Intraportal 이식 마우스 모델에서 췌 장 독도의

요약

췌 장 섬 이식 타입-1 당뇨병에 normoglycemia를 달성 하는 방법입니다. 이 문서는 당뇨병 쥐의 정상적인 포도 당 수준을 유지 하는 intraportal 경로 통해 이식 기술에 초점을 맞추고.

초록

췌 장 섬 이식 혈당을 줄이기 위해 화학적으로 유도 된 당뇨병 설치류에서 매우 성공적 이다. 실험적인 섬 이식에 가장 일반적인 이식 사이트 신장 캡슐 이다. 그러나,로 적은 혈액 성분과 췌 장 독도의 상호 작용에 대 한 알려져 있다, 그것은 또한 의미가 실험 섬 이식에서 문맥 접근 방식을 활용 하 있습니다.

이 프로토콜에서는 NMRI 누드 마우스에는 intraportal 섬 이식 기법을 보여 줍니다. Streptozotocin (180 mg/kg)은 받는 사람 쥐에서 혈당을 유도 하기 위해 intraperitoneally 주입 하 고 있다. 그들은 20 mmol/l. 보다 큰 비 단식 혈액 포도 당 수준에서 당뇨병 환자로 간주 됩니다. 1 일 이전에 이식, 마우스 췌 장 독도 콜라 소화;에 의해 기증자 췌 격리 최소 350 독도 당뇨병 받는 당 활용 됩니다. 섬 격리 수율에 따라, 두 개 이상의 기증자 마우스 받는 사람 마다 활용 됩니다. 37 ° C에서 야간 문화, 후 독도 문맥을 통해 받는 사람 간으로 관리 됩니다. 수술 후, 쥐 빨간색 Makrolon 주택에 보호 및 관찰까지 깨어 있다. 이 프로토콜 syngeneic 마우스에 120 일 및 15 일 수용자 쥐에 glycemic 통제를 유지 한다.

서문

섬 이식¹타입-1 당뇨병 치료 하는 유망한 접근 이다. 당뇨병 환자로 양 췌 장 부분을 전송 하는 첫 번째 시도 1893 년에 왓슨 윌리엄스에 의해 수행 되었다. 그러나, 임상 작은 섬 이식에 중요 한 돌파구에 드 몬 튼 프로토콜 달성 했으며 이후, 국가 프로그램의 일련의 개발된². 과거에는, 골 수, omental 주머니, 근육 지역, 위 점 막 표면, 비장, 신장 캡슐 등 여러 사이트 전 임상 모델에서 탐구 했다 하지만 포털 정 맥 시스템은 적합 하 고 효과적인 사이트 중 하나로 간주 됩니다. 대 한 임상 프로그램^3,4,,56.

인슐린의 외 인 관리 섬 포털 정 맥으로 주입 하 여 교체하실 수 있습니다. 산소 공급은 하류 위치 네이티브 췌에 포털 동맥과 정 맥의 합류에의 하기 때문에 선호 하는 사이트는 것입니다. 또한, 거기는 큰 표면적은 독도의 3 차원 구조를 유지 수 있습니다, 그리고 vascularization 촉진된⁵수 있습니다. 받는 사람 당뇨병 마우스, 2000 또는 돼지 섬 등가물 또는 350 마우스에서 독도 hyperglycemic 국가^7,8반대로 적절 한 있습니다. Euglycemic 레벨 syngeneic 마우스 대 마우스 이식에서 120 일 이상 xenogeneic 독도 수용자 마우스 마우스 모델에서 마우스 받는 모델에 15 일 동안 보고 했다.

