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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll der gesamten Zelle elektrochemische Experimente, den Beitrag der PROTONENTRANSPORT, die Rate der extrazellulären Elektronentransport über die äußere Membran Zellfarbstoffe Komplex in Shewanella Oneidensis MR-1 zu studieren.

Zusammenfassung

Direkte elektrochemische Detektion von c-Typ Cytochrom-komplexe, eingebettet in die äußeren bakterienmembran (äußere Membran c-Typ Cytochrom-komplexe; OM c- Cyts) hat vor kurzem erwies sich als eine neuartige ganze Zelle analytische Methode um den bakteriellen Elektronentransport aus der Atmungskette der Zelle äußeren zu charakterisieren, als die extrazelluläre Elektronentransport (EET) bezeichnet. Während der Weg und die Kinetik der Elektronenfluss während der EET Reaktion untersucht wurden, hat eine ganze Zelle elektrochemische Methode zu prüfen, die Auswirkungen des kation Verkehrs EET zugeordnet noch nicht etabliert. In der vorliegenden Studie wird ein Beispiel für eine biochemische Technik zu prüfen, die Deuterium kinetische Isotop Wirkung (KIE) auf EET durch OM c- Cyts mit einem Modell Mikrobe, Shewanella Oneidensis MR-1, beschrieben. Die KIE auf den EET-Prozess erhalten Sie EET durch OM c- Cyts fungiert als die Bandbreitenbegrenzung Schritt in der mikrobiellen laufenden Produktion. Zu diesem Zweck vor der Zugabe von D2O ersetzte die überstehende Lösung mit frischen Medium mit einer ausreichenden Menge an der Elektron-Spender, die Rate der vorgelagerten Stoffwechselreaktionen zu unterstützen und eine einheitliche planktonischen Zellen entfernen Monolage Biofilm an der Arbeitselektrode. Alternative Methoden zur Bestätigung die Bandbreitenbegrenzung Schritt mikrobielle laufende Produktion als EET durch OM c- Cyts werden ebenfalls beschrieben. Unsere Technik eines ganzen Zelle elektrochemische Assays für die Untersuchung von Proton Transport Kinetik kann auf andere Elektroaktive mikrobielle Belastungen angewendet werden.

Einleitung

Elektrochemische Techniken um ein Redox-Protein in einer intakten bakteriellen Zelle direkt zu charakterisieren sind seit der Entdeckung der Metall-reduzierende mikrobielle Belastungen, z. B. S. Oneidensis MR-1 oder Geobacter Sulfurreducens PCA vor kurzem entstanden, äußere Membran Cytochrom c-Typ-komplexe (OM c-Cyts) ausgesetzt, die Zelle außen1,2,3,4,5haben. Das OM cvermitteln - Cyts Elektronentransport aus der Atmungskette auf festen Untergründen befindet sich extrazellulär. Dieser Transport wird als extrazelluläre Elektronentransport (EET)1,6 bezeichnet und ist ein kritischer Prozess für neue Biotechnologien, wie mikrobielle Brennstoffzellen-6. Daher, um die zugrunde liegenden EET-Kinetik und Mechanismen und seiner Verbindung zum mikrobielle Physiologie verstehen, OM c -Cyts wurden untersucht mit ganzen Zelle Elektrochemie4,7, kombiniert mit Mikroskopie 8 , 9, Spektroskopie10,11und Molekularbiologie2,4. Im Gegensatz dazu haben Methoden, um den Einfluss der EET-assoziierten kation Transport, z. B. Protonen, auf EET Kinetik in lebenden Zellen untersuchen kaum trotz PROTONENTRANSPORT über bakterielle Membranen haben eine entscheidende Rolle im festgestellt wurde, Signalisierung, Homöostase und Energie Produktion12,13,14. In der vorliegenden Studie, beschreiben wir eine Technik, um die Auswirkungen der PROTONENTRANSPORT auf EET Kinetik in der S. Oneidensis MR-1 Zelle mit Hilfe von ganzen Zelle elektrochemischen Messungen, zu untersuchen, die die Identifikation der Bandbreitenbegrenzung Schritt erfordert mikrobielle aktuelle Produktion15.

