JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Трансплантация поджелудочной островок является способом достижения нормогликемия в диабет типа 1. Эта статья посвящена трансплантации технику через intraportal маршрут для поддержания нормальной глюкозы в диабетических мышей.

Аннотация

Трансплантация поджелудочной островок для снижения гипергликемии весьма успешным в грызунов с химически индуцированной сахарным диабетом. Наиболее распространенным сайт трансплантации в экспериментальной островок трансплантации является капсулу почки. Однако поскольку меньше известно о взаимодействии панкреатических островков с составляющих крови, также имеет смысл использовать подход воротной вены в экспериментальной островок пересадке.

Этот протокол демонстрирует метод трансплантации intraportal островок в ВММНИИ обнаженной мышей. Стрептозотоцин (180 мг/кг) вводят внутрибрюшинно побудить гипергликемии у получателей мышей. Они рассматриваются как диабетическая в пост-уровень глюкозы крови больше, чем 20 ммоль/л Один день до трансплантации, мыши панкреатических островков изолированы от доноров поджелудочной железы, коллагеназа пищеварения; как минимум 350 островков используются каждого диабетическая получателя. В зависимости от урожайности изоляции островок, два или более доноров мышей используются для каждого получателя. После ночи культуры при 37 ° C островки вводят в получателей печени через воротной вены. После операции, мышей были защищены в красных домов Makrolon и наблюдается до просыпаются. Этот протокол поддерживает гликемического контроля для 120 дней в сингенных мышей и 15 дней в аллогенной мышей.

Введение

Островок трансплантация это перспективный подход для лечения 1 сахарный диабет типа1. В 1893 году Уотсон Уильямс была выполнена первая попытка перевести фрагмент поджелудочной железы овец в диабетических пациентов. Однако был достигнут крупный прорыв в клинической островок пересадке с протоколом Эдмонтон, и впоследствии ряд национальных программ были развитые2. В прошлом несколько сайтов, таких как костного мозга, Сальниковая сумка, внутримышечные региона, желудка слизистой поверхности, селезенки и капсула почек, были изучены в доклинических моделях, но Портал венозной системы рассматривается как одна из подходящие и эффективного сайта для клинических программ3,4,5,6.

Экзогенные администрации инсулина могут быть заменены островок вливания в воротной вены. Это считается предпочтительным местом, поскольку поступление кислорода сопоставима с родной поджелудочной железы из-за расположения ниже по течению впадения портала артерии и Вены. Кроме того существует большой площадью поверхности, так что трехмерной структуры островки могут быть сохранены, и васкуляризация может быть облегченной5. В получателей Диабетическая мышь, 2000 человека или свиных островковых эквиваленты или 350 мыши островков адекватны вспять гипергликемической государственная7,8. Euglycemic уровнях сообщалось на 15 дней в модели мыши получателя культивированная островков и аллогенной модели мышь и более чем 120 дней в сингенных мышь для трансплантации.

Факторы, касающиеся эффективности трансплантации островковых через воротной вены являются соответствующие анестезии, методом прокола и гемостаз9. Анестезии может быть вызвана ингаляции (5% изофлюрановая) или инъекции (кетамин, Ксилазина или Пентобарбитал), и вещества, часто сочетаются. Для контроля глубины и времени анестезии внимание следует уделять состояние мыши, такие как цвет слизистой, глаз крышкой, роговицы рефлекс, частота дыхания и температуру тела. Важно обеспечить что животное не борется и что он выживает операции. Температура может управляться различными нагревательными приборами, например, грелки, красный свет ламп, теплые термальные пластины и т.д. А был использован для поддержания температуры 25-30 ° c между мышью и таблицу операции, которая предотвращает возникновение гипотермии. Дозы обезболивающих средств важное значение, поскольку все они метаболизируются в печени, и функции печени может быть временно неупорядоченных инфузии островок подвеска. Точкой идеальный пункции воротной вены является позиция между первой и второй приток вен.

Количество островков и объем предполагаемых инъекций также повлиять на результаты трансплантации, как чрезмерный объем может увеличить напряжение сдвига. Объем 0,2 мл считаются подходящими для трансплантации островковых в воротной вены. Puncturing раны (26-иглы) вызывает кровотечение из воротной вены, который должен быть остановлен в своевременным и эффективным образом. Стерильные марлевые или палец может применяться с минимальным давлением в месте пункции для около 6 минут, чтобы остановить кровотечение. Взятых вместе, портал островок инъекции является эффективным и обеспечивает регулирование уровня глюкозы в крови в химически индуцированных диабетической мыши модели.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры в этом протоколе были одобрены немецкого животного благосостояния закон и руководящие принципы. Рассмотрите возможность использования 10 - до 12-недельных ВММНИИ обнаженной мышей и мышей C57Bl/6 (доноров: старая самка; получателя: мужской) на протяжении экспериментов. Используйте ВММНИИ обнаженной мышей для изоляции островок. Держите мышей при определенных условиях согласно правилам Фонд местных животных.

