilution (1:400)