Eine direkte Möglichkeit, den Beitrag der PROTONENTRANSPORT auf die damit verbundenen EET zu bewerten ist der Deuterium-kinetische Isotop-Effekt (KIE). Die KIE ist zu beobachten, wie die Veränderung der Electron Transfer Kinetik auf den Ersatz von Protonen mit Deuterium-Ionen, der die Auswirkungen der PROTONENTRANSPORT Electron Transfer Kinetik16darstellt. Die Theorie der KIE selbst hat mit elektrochemischen Messungen mit gereinigtem Enzyme17gut etabliert. Jedoch da aktueller Produktion in S. Oneidensis MR-1 aus mehrere, unterschiedliche und schwankende Prozesse18, kann man einfach EET als die Bandbreitenbegrenzung Prozess nicht identifizieren. Um die KIE auf Proton Transportprozesse gepaart mit EET zu beobachten, müssen wir bestätigen, dass die mikrobiellen laufenden Produktion durch Elektronentransport durch OM cbegrenzt ist - Cyts an der Elektrode. Zu diesem Zweck haben wir die überstehende Lösung durch frisches Medium mit einer hohen Konzentration von Laktat als ein Elektron Spender an der optimalen pH und Temperaturbedingungen vor KIE Messung ersetzt; Dieser Ersatz diente zwei Rollen: (1) erhöht die Rate der vorgelagerten Stoffwechselprozesse im Vergleich zu den EET, und (2) ausgelassen die Zellen Schwimmen im überstand der Monolage Biofilm von S. Oneidensis MR-1 auf den arbeitenden Elektrode (befreit Indium-Zinn-dotierte oxid (ITO)-Elektrode). Die vorgestellte ausführliche Protokoll soll helfen neue Praktiker erhalten und bestätigen, dass die EET-Bestimmung Schritt erfolgt.

Protokoll

1. Bildung von Biofilm Monolayer von S. Oneidensis MR-1 auf einer ITO-Elektrode (Abbildung 1)

Hinweis: Um die Kontamination des elektrochemischen Reaktors mit anderen Mikroben zu verhindern, sollten alle Medien, Geräte und Komponenten des elektrochemischen Reaktors im Voraus sterilisiert werden. Wenn MR. S. Oneidensis -1 Zellen und konstruieren die elektrochemischen Reaktoren, alle Verfahren auf einer sauberen Werkbank durchgeführt werden sollten.

  1. Kultivierung von S. Oneidensis MR-1 Zellen
    Hinweis: Ein Monolage Biofilm von S. Oneidensis MR-1 entstand auf einer ITO Elektrode nach den Bedingungen berichtete zuvor4.
    1. Um S. Oneidensis MR-1 Zellen wachsen, fügen Sie eine Kolonie von S. Oneidensis MR-1 auf einer nährbodenplatte bestehend aus Luria-Bertani (LB) (20 g/L) und Bacto Agar (15 g/L) in 15 mL LB-Medium (20 g/L) bei 30 ° C für 24 h unter aeroben Bedingungen mit 160 u/min schütteln angebaut.
    2. Die Zellsuspension bei 6.000 × g für 10 min zentrifugieren und Aufschwemmen der daraus resultierenden Zelle Pellet in 15 mL definierte Medium (pH 7,8) (DM: Nahco33 [2,5 g/L], CaCl2·2H2O [0,08 g/L], NH4Cl [1,0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L] und 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] Ethanesulfonic Säure [HEPES; 7,2 g/L]), ergänzt mit 10 mM Laktat und 0,5 g/L Hefeextrakt als Quelle von Kohlenstoff, und Spurenelemente für S. Oneidensis MR-1 , beziehungsweise.
    3. Weiter kultivieren die Zellsuspension aerob bei 30 ° C für 12 h unter Schütteln bei 160 u/min und Zentrifugieren wieder bei 6.000 × g für 10 min. waschen das resultierende Zelle Pellet zweimal mit DM Medium durch Zentrifugation für 10 min bei 6000 × g vor der elektrochemischen Experimentieren Sie.
  2. Bau eines elektrochemischen drei-Elektroden-Reaktors (Abbildung 1)
    1. Setzen Sie ein Substrat ITO als Arbeitselektrode an der Unterseite des Reaktors.
    2. Anschließend fügen Sie einen Glaszylinder (Durchmesser 2 cm) und ein Cover von Polytetrafluorethylen (PTFE). Dann fügen Sie Ag/AgCl (KCl gesättigt) und einem Platindraht in den Reaktor als die Referenz und Zähler Elektroden bzw..
      Hinweis: Um das Austreten von Luft und Lösung zu verhindern, legen Sie ein Butyl-Kautschuk-Blatt zwischen einzelnen Komponenten.
    3. Fügen Sie 4,0 mL DM ergänzt mit 10 mM Laktat und Hefeextrakt 0,5 g/L in den elektrochemischen Reaktor hinzu.
    4. Fließen Sie nachdem Sie bestätigt haben, dass gibt es keine Leckage aus dem elektrochemischen Reaktor die Stickstoffgas in den elektrochemischen Reaktor über 20 min, anaerobe Bedingungen innerhalb des elektrochemischen Reaktors aufrechtzuerhalten.
      Hinweis: Um Verunreinigungen mit anderen Mikroben zu verhindern, sollte das Gas gefiltert werden, bevor es in den elektrochemischen Reaktor fließt.
    5. Verbinden Sie den elektrochemischen Reaktor mit einem potentiostaten und + 0,4 V gelten (im Vergleich zu standard-Wasserstoff-Elektrode, sie) auf die ITO-Elektrode, wobei die Temperatur des elektrochemischen Reaktors bei 30 ° C mit einer externen Wasserkreislauf.
      Hinweis: Um die Wirkung eines externen elektrischen Feldes zu verhindern, sollte der elektrochemische Reaktor in einen Faradayschen Käfig platziert werden.
  3. Elektrochemische Kultivierung von S. Oneidensis MR-1 Zellen (Abbildung 1 und Abbildung 2)
    1. Passen Sie die Zelle Dichte der Suspension in Schritt 1.1 zu einer optischen Dichte von 1,43 bei 600 erhaltenen nm (OD600) mit DM 10 mM Laktat und 0,5 g/L Hefe ergänzt zu extrahieren.
      Hinweis: Um die richtige OD600zu erhalten, gelten Sie die Zellsuspension OD600 ≤ 0,8 für eine UV-Vis-Spektrometer vor Einstellen der OD600 bis 1,43.
    2. Hinzufügen von 0,3 mL Zellsuspension in den elektrochemischen Reaktor durch die Injektion Port mit einer Spritze: die OD600 im Reaktor ändert sich auf 0,1.
      Hinweis: Die Zugabe von 0,3 mL Zellsuspension mit OD600 = 1,43 in elektrochemischen Reaktor mit 4,0 mL mittlere Ergebnissen in 4,3 mL der Lösung mit einer OD600 = 0,1. Bei Verwendung von anderen Reaktoren mit unterschiedlichen Volumina ist die Berechnung der Zelldichte erforderlich.
    3. Die mögliche Anwendung auf + 0,4 V (gegen sie), die ITO-Elektrode für 25 h fort.
      Hinweis: Für die Bildung von Biofilm Monolage auf einer ITO-Elektrode, sicherzustellen Sie, dass der erzeugte Strom eine Abweichung von weniger als 50 % aus Abbildung 2zeigt.