1. индукция диабета, Стрептозотоцин

  1. В день -4 измерения веса от 10 до 12 недельных ВММНИИ обнаженной мышей и мышей C57Bl/6, с помощью весом машины.
  2. Зависимости от измеренного веса Подготовьте дозе 180 мг/кг Стрептозотоцин в 0,1 мл физиологического раствора на мышь.
    Примечание: Стрептозотоцин следует свежезаваренным подготовлен перед использованием и покрытые алюминиевой фольги, ведь светочувствительные.
  3. Вводить мышь сингенных и аллогенной друг с однократной дозе 0,1 мл Стрептозотоцин (180 мг/кг) внутрибрюшинно с помощью иглы 26-G.
  4. В день -3 -2 и -1 собирать 2-4 мкл крови путем прокола Вены хвост не постился мышей.
  5. Использовать 2-4 мкл крови на тест-полоски для измерения глюкозы в крови в ВММНИИ обнаженной мышей и мышей C57Bl/6
    Примечание: В этой точке, 80% мышей должна стать диабетическая (20 ммоль/Л).
    1. Используйте мышь для трансплантации островковых, когда их уровень глюкозы в крови достигает 20 ммоль/л

2. изоляция панкреатических островков от мышей

  1. Анестезировать мышей с кетамин (100 мг/кг массы тела) и ксилазина (20 мг/кг массы тела) внутрибрюшинной инъекции иглой 26-G.
    Примечание: Объемы кетамина и ксилазина были определены согласно веса животных (0,10 мл/10 g).
  2. Держите мышей в лежачем положении и лечить с повидон йод раствор. Подтверждение правильного эвтаназии, установив педаль рефлекс.
    Примечание: В случае C57Bl/6 бреют области живота.
  3. Придерживайте кожу с тонкой щипцами и сделать срединной линии разреза с помощью ножниц выставить брюшной полости. Место кишечника situs слева и вне брюшной полости на стерильные марлевые компрессы.
  4. Отрегулируйте желудка в другом направлении, чтобы найти поджелудочной железы и других связанных тканей.
  5. Достичь аорты и сделать небольшой надрез для стока крови. Используйте стерильные марлевые для крови поглощения.
  6. Осторожно удалите кишечника. Отделите поджелудочной железы от желудка и селезенки.
  7. Акцизный поджелудочной железы и поместите его в свежие чашку Петри. Удалите все нежелательные материалы, такие как жир, используя пинцет.
  8. Заполните шприц 5 мл с 4 мл коллагеназы и вставляют поджелудочной железы с иглой 26-G (stock решение: 30 мг коллагеназы 12 мл раствора Хэнка).
  9. Фарш поджелудочной железы с ножницами, чтобы увеличить площадь поверхности для лучшего пищеварения и передачи 12 мл Красная шапочка.
    Примечание: Хэнк сбалансированного солевого раствора: HBSS 10 x (100 мл), пенициллин-стрептомицином (10 мл), гентамицин (1 мл), Ципрофлоксацин (10 мл), HEPES (35 мл), дистиллированная H2O (900 мл)
  10. Выполните пищеварение 10 минут при 37 ° C в тряску водяной бане. Вихревой образца трижды в регулярном интервале 15 s.
  11. Смешать переваривается поджелудочной железы энергично руку на 3 мин и поместите его на льду для 10 s.
  12. Добавьте 6 мл холодного Хэнк решение, чтобы остановить пищеварение реакции и центрифуги на 560 x g 3 мин при комнатной температуре.
  13. Удалить супернатант и растворяют гранулы в 10 мл Паркер/плода телячьей сыворотки (P/FCS) среды при комнатной температуре.
    Примечание: P/FCS средний: TCM-199 10 x (100 мл), FCS (50 мл), пенициллин-стрептомицином (10 мл), HEPES (20 мл), дистиллированная H2O (900 мл)
  14. Идентифицировать островков, основанный на их морфологии (сфероида, золотисто коричневого цвета) под микроскопом света. Избегайте островков с темной центрами. Проверка чистоты и жизнеспособности, выполняя Дитизон окрашивание под микроскопом света.
    Примечание: Дитизон связывается иона цинка и обеспечивает пятно красного цвета к островкам.
  15. Использование пипетки 1 мл рассчитывать и handpick островков под микроскопом света и передавать их на свежий Петри (60 x 15 мм) содержащий 4 мл среды P/FCS.
    Примечание: Объем P /среднего FCS в чашке Петри не должен превышать 4 мл с целью обеспечения наличия кислорода.
  16. Держите изолированных островков в 4 мл P/FCS среднего ночь при 37 ° C в инкубаторе.

