Intraporte Transplantation d’îlots pancréatiques dans le modèle murin

Résumé

La transplantation d’îlots pancréatiques est une façon d’atteindre la normoglycémie dans le diabète de type 1. Cet article se concentre sur la technique de transplantation la voie intraporte de maintenir une glycémie normale chez des souris diabétiques.

Résumé

La transplantation d’îlots pancréatiques pour réduire l’hyperglycémie est très réussie chez les rongeurs souffrant de diabète chimiquement induite. Le site de transplantation plus courant dans la transplantation d’îlots expérimentale est la capsule rénale. Toutefois, comme on connaît moins l’interaction des îlots pancréatiques avec les constituants du sang, il est également judicieux d’utiliser l’approche de la veine porte dans la transplantation d’îlots expérimentale.

Ce protocole montre une technique de transplantation îlot intraporte chez la souris nude NMRI. Streptozotocine (180 mg/kg) est injecté par voie intrapéritonéale pour provoquer l’hyperglycémie chez les bénéficiaires. Ils sont considérés comme diabétique à un non-jeûne glycémie supérieures à 20 mmol/L. Un jour avant la greffe, les îlots pancréatiques de souris sont isolés par le pancréas du donneur par digestion de collagénase ; un minimum de 350 îlots sont utilisés par le destinataire diabétique. Selon le rendement d’isolation îlot, souris de donateurs de deux ou plusieurs sont utilisés par le destinataire. Après une culture à 37 ° C, les îlots sont administrés dans le destinataire foie via la veine porte. Après la chirurgie, les souris sont protégées dans des maisons de Makrolon rouges et observées jusqu'à sont éveillés. Ce protocole maintienne un équilibre glycémique pour 120 jours chez les souris syngéniques et 15 jours chez les souris allogéniques.

Introduction

Transplantation d’îlots pancréatiques est une approche prometteuse pour traiter 1 diabète sucré de type¹. La première tentative de transfert d’un fragment du pancréas de moutons dans un patient diabétique a été interprétée par Watson Williams en 1893. Cependant, une percée majeure dans la transplantation d’îlots clinique a été réalisée avec le protocole d’Edmonton, et par la suite, une série de programmes nationaux ont été développés². Dans le passé, plusieurs sites, comme la moelle osseuse, pochette épiploïques, région intramusculaire, surface de la muqueuse gastrique, rate et capsule rénale, ont été explorés dans les modèles précliniques, mais le système veineux portal est considéré comme un des sites adaptés et efficaces pour les programmes cliniques^3,4,5,6.

L’administration d’insuline exogène peut être remplacée par perfusion d’îlot dans la veine porte. Ceci est considéré comme un site privilégié parce que l’alimentation en oxygène est comparable à celle du pancréas natif en raison de la situation en aval du confluent du portail artère et veine. De plus, il y a une grande surface, afin de préserver la structure tridimensionnelle des îlots peut-être être et vascularisation pourrait être facilitée⁵. Dans une souris diabétique bénéficiaire, 2 000 équivalents humains ou porcins îlot ou souris 350 îlots sont adéquates pour renverser l’État hyperglycémique^7,8. Euglycémique niveaux ont été rapportés pendant 15 jours chez la souris destinataire des îlots xénogéniques et dans le modèle de souris allogénique et plus de 120 jours à la transplantation à-souris syngénique.

Facteurs pertinents à l’efficacité de la transplantation d’îlots via la veine porte sont appropriée anesthésie, méthode de ponction et hémostase⁹. L’anesthésie peut être induite par l’inhalation (5 % isoflurane) ou injection (kétamine, xylazine ou pentobarbital), et les substances sont souvent combinés. Pour le contrôle de la profondeur et le temps de l’anesthésie, convient à l’état de la souris, telles que la couleur de la muqueuse, paupière, réflexe cornéen, la fréquence respiratoire et la température corporelle. Il est important de s’assurer que l’animal n’est pas mal et qu’il survit à l’opération. La température peut être maintenue par des appareils de chauffage différents, tels que les coussins chauffants, ampoules d’éclairage rouge, etc. A chaud plaque thermique a été utilisé pour maintenir une température de 25-30 ° C entre la souris et la table d’opération, qui empêche l’apparition de hypothermie. Les dosages des anesthésiques sont importants, car chacun d’eux sont métabolisés par le foie et la fonction hépatique peut être transitoirement désordonnée par l’infusion de la suspension de l’îlot. Le point idéal de ponction de la veine porte est la position entre la première et la deuxième veine affluent.

Le nombre d’îlots et le volume d’injection prévu également influence le résultat de la transplantation, comme un volume trop élevé peut augmenter la contrainte de cisaillement. Un volume de 0,2 mL est jugé approprié pour la transplantation d’îlots dans la veine porte. La blessure de perforation (aiguille de calibre 26) induit des saignements de la veine porte, qui doit être arrêté de façon rapide et efficace. Gaze stérile ou un doigt peut être appliqué avec une pression minimale sur le site de la piqûre pendant environ 6 minutes arrêter le saignement. Prises îlot ensemble, portail injection est efficace et fournit le règlement sur le taux de glucose sanguin chez les modèles murins diabétique induite chimiquement.

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Protocole

Toutes les procédures dans le présent protocole ont été approuvés par les lignes directrices et de la Loi sur la protection animale de l’allemand. Pensez à utiliser des souris nus NMRI âgés de 10 à 12 semaines et souris C57Bl/6 (donateur : femme ; destinataire : mâle) au cours des expériences. Utilisez la souris Nudes NMRI pour l’isolement de l’îlot. Gardez les souris dans des conditions définies conformément à la réglementation locale d’animalerie.

1. l’induction du diabète par streptozotocine

1. Le jour -4, mesurer le poids corporel de 10 à 12 semaines NMRI souris nues et les souris C57Bl/6, à l’aide d’un appareil de pesage.
2. Selon le poids du corps mesurée, préparation d’une dose de 180 mg/kg de streptozotocine dans 0,1 mL d’une solution saline par souris.
   Remarque : Streptozotocine doit être fraîchement préparée avant utilisation et recouvert de papier d’aluminium, car il est sensible à la lumière.
3. Injecter les souris syngéniques et allogéniques chacun avec une dose unique de 0,1 mL de streptozotocine (180 mg/kg) par voie intrapéritonéale en utilisant une aiguille 26-G.
4. Jour -3, -2 et -1 collectent 2-4 µL de sang par ponction des veines de queue de souris non à jeun.
5. 2-4 µL de l’échantillon de sang par la bandelette de test permet de mesurer la glycémie dans des souris nus NMRI et souris C57Bl/6
   Remarque : À ce stade, 80 % des souris devrait devenir diabétique (20 mmol/L).
   1. Utilisez la souris pour la transplantation d’îlots lorsque leurs niveaux de glucose de sang atteindre 20 mmol/L.

2. isolement des îlots pancréatiques de souris

1. Anesthésier les souris avec la kétamine (100 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (20 mg/kg de poids corporel) par injection intrapéritonéale avec une aiguille 26-G.
   Remarque : Les volumes de kétamine et de xylazine aient été déterminés selon le poids corporel des animaux (0,10 mL/10 g).
2. Gardez les souris en décubitus dorsal et désinfecter avec une solution de povidone-iode. Confirmer une euthanasie correcte en vérifiant le réflexe de pédale.
   Remarque : En cas de C57Bl/6 raser la région abdominale.
3. Tendez la peau avec une pince fine et faire une incision médiane avec des ciseaux pour exposer la cavité abdominale. Placez le situs intestin à gauche et à l’extérieur de la cavité abdominale sur une compresse de gaze stérile.
4. Ajuster l’estomac dans une autre direction pour localiser le pancréas et autres associés les tissus.
5. Atteindre l’aorte et faire une petite coupure pour drainer le sang. Utiliser une gaze stérile pour l’absorption de sang.
6. Retirer délicatement l’intestin. Séparer le pancréas de l’estomac et la rate.
7. Excise le pancréas et le placer dans une nouvelle boîte de Pétri. Enlever toutes les matières indésirables, tels que gras, avec une pincette.
8. Remplissez une seringue de 5 mL avec 4 mL de collagénase et injecter dans le pancréas avec une aiguille 26-G (solution mère : 30 mg de collagénase dans 12 mL de solution de Hank).
9. Émincer le pancréas avec des ciseaux pour augmenter la surface pour une amélioration de la digestion et le transfert dans un tube à bouchon rouge 12 mL.
   NOTE : Hank équilibré de solution saline : HBSS 10 x (100 mL), (10 mL) de pénicilline-streptomycine, gentamicine (1 mL), ciprofloxacine (10 mL), HEPES (35 mL), eau distillée H₂O (900 mL)
10. Effectuer une digestion pendant 10 min à 37 ° C dans un bain d’eau secouer. Vortex l’échantillon trois fois à intervalle régulier pendant 15 s.
11. Mélanger le pancréas digéré vigoureusement à la main pendant 3 min et placez-le sur la glace pendant 10 s.
12. Ajouter 6 mL de solution de Hank froide pour arrêter la réaction de la digestion et centrifuger à 560 x g pendant 3 min à température ambiante.
13. Retirez le surnageant et dissoudre le culot dans 10 mL de milieu de sérum (P/FCS) veau Parker/foetale à température ambiante.
    NOTE : Support P/FCS : TCM-199 10 x (100 mL), FCS (50 mL), la pénicilline-streptomycine (10 mL), HEPES (20 mL), eau distillée H₂O (900 mL)
14. Identifier les îlots basés sur leur morphologie (sphéroïde, couleur brun doré) sous un microscope optique. Évitez les îlots avec des centres de sombres. Vérifier la pureté et leur viabilité en effectuant dithizone coloration sous un microscope optique.
    Remarque : Dithizone lie l’ion zinc et fournit des tache de couleur rouge aux îlots.
15. Utiliser une pipette de 1 mL à compter et îlots sous un microscope photonique cueillir à la main et de les transférer à une boîte de Pétri fraîche (60 mm x 15 mm) contenant 4 mL de milieu de P/FCS.
    Remarque : Le volume de P /moyen de FCS dans la boîte de Pétri ne doit pas dépasser 4 mL afin d’assurer la disponibilité de l’oxygène.
16. Garder les îlots isolés dans 4 mL de milieu de P/FCS pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur.

3. préparation des animaux destinés à la Transplantation d’îlots pancréatiques

1. Retirez les îlots isolés de l’incubateur à 37 ° C et les placer sous un banc de flux. Centrez les îlots avec un mouvement circulaire de la boîte de Pétri.
2. Remplissez une seringue de 1 mL (aiguille bleue de 23 G) 0,1 ml de milieu de P/FCS. Puis, ajoutez 350 îlots dans 0,3 mL de solution de Hank. Tenir la seringue en position verticale pour permettre les îlots de s’installer.
3. Diminuer le volume à 0,05 mL et remplacer l’aiguille 23-G bleue avec une aiguille de 26-G brune. À la même seringue, ajouter 0,15 mL de Ficoll (milieu de gradient de densité) vers le haut pour atteindre un volume final de 0,2 mL dans la seringue. Éviter les bulles d’air.
4. Tenir la seringue en position verticale et tourner légèrement pour éviter l’agglutination des îlots. Les îlots seront déposent dans le cône de la seringue dans les 2-3 min.
5. Mesurer les taux de glucose corps poids et le sang des souris bénéficiaires ; le taux de glycémie devrait être autour de 20 mmol/L.
6. Anesthésier les souris avec la kétamine (100 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (20 mg/kg de poids corporel) par injection intrapéritonéale avec aiguille 26-G.
7. Placez les souris en décubitus dorsal sur une assiette chaude thermique (37 ° C). Vérifier la profondeur de l’anesthésie en pinçant l’orteil.
8. Nettoyez la région abdominale avec solution de povidone-iode (désinfectant de la peau). Pour que les yeux ne se dessèchent, garder humides avec pommade ophtalmique.
   Remarque : En cas de C57Bl/6 raser la région abdominale.

4. Transplantation d’îlots pancréatiques par voie intraporte

1. Jour 0, commencer par une laparotomie en tenant la peau avec une pince et en faisant un 2-3 cm-incision longue ligne médiane avec un ciseau. Place une gaze stérile humide compresser sur les bords de la plaie pour le garder humide.
2. Placez le situs intestin à gauche et à l’extérieur de la cavité abdominale sur la compresse de gaze stérile.
   Remarque : Gardez l’intestin humide tout au long de la procédure avec préchauffé solution de NaCl 0,9 % ou de la gaze stérile trempée dans une solution saline normale.
3. Déplacer le duodénum et localisez le pancréas. Repérer la veine située sur le site ventral en appuyant vers le haut sur le pancréas. Utilisez un doigt et le pouce pour exposer la veine porte et, une fois exposé, le perforer près du foie.
4. Moins de 1 min, lentement et régulièrement injecter les îlots (0,2 mL de l’étape 3.4) dans la veine sous l’inspection de loupe pour éviter toute fuite d’îlots.
   Remarque : Après l’injection, toujours vérifier pour les autres îlots dans la seringue. Prélever 1 mL de médias P/FCS dans une seringue, encastrée dans une nouvelle boîte de Pétri et comte sous un microscope.
5. Placez une jauge stérile sur le site de ponction et appliquer une pression avec le doigt d’index (profondeur de pénétration : 0,5-1 cm) pendant 6 min arrêter le saignement.
   Remarque : Le volume injecté ne doit pas dépasser 0,2 mL. Pression et un volume trop élevé peuvent endommager les îlots en raison de la contrainte de cisaillement.
6. Placez soigneusement le situs intestin, péritoine, couche musculaire abdominal et carénage arrière en position.
7. À l’aide de pince, soulever la peau et, fermer l’incision du muscle avec suture résorbable de soie et la couche supérieure de peau avec 2-3 clips.
8. Nettoyer la surface avec un désinfectant de la peau, appliquer un guérisseur de la plaie et placez les souris dans des cages individuelles. Plaie guérisseur fournit une couche d’acrylique résistant à l’eau et protéger de macération et infection secondaire.
   Remarque : Observer les souris jusqu'à ce qu’ils ont repris conscience suffisante, fournir tramadol (0,2 mg / souris), ainsi que des fluides. Dans ce protocole, souris récupéré de l’anesthésie rapidement et l’administration de tramadol réduit la douleur. Après 7 jours, la plaie doit guérir.
9. Nourrir les souris avec l’eau et de nourriture. Excrétion nourriture et l’eau de consommation et de l’urine va augmenter après l’injection de streptozotocine.
10. Mesurer la glycémie chaque jour, pendant la première semaine et puis une fois par semaine chez les souris syngéniques. Chez les souris allogéniques, mesurer le taux de glucose sanguin trois fois par semaine pendant 15 jours.

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Résultats

La compétence des îlots transplantés a été étudiée chez des souris diabétiques induites chimiquement. Les îlots ont été transplantés via le système veineux portal dans le modèle de souris diabétiques. Le ratio entre donateurs et bénéficiaires était de 2:1. Dans le modèle souris syngénique, deux souris de bailleurs de fonds ont été utilisés pour obtenir 350 îlots. Les îlots ont été ensuite transplantées chez des souris diabétiques. Une réduction des taux de gl...

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Discussion

Dans cette étude, la route intraporte de la transplantation d’îlots pancréatiques est explorée. Ce protocole est très efficace pour soulager le stress diabétique et approfondie permet d’explorer études de transplantation d’îlots pancréatiques. Ce protocole confirme qu’environ 350 îlots murins sont capables d’inverser l’État hyperglycémique. Par ailleurs, aucune des souris sont morts au cours de la procédure, et contrôle de la glycémie ont été accompli dans tous les destinataires. Taux de gluc...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 mice	Charles River (Sulzfeld, Germany)		(10-12 weeks)
BALB/c mice	Charles River (Sulzfeld, Germany)		(10-12 weeks)
NMRI nude mice	Charles River (Sulzfeld, Germany)		(10-12 weeks)
Ketamine	Bela-pharm
Xylazine	CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH
Syringe, 23G and 26G needle	BD
Petri Dish	Falcon	303800
NaCl	Carl Roth	351007
Sterile Gauze	Fuhrmann	7647-14-5
Shaking Water bath	Kotterman	1501
Scissors	Braun	1501
Glucose Meter	One Touch
Warm Thermal Plate	Thermo Fisher
Braunol (povidone-iodide solution)	B.Braun Melsungen AG	3864154
Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment)	Dr. G Mann Chem.-Pharm.  GmbH
Incubator	Fa. Roth
Flow Bench	Herdus
Ficoll	Sigma-Aldrich	10771
5-0 Silk Suture Vicryl	Braun		(7.5 *1.75mm)
Michel Clamps (clips)	Aesculap	BN507R
P/FCS Solution	Gibco	21180-021
TCM-199 (10x)	Gibco	21180-021
FCS	Biowest	S1810-500
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
HEPES (1 M)	Biochrom	L 1613
Gentamycin	Ratiopharm
Ciprofloxacin	Fresenius Kabi
Hank's Solution	Gibco	14060-040
Collagenase	Roche	11213865001
Streptozotocin	Calbiochem	572204
OPSITE-spray (wound healer)	Smith and nephew	66004978
Reugular food	Altromin
Head light LED 16042 (magnifying glass)	Eschenbach	16042
Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody	Millipore, Chemicon	CBL1337	Dilution (1:100)
Donkey anti-rat secondary antibody	Dianova	712095153	Dilution (1:400)
Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody	Dako	A0564	Dilution (1:500)
Donkey anti-guinea pig secondary antibody	Dianova	706-259-148	Dilution (1:400)