(2) Ersatz des Überstands mit frischen DM Medium mit 10 mM Laktat (Abbildung 3)

  1. Die mögliche Anwendung zu stoppen und die potentiostaten und den Wasserkreislauf den elektrochemischen Reaktor trennen.
  2. Laktat-Ersatz des Überstands mit frischen DM Medium mit 10 mM
    1. Das Stickstoffgas fließen in eine Flasche mit DM mit 10 mM Laktat über 20 min, Sauerstoff vom Medium zu entfernen.
    2. Entfernen Sie langsam den überstand im elektrochemischen Reaktor mit einer Spritze unter fließendem Stickstoffgas (Abb. 3a, b).
      Hinweis: Um zu vermeiden, brechen den Biofilm auf die ITO-Elektrode durch Stickstoffgas, sollte das Gas über der Flüssigkeitsoberfläche fließen.
    3. Zugeben Sie 4,0 mL frische DM mit 10 mM Laktat mit einer Spritze (Abb. 3 c).
      Hinweis: Um zu vermeiden, brechen den Biofilm auf die ITO-Elektrode, injizieren Sie langsam das Medium entlang der Mauer des elektrochemischen Reaktors. Um den Biofilm feucht zu halten, sollte das Medium sofort nach dem Entfernen des Überstandes hinzugefügt werden. Injektion von der Mittel-bis zu 1 min nach dem Entfernen des Überstandes beeinträchtigt nicht die aktuelle Produktion aus der Biofilm von S. Oneidensis MR-1.
    4. Schräge des elektrochemischen Reaktors Entfernen aller der Überstand an der Wand des elektrochemischen Reaktors befestigt.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2-2.2.4 in insgesamt drei Mal.
  3. Stoppen Sie den Gasstrom zu und verbinden Sie den elektrochemischen Reaktor mit dem potentiostaten wiederum die ITO-Elektrode bei 303 k + 0,4 V (gegen sie) zuweisen

(3) Zugabe von Deuterium Wasser zur Messung der KIE auf den EET-Prozess (Abbildung 4)