3. Подготовка животных для трансплантации островковых

  1. Удаление изолированных островков из инкубатора 37 ° C и разместите их под скамейке потока. Центр островков с круговой качание Петри.
  2. Заполните шприц 1 мл (синяя игла 23-G) с 0,1 мл среды P/FCS. Затем добавьте 350 островков в 0,3 мл раствора Хэнка. Держите шприц в вертикальном положении, чтобы позволить островков урегулировать.
  3. Уменьшить громкость до 0,05 мл и заменить синий иглой 23 G с иглой коричневый 26-G. Же шприц добавьте 0,15 мл Ficoll (градиент средней плотности) вверх, чтобы достичь окончательного объема 0,2 мл в шприц. Избегайте воздушных пузырей.
  4. Держите шприц в вертикальном положении и поверните его немного, чтобы избежать слипания островков. Островки осядет на конус шприца в течение 2-3 мин.
  5. Измерить тела вес и крови глюкозы получателя мышей; уровень глюкозы в крови должна быть около 20 ммоль/л
  6. Анестезировать мышей с кетамин (100 мг/кг массы тела) и ксилазина (20 мг/кг массы тела) внутрибрюшинной инъекции иглой 26-G.
  7. Место мыши в лежачем положении на теплый экзотермической пластины (37 ° C). Проверка глубины анестезии путем защемления ног.
  8. Чистота области живота с повидон йод раствор (кожу дезинфицирующее). Чтобы предотвратить высыхание глаза, держите их влажными с глазную мазь.
    Примечание: В случае C57Bl/6 бреют области живота.