문맥을 통해 섬 이식의 효능 관련 요소는 적절 한 마 취, 펑크, 그리고 hemostasis⁹의 방법. 마 취는 흡입 (5 %isoflurane) 또는 주입 (마 취 제, xylazine, 또는 pentobarbital)에 의해 유도 될 수 있다 그리고 물질 자주 결합. 깊이의 제어 및 마 취의 시간에 대 한 마우스, 점 막, 눈 뚜껑, 각 막 반사, 호흡 속도, 그리고 체온의 색 등의 상태에 관심을 지불 합니다. 그것은 동물 고군분투 하지 하 고 그것은 작동 살아 난다는 것이 중요입니다. 온도 유지 될 수 있다 난방 패드, 등 다른 난방 장치에 의해 레드 전구, 등 A 따뜻한 열 플레이트 마우스와의 발생을 방지 하는 작업 테이블을 25-30 ° C의 온도 유지 하는 데 사용 되었습니다. 저체온증입니다. 마 취약의 복용량은 중요 하다, 그들 모두는 간장에 의해 대사는 하 고 간 기능을 뚜렷이 섬 서 스 펜 션. 의 주입에 의해 무질서 수 있습니다. 문맥에 대 한 이상적인 펑크 점은 첫 번째 및 두 번째 지류 정 맥 사이 위치입니다.

독도 의도 주입 볼륨의 수 또한 영향을 미칠는 이식의 결과 과도 한 볼륨 전단 응력을 증가 수 있습니다. 0.2 mL 볼륨 포털 정 맥으로 작은 섬 이식에 대 한 적절 한 간주 됩니다. 찌른 상처 (26-게이지 바늘) 신속 하 고 효과적인 방식으로 중지 하는 문맥에서 출혈을 유도 합니다. 멸 균 거 즈 나 손가락은 출혈을 멈추게 하는 약 6 분 빵 꾸의 사이트에 최소한의 압력으로 적용할 수 있습니다. 찍은 함께, 포털 섬 주입 효과적 이며 화학적으로 유도 된 당뇨병 마우스 모델에서 혈액 포도 당 수준 이상의 레 귤 레이 션을 제공 합니다.

프로토콜

이 프로토콜의 모든 절차는 독일 동물 복지 법률과 지침에 의해 승인 되었습니다. 10 월에 12 주 된 NMRI 누드 마우스 C57Bl/6 마우스를 사용 하 여 고려 (기증자: 오래 된 여성, 받는 사람: 남성) 실험을 통해. 섬 격리 NMRI 누드 마우스를 사용 합니다. 로컬 동물 시설 규정에 따라 정의 된 조건 하에서 생쥐를 유지 합니다.

1입니다. 당뇨병 Streptozotocin으로 유도

1. -4 일에 10 ~ 12 주 된 NMRI 누드 마우스 및 무게 기계를 사용 하 여 C57Bl/6 쥐의 몸 무게를 측정 합니다.
2. 측정 된 몸 무게에 따라 마우스 당 염 분의 0.1 ml에서 streptozotocin의 180 mg/kg의 복용량을 준비 합니다.
   참고: Streptozotocin 해야 갓 사용 하기 전에 준비 되며, 그것은 빛에 민감한 알루미늄 호 일로 덮여.
3. Syngeneic 및 수용자 마우스 각각 streptozotocin (180 mg/kg)의 0.1 mL의 단 하나의 복용량 intraperitoneally 26 G 바늘을 사용 하 여 주사.
4. 날-3,-2와-1 비 단식 쥐의 꼬리 정 맥을 puncturing 의해 2-4 µ L의 혈액을 수집 합니다.
5. 테스트 스트립 당 혈액 샘플의 2-4 µ L를 사용 하 여 NMRI 누드 마우스 C57Bl/6 쥐에서 혈당을 측정
   참고:이 시점에서 쥐의 80% 해야 될 당뇨병 (20 mmol/L).
   1. 그들의 혈액 포도 당 수준을 20 mmol/l.에 도달 작은 섬이 식을 위한 마우스를 사용

2입니다. 쥐에서 췌 장 독도의 격리

1. 26-G 바늘으로 복 주입에 의해 케 타 민 (100mg/kg 몸 무게)와 xylazine (20 mg/kg 체중) 마우스를 anesthetize.
   참고: 마 취 제 및 xylazine의 볼륨 (0.10 mL/10 g) 동물의 몸 무게에 따라 결정 됩니다.
2. 부정사 위치에 쥐를 유지 하 고 소독 povidone-요오드 솔루션. 페달 반사를 확인 하 여 적절 한 안락사를 확인 합니다.
   참고: C57Bl/6의 경우 복 부 지구를 면도.
3. 피부 미세 집게로 잡고 고 중간 절 개를가 위로 복 부 구멍을 폭로. 멸 균 거 즈 압축에 내장 사이트 왼쪽 및 복 부 구멍의 외부를 배치 합니다.
4. 췌 장 및 다른 관련 된 위치를 다른 방향으로 위 조정 조직.
5. 대동맥에 도달 하 고 혈액을 배수 하기 위하여 작은 상처를. 멸 균 거 즈를 사용 하 여 혈액 흡수에 대 한.
6. 조심 스럽게 소장 제거. 위장과 비장 췌를 구분 합니다.
7. 삭제할 췌 하 고 신선한 페 트리 접시에 두십시오. 지방, 집게를 사용 하 여 같은 모든 원치 않는 자료를 제거 합니다.
8. 콜라의 4 mL와 5 mL 주사기를 췌 26 G 바늘으로 주입 (재고 솔루션: 행 크의 솔루션의 12 mL에서 콜라의 30 밀리 그램).
9. 향상 된 소화와 12 mL 빨간 모자 튜브에 대 한 표면적 증가 위 췌를 말하다.
   참고: 행 크의 균형 소금 솔루션: HBSS 10 배 (100 mL), 페니실린-스 (10 mL), Gentamycin (1 mL), Ciprofloxacin (10 mL), HEPES (35 mL), 소 주 H₂O (900 mL)
10. 떨고 물 욕조에 37 ° C에서 10 분을 소화를 수행 합니다. 와 15에 대 한 일정 한 간격에 몇 번이 고 샘플 동 s.
11. 3 분 동안 손으로 소화 췌를 적극적으로 혼합 하 고 10 얼음에 s.
12. 소화 반응 및 실 온에서 3 분 560 x g에서 원심 분리기를 막으려고 찬 행 크의 솔루션의 6 mL를 추가 합니다.
13. 상쾌한을 제거 하 고 실 온에서 파커/태아 종 아리 혈 청 (P/FCS) 중간의 10 mL에 펠 릿을 디졸브.
    참고: P/FCS 매체: TCM-199 10 배 (100 mL), FCS (50 mL), 페니실린-스 (10 mL), HEPES (20 mL), 소 주 H₂O (900 mL)
14. 가벼운 현미경 (회전 타원 체, 골든-브라운 색) 그들의 형태에 따라 독도 식별 합니다. 어두운 센터와 함께 독도를 하지 마십시오. 순도 생존에 대 한 가벼운 현미경 얼룩 dithizone 수행 하 여 확인 하십시오.
    참고: Dithizone 아연 이온을 하 고는 독도에 붉은 색 얼룩을 제공 합니다.
15. 1 mL 피 펫을 사용 하 여 계산 하 고 가벼운 현미경 독도 따 고 P/FCS 매체의 4 mL를 포함 하는 신선한 페 트리 접시 (60 m m x 15 m m)에 그들을 전송.
    참고: 볼륨의 P /페 트리 접시에 FCS 매체 산소 가용성을 보장 하기 위해 4 mL를 초과 해서는 안됩니다.
16. 인큐베이터에서 37 ° C에서 P/FCS 매체 하룻밤 4 mL에 격리 된 독도 유지.

3입니다. 섬 이식에 대 한 동물의 준비

1. 37 ° C 배양 기에서 격리 된 독도 제거 하 고 흐름 벤치에서 그들을 배치. 페 트리 접시의 원형 스윙 모션 독도 센터.
2. P/FCS 매체의 0.1 mL에 1 mL 주사기 (블루 23 G 바늘)를 채우십시오. 그런 다음, 행 크의 솔루션의 0.3 ml에서 350 독도 추가 합니다. 정착 독도 수 있도록 수직 위치에 주사기를 유지.
3. 0.05 mL를 볼륨을 감소 하 고 갈색 26 G 바늘으로 블루 23 G 바늘을 바꿉니다. 같은 주사기를 주사기에 0.2 mL의 최종 볼륨에 도달 가기 Ficoll (밀도 그라데이션 중간)의 0.15 mL를 추가 합니다. 공기 방울을 피하십시오.
4. 수직 위치에서 주사기를 유지 하 고 독도의 응집을 피하기 위해 약간 그것을 회전. 독도 2-3 분 이내 주사기에 정착 됩니다.
5. 받는 사람 마우스;의 몸 무게와 혈액 포도 당 수준을 측정합니다 혈액 포도 당 수준이 약 20 mmol/l. 해야 합니다.
6. 26-G 바늘으로 복 주입에 의해 케 타 민 (100mg/kg 몸 무게)와 xylazine (20 mg/kg 체중) 마우스를 anesthetize.
7. 따뜻한 열 플레이트 (37 ° C)에서 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 발가락을 곤란 하 게 하 여 마 취의 깊이 확인 합니다.
8. Povidone-요오드 솔루션 (피부 살 균 제)와 복 부 지역 청소. 눈이 건조 하지 않도록 유지 그들 눈 연 고와 촉촉한.
   참고: C57Bl/6의 경우 복 부 지구를 면도.

4. 섬 이식 Intraportal 경로 통해

1. 0 일에는 개복 술과 집게와 피부를 유지 하 고 2-3 cm에 의해 시작-한가 위 절 개 긴 중간. 장소는 메 마른 젖은 거 즈 촉촉한 유지 하 상처 가장자리 압축.
2. 멸 균 거 즈 압축에 왼쪽 및 복 부 구멍 밖에 내장 사이트를 놓습니다.
   참고: 내장 프로시저 미리 따뜻하게 0.9 %NaCl 용액 또는 일반 식 염 수에 담근 멸 균 거 즈를 통해 촉촉한 유지.
3. 십이지 장 이동한 췌를 찾습니다. 문맥 췌를 위로 밀어 복 부 사이트에서 위치를 찾습니다. 손가락 및 엄지를 사용 하 여 포털 정 맥 노출, 노출, 일단 간 가까이 펑크.
4. 1 분 이내 천천히 그리고 꾸준히 독도의 어떤 누설을 피하기 위해 돋보기의 검사에서 문맥에 독도 (0.2 mL 3.4 단계에서)을 주사.
   참고: 후 주입, 항상 확인 주사기에 남아 있는 독도 대 한. 받아 P/FCS 미디어의 1 mL 주사기, 신선한 페 트리 접시를 현미경 하에서 계산으로 플러시.
5. 펑크 사이트에서 살 균 계기를 배치 하 고 검지 손가락으로 압력을 적용 (침투 깊이: 0.5-1 c m) 6 분 출혈을 멈추게.
   참고: 주입 볼륨 0.2 mL를 초과 하지 않아야 합니다. 과도 한 볼륨 및 압력 전단 응력으로 인해 독도 손상 수 있습니다.
6. 조심 스럽게 내장 사이트, 복 막, 복 부 근육 층과 근 막에 다시.
7. 집게를 사용 하 여, 피부, 근육 절 개 흡수 실크 봉합, 그리고 2-3 클립 위쪽 피부 레이어를 닫습니다.
8. 피부 소독 제와 표면 청소, 상처 치유, 적용 하 고 개별 장에 쥐를 놓습니다. 상처 치유 및 단식 및 이차 감염에서 보호 방수 아크릴 레이어를 제공 합니다.
   참고: 때까지 그들은 충분 한 의식 회복가지고 쥐를 관찰, 체액 함께 tramadol (마우스 당 0.2 mg)을 제공 합니다. 이 프로토콜에서 마우스 마 취에서 빠르게 회복 하 고 tramadol 관리 고통을 감소. 7 일 후 상처를 치유 한다.
9. 일반 음식과 물 쥐 먹이. 음식과 물 소비 및 소변 배설 streptozotocin 주입 후 증가할 것 이다.
10. 첫 주 한 주 syngeneic 마우스에 다음 번에 대 한 매일 혈액 포도 당 수치를 측정 합니다. 수용자 마우스에서 최대 15 일 동안 일주일에 세 번 혈액 포도 당 수준을 측정 합니다.

결과

이식된 독도의 역량은 화학적으로 유발 된 당뇨 쥐에서 연구 했다. 독도 당뇨병 쥐 모델에서 포털 정 맥 시스템을 통해 이식 했다. 기증 받는 사람 비율 2:1 이었다. Syngeneic 마우스 모델에서 두 기증자 쥐 350 독도를 활용 했다. 독도 다음 당뇨병 쥐에 이식 했다. 혈액 포도 당 수준에 있는 감소는 이식, 이식된 췌 장 독도 혈액 포도 당 수준을 감소에서 역할을 제안 후 1 일에 ?...

토론

본이 연구에서는 섬 이식의 intraportal 경로 탐구 된다. 이 프로토콜 당뇨 스트레스 완화에 매우 효율적 이며 섬 이식 연구를 탐구 하는 깊이 있는 기회를 제공 합니다. 이 프로토콜은 약 350 murine 독도 hyperglycemic 상태를 역전 할 수 있다 확인 한다. 또한, 쥐의 절차 동안, 죽 었 고 glycemic 제어 모든 받는 사람에 달성 했다. 몸 무게와 혈액 포도 당 수준의 능력, 표준, 및 반대로 혈당에 이식된 독도의 기?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 mice	Charles River (Sulzfeld, Germany)		(10-12 weeks)
BALB/c mice	Charles River (Sulzfeld, Germany)		(10-12 weeks)
NMRI nude mice	Charles River (Sulzfeld, Germany)		(10-12 weeks)
Ketamine	Bela-pharm
Xylazine	CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH
Syringe, 23G and 26G needle	BD
Petri Dish	Falcon	303800
NaCl	Carl Roth	351007
Sterile Gauze	Fuhrmann	7647-14-5
Shaking Water bath	Kotterman	1501
Scissors	Braun	1501
Glucose Meter	One Touch
Warm Thermal Plate	Thermo Fisher
Braunol (povidone-iodide solution)	B.Braun Melsungen AG	3864154
Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment)	Dr. G Mann Chem.-Pharm.  GmbH
Incubator	Fa. Roth
Flow Bench	Herdus
Ficoll	Sigma-Aldrich	10771
5-0 Silk Suture Vicryl	Braun		(7.5 *1.75mm)
Michel Clamps (clips)	Aesculap	BN507R
P/FCS Solution	Gibco	21180-021
TCM-199 (10x)	Gibco	21180-021
FCS	Biowest	S1810-500
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
HEPES (1 M)	Biochrom	L 1613
Gentamycin	Ratiopharm
Ciprofloxacin	Fresenius Kabi
Hank's Solution	Gibco	14060-040
Collagenase	Roche	11213865001
Streptozotocin	Calbiochem	572204
OPSITE-spray (wound healer)	Smith and nephew	66004978
Reugular food	Altromin
Head light LED 16042 (magnifying glass)	Eschenbach	16042
Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody	Millipore, Chemicon	CBL1337	Dilution (1:100)
Donkey anti-rat secondary antibody	Dianova	712095153	Dilution (1:400)
Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody	Dako	A0564	Dilution (1:500)
Donkey anti-guinea pig secondary antibody	Dianova	706-259-148	Dilution (1:400)