  1. Bestätigen Sie, dass die laufenden Produktion aus einem monomolekularen Film Biofilm von S. Oneidensis MR-1 stabil ist und wird nicht schnell erhöht. Wenn der Strom steil steigt, warten Sie, bis der Strom innerhalb einer Erhöhung um 5 % über 10 min stabilisiert.
    Hinweis: Eine Monolage Biofilmbildung auf eine ITO-Elektrode ohne Kontamination der andere mikrobielle Stämme rDNA Sequenzen und ein Scan Elektron mikroskopische Bild des Biofilms auf eine ITO-Elektrode, bestätigte wie zuvor4berichtet. Zur Bestätigung der Rate Beschränkung durch die EET Prozess überwachen Sie den Effekt des Hinzufügens pendelt Elektron Mediatoren wie 100 µM anthraquinon-1-Sulfonate (α-AQS). Siehe Abschnitt Vertreter Ergebnisse und15 für weitere Details verweisen.
  2. Fügen Sie 40 µL anoxischen 50 % (V/V) D2O in den elektrochemischen Reaktor mit einer Spritze, so dass die Konzentration 0,5 % (V/V) D2O im Reaktor.
    Hinweis: Zur Vermeidung von Schäden an den Biofilm durch D2O Zusatz injizieren Sie D2O tropfenweise.
  3. Warten Sie, bis des Stroms zu stabilisieren, und anschließend fügen Sie die D-2O bis zu 4,0 % (V/V).
    Hinweis: Um den KIE-Wert (das Verhältnis der laufenden Produktion in Anwesenheit D2O und H2O) zu erhalten, überprüfen Sie die Wirkung des gleichen Volumens von H2O Zusatz auf der aktuellen Produktion.

Ergebnisse

Nach 25 h mögliche Anwendung auf + 0,4 V (gegen sie) bildete ein monomolekularen Film Biofilm auf die Arbeitselektrode ITO Glas, zuvor durch ein Rasterelektronenmikroskop oder einem konfokalen Mikroskopie4bestätigt wurde. Der repräsentative zeitliche Verlauf der aktuellen Produktion von S. Oneidensis MR-1 während einer Monoschicht Biofilmbildung ist in Abbildung 2dargestellt. Obwohl der Strom in jeder Messung verändert, w...

Diskussion

Unsere ganze Zelle elektrochemischen Test hat einige technische Vorteile verglichen mit Protein Elektrochemie. Während Proteinreinigung mehrstufige zeitaufwändige Verfahren erfordert, dauert unsere gesamte-Cell-Methode einen Tag von selbstorganisierten Biofilmbildung nach Zellkultur. Um eine stabile Wechselwirkung zwischen OM czu erreichen - Cyts und der Elektrode, brauchen wir nur Sterilisation und Reinigung der Elektrodenoberfläche; Es erfordert keine Elektrode Modifikation für organisieren die Ausrichtung...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch eine Beihilfe für speziell gefördert Forschung von der Japan Society for Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-Nummer 24000010, 17 H 04969, und JP17J02602, die uns Office of Naval Research Global (N62909-17-1-2038) finanziell unterstützt. Y.T JSPS Research Fellow und unterstützt von JSPS durch das Programm für führende Graduierten Schulen (Verdienst).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass cylinderN/AN/ACustom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and baseN/AN/ACustom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubberN/AN/ACustom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
SeptaGL Science3007-16101Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrodeGEOMATECNo.0001Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrodeHOKUTO DENKOHX-R5Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wireThe Nilaco CooporationPT-351325Used as a counter electrode
Luria-Bertani (LB) Broth, MillerBecton, Dichkinson and Company244620Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1
Bacto agarBecton, Dichkinson and Company214010
Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS)TCIA1428
Flavin mononucleotide (FMN)Wako184-00831
NaHCO3Wako191-01305Used for defined medium (DM)
CaCl2 · 2H2OWako031-00435Used for DM
NH4ClWako011-03015Used for DM
MgCl2 · 6H2OWako135-00165Used for DM
NaClWako191-01665Used for DM
2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES)DOJINDO346-08235Used for DM
Sodium Lactate SolutionWako195-02305
Bacto Yeast ExtractBecton, Dichkinson and Company212750
Deuterium oxide (D, 99.9%)Cambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-PKAdditive for kinetic isotope effect experiments
IncubatorTOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.LTI-601SDUsed for precultivation
ShakerTAITECNR-3Used for precultivation
Autoclave machineTOMY SEIKO CO. LTD.LSX-500Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean benchSANYOMCV-91BNFUsed to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separatorEppendorf5430RRotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generatorPuequ CO. LTD.PNTN-2Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometerSHIMADZUUV-1800Used for optimization of cell density
PotentiostatBioLogicVMP3Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulatorAS ONETR-1AUsed for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cageHOKUTO DENKOHS-201SUsed for electrochemical experiments

Referenzen

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