4. островок пересадке через Intraportal маршрут

  1. В день 0, начните с лапаротомия, удерживая кожи пинцетом и сделать 2-3 см-разрез длиной срединной линии с ножницами. Место, Влажные Салфетки марлевые сжать вокруг края раны, чтобы держать его влажным.
  2. Место кишечника situs слева и за ее пределами брюшной полости на стерильные марлевые компрессы.
    Примечание: Держите кишечник влажной на протяжении всей процедуры с подогретым 0,9% раствор NaCl или стерильной марли, смоченной в нормальное saline.
  3. Переместить двенадцатиперстную кишку и найдите поджелудочной железы. Найдите воротной вены, расположенный в вентральной сайт, нажав поджелудочной железы вверх. Использовать палец и большой палец подвергать воротной вены и, после пункции недалеко от печени.
  4. В течение 1 мин медленно и неуклонно inject островков (0,2 мл из шага 3.4) в портальной Вене под инспекции увеличительное стекло, чтобы избежать утечки островков.
    Примечание: После инъекций, всегда проверяйте оставшиеся островки в шприц. Возьмите 1 мл P/FCS СМИ в шприц, скрытой в свежие чашку Петри и игр под микроскопом.
  5. Поместите стерильные датчика на сайте проколам и приложите давление с указательный палец (глубина проникновения: 0,5-1 см) на 6 минут, чтобы остановить кровотечение.
    Примечание: Объем инъекции не должен превышать 0,2 мл. Чрезмерный объем и давление может повредить островков из-за напряжения сдвига.
  6. Осторожно поместите обратно в положение кишечника situs, брюшины, слой мышц живота и фасции.
  7. С помощью щипцов, снять кожу, закрыть разрез мышц с рассасывающиеся шовные шелка и верхний слой кожи с 2-3 клипы.
  8. Очистить поверхность дезинфицирующим кожи, применять рана целителя и место мышей в индивидуальных клетках. Рана целителя обеспечивает слой водонепроницаемый акрилата и защитить от мацерации и вторичной инфекции.
    Примечание: Наблюдать мышей до тех пор, пока они достаточно сознание, обеспечивают трамадола (0,2 мг / мышь) наряду с жидкостями. В этом протоколе мышей быстро оправился от анестезии и трамадол администрации уменьшить боль. После 7 дней должны залечить раны.
  9. Кормить мышей с регулярной еды и воды. Пищи и воды потребления и моча мочой будет увеличиваться после инъекции Стрептозотоцин.
  10. Измерение уровня глюкозы в крови каждый день в течение первой недели, а затем один раз в неделю в сингенных мышей. Аллогенная мышей измерьте уровень глюкозы в крови трижды в неделю на срок до 15 дней.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Компетентности пересаженные островки был изучен в химически индуцированных диабетических мышей. Через портал венозной системы в модели диабетических мышей были пересаженные островки. Донор реципиент составляло 2:1. В сингенных мыши модели двух мышей доноров использ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом исследовании intraportal маршрут трансплантации островковых изучается. Этот протокол является высокоэффективным в освобождении диабетической стресс и дает возможность углубленного изучения исследований трансплантации островковых. Этот протокол подтверждает, что около 350 мышиных ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют, что они имеют никакого конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотели бы признать Гундула Hertl для ее поддержки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
C57Bl/6 mice Charles River (Sulzfeld, Germany)(10-12 weeks)
BALB/c miceCharles River (Sulzfeld, Germany)(10-12 weeks)
NMRI nude miceCharles River (Sulzfeld, Germany)(10-12 weeks)
KetamineBela-pharm
XylazineCEVA TIERGESUNDHEIT GmbH
Syringe, 23G and 26G needleBD
Petri DishFalcon303800
NaClCarl Roth351007
Sterile GauzeFuhrmann7647-14-5
Shaking Water bathKotterman1501
ScissorsBraun1501
Glucose Meter One Touch
Warm Thermal PlateThermo Fisher
Braunol (povidone-iodide solution)B.Braun Melsungen AG3864154
Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment)Dr. G Mann Chem.-Pharm.  GmbH
IncubatorFa. Roth
Flow BenchHerdus
FicollSigma-Aldrich10771
5-0 Silk Suture VicrylBraun(7.5 *1.75mm)
Michel Clamps (clips)Aesculap BN507R
P/FCS SolutionGibco21180-021
TCM-199 (10x)Gibco21180-021
FCSBiowestS1810-500
Penicillin-streptomycinGibco15140-122
HEPES (1 M)BiochromL 1613
GentamycinRatiopharm
CiprofloxacinFresenius Kabi
Hank's SolutionGibco14060-040
CollagenaseRoche11213865001
StreptozotocinCalbiochem572204
OPSITE-spray (wound healer)Smith and nephew66004978
Reugular foodAltromin
Head light LED 16042 (magnifying glass)Eschenbach16042
Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibodyMillipore, ChemiconCBL1337Dilution (1:100)
Donkey anti-rat secondary antibodyDianova712095153Dilution (1:400)
Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibodyDakoA0564Dilution (1:500)
Donkey anti-guinea pig secondary antibodyDianova706-259-148Dilution (1:400)

Ссылки

  1. McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), a007823(2012).
  2. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  3. Cantarelli, E., et al. Bone marrow as an alternative site for islet transplantation. Blood. 114 (20), 4566-4574 (2009).
  4. Echeverri, G. J., et al. Endoscopic gastric submucosal transplantation of islets (ENDO-STI): technique and initial results in diabetic pigs. American Journal of Transplantation. 9 (11), 2485-2496 (2009).
  5. Korsgren, O., et al. Optimising islet engraftment is critical for successful clinical islet transplantation. Diabetologia. 51 (2), 227-232 (2008).
  6. Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. British Journal of Surgery. 95 (12), 1449-1461 (2008).
  7. Lingwal, N., et al. Inhibition of gelatinase B (matrix metalloprotease-9) activity reduces cellular inflammation and restores function of transplanted pancreatic islets. Diabetes. 61 (8), 2045-2053 (2012).
  8. Chen, C., et al. Improved intraportal islet transplantation outcome by systemic IKK-beta inhibition: NF-kappaB activity in pancreatic islets depends on oxygen availability. American Journal of Transplantation. 11 (2), 215-224 (2011).
  9. Wang, Y., Wang, T., Zhang, L. Three aspects are critical for carrying out intraportal islet transplants successfully in a diabetes mouse model. Experimental and Clinical Transplantation. 10 (3), 302-304 (2012).
  10. Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374(2014).
  11. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  12. Rother, K. I., Harlan, D. M. Challenges facing islet transplantation for the treatment of type 1 diabetes mellitus. Journal of Clinical Investigation. 114 (7), 877-883 (2004).
  13. Su, Z., et al. Small islets are essential for successful intraportal transplantation in a diabetes mouse model. Scandinavian Journal of Immunology. 72 (6), 504-510 (2010).
  14. Rekittke, N. E., Ang, M., Rawat, D., Khatri, R., Linn, T. Regenerative Therapy of Type 1 Diabetes Mellitus: From Pancreatic Islet Transplantation to Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 22(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1351intraportal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены