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  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous présentons ici un protocole d’expériences électrochimiques cellule entière pour étudier la contribution du transport de protons au taux de transport des électrons extracellulaire par les cytochromes de la membrane externe complexes de Shewanella oneidensis MR-1.

Résumé

Direct de détection électrochimique de c-type incorporés dans la membrane externe bactérienne du cytochrome complexes (membrane externe c-type du cytochrome complexes ; OM c- Cyts) a récemment émergé comme nouvelle méthode analytique cellule entière pour caractériser le transport des électrons bactérien de la chaine respiratoire à l’extérieur de la cellule, dénommé le transport des électrons extracellulaire (EET). Alors que la voie et la cinétique de l’écoulement d’électron au cours de la réaction de EET ont été étudiés, une méthode électrochimique cellule entière pour examiner l’impact du transport de cations associé à EET n’a pas encore été établie. Dans la présente étude, un exemple d’une technique biochimique pour examiner l’effet isotopique deutérium (KIE) sur EET par OM c- Cyts utilisant un microbe modèle, Shewanella oneidensis MR-1, est décrite. L’EIC sur le processus EET peut être obtenue si l’EET par OM c- Cyts agit comme l’étape cinétiquement limitante dans la production actuelle microbienne. À cette fin, avant l’ajout de D2O, le surnageant a été remplacé avec les supports neufs contenant une quantité suffisante de donneur d’électrons pour soutenir le taux de réactions métaboliques en amont et de retirer les cellules planctoniques un uniforme monocouche biofilm sur l’électrode de travail. Méthodes alternatives pour confirmer la limitante étape dans la production actuelle microbienne comme EET par OM c- Cyts sont également décrites. Notre technique d’un dosage électrochimique cellule entière pour étudier la cinétique du transport proton peut être appliquée à d’autres souches microbiennes électroactif.

Introduction

Des techniques électrochimiques de qualifier directement une protéine d’oxydo-réduction dans une cellule bactérienne intacte ont récemment émergé depuis la découverte de souches microbiennes-réduction des métaux, tels que S. oneidensis MR-1 ou Geobacter sulfurreducens PCA, qui ont des complexes de cytochrome c-type de membrane externe (OM c-Cyts) exposés à la cellule extérieur1,2,3,4,5. L' OM c- Cyts médiation transport des électrons de la chaine respiratoire à des substrats solides situé extracellulaire. Ce transport est dénommé extracellulaire transport d’électrons (EET)1,6 et est un processus critique pour les biotechnologies émergents, tels que les piles à combustible microbiennes6. Par conséquent, pour comprendre la cinétique EET sous-jacent et mécanismes et son lien avec la physiologie microbienne, OM c -Cyts ont été étudiés à l’aide de cellules entières électrochimie4,7, combinée avec la microscopie 8 , 9,10,de spectroscopie11et biologie moléculaire2,4. En revanche, méthodes pour étudier l’impact du transport de cations EET-liés, par exemple, les protons et sur la cinétique EET dans les cellules vivantes ont été guère établies, malgré le transport de protons à travers les membranes bactériennes ayant un rôle essentiel dans signalisation, homéostasie et énergie production12,13,,14. Dans la présente étude, nous décrivons une technique pour examiner l’impact du transport de protons sur la cinétique EET dans la cellule de MR-1 S. oneidensis à l’aide de mesures électrochimiques cellule entière, qui nécessite l’identification de l’étape cinétiquement limitante dans microbienne de production actuel15.

Une façon directe pour évaluer la contribution du transport de protons sur le EET associé est l’effet isotopique du deutérium (KIE). La KIE est observable comme le changement de cinétique de transfert d’électron sur le remplacement de protons avec des ions de deutérium, qui représente l’impact du transport de protons sur les électrons transfert cinétique16. La théorie de KIE lui-même a été clairement établie à l’aide de mesures électrochimiques avec enzymes purifiées,17. Toutefois, étant donné que la production actuelle en S. oneidensis MR-1 résulte de multiples processus variés et fluctuants18, on ne peut pas simplement identifier EET que le processus de limitation de vitesse. Pour observer la KIE sur les processus de transport de protons couplés avec EET, il faut confirmer que la production actuelle microbienne est limitée par transport d’électrons par l’intermédiaire de OM c- Cyts à l’électrode. À cette fin, nous avons remplacé la solution surnageante avec un milieu frais contenant une forte concentration de lactate comme donneur d’électrons au pH optimal et des conditions de température avant mesure KIE ; Ce remplacement a servi deux rôles : (1) il amélioré le taux des processus métaboliques en amont par rapport à l’EET et (2) omis les cellules de natation dans le surnageant détache le biofilm monocouche de S. oneidensis MR-1 sur la (électrode de travail électrode d’oxyde d’étain dopé (ITO) indium). Le protocole détaillé présenté est destiné à aider les nouveaux praticiens maintenir et confirmer que le processus EET est l’étape cinétiquement déterminante.

Protocole

1. formation d’un Biofilm monocouche de S. oneidensis MR-1 sur une électrode ITO (Figure 1)

Remarque : Pour éviter la contamination du réacteur électrochimique avec d’autres microbes, tous les médias, outils et composants du réacteur électrochimique doivent être stérilisés à l’avance. Quand à l’aide de cellules de S. oneidensis MR-1 et la construction des réacteurs électrochimiques, toutes les procédures doivent être réalisées sur un banc propre.

  1. Culture de cellules de S. oneidensis MR-1
    Remarque : Un biofilm monocouche de S. oneidensis MR-1 a été formé sur l’OIC électrode suivant les conditions signalées précédemment4.
    1. Pour cultiver des cellules S. oneidensis MR-1, ajoutez une colonie de S. oneidensis MR-1, cultivé sur une gélose comprenant Luria-Bertani (LB) (20 g/L) et bacto agar (15 g/L) dans 15 mL de milieu LB (20 g/L) à 30 ° C pendant 24 h dans des conditions aérobies avec agitation à 160 tours/minute.
    2. Centrifuger la suspension cellulaire à 6 000 × g pendant 10 min et remettre en suspension le culot cellulaire qui en résulte dans 15 mL de milieu défini (pH 7,8) (DM : NaHCO3 [2,5 g/L], CaCl2·2H2O [0,08 g/L], NH4Cl [1,0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L] et 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acide [HEPES ; 7,2 g/L]), additionné de 10 mM de lactate et extrait de levure 0,5 g/L comme source de carbone et d’oligo-éléments pour S. oneidensis MR-1 , respectivement.
    3. Encore cultiver la suspension cellulaire en aérobiose à 30 ° C pendant 12 h avec agitation à 160 tr/min et centrifuger à nouveau à 6 000 × g pendant 10 min. laver le culot qui en résulte deux fois avec DM moyen par centrifugation pendant 10 min à 6 000 × g avant l’électrochimique Faites des essais.
  2. Construction d’un réacteur électrochimique à trois électrodes (Figure 1)
    1. Mettre un substrat ITO comme l’électrode de travail en bas du réacteur.
    2. Par la suite, insérez un cylindre de verre (diamètre de 2 cm) et une couverture de polytétrafluoroéthylène (PTFE). Puis insérez Ag/AgCl (KCl saturé) et un fil de platine dans le réacteur comme les électrodes de référence et compteur, respectivement.
      Remarque : Pour éviter les fuites d’air et solution, insérez une feuille de caoutchouc butyle entre chaque composant.
    3. Ajouter 4,0 mL de DM additionné de 10 mM de lactate et d’extrait de levure de 0,5 g/L dans le réacteur électrochimique.
    4. Après avoir confirmé qu’il n’y a pas de fuite provenant du réacteur électrochimique, jettent le gaz d’azote dans le réacteur électrochimique pendant 20 min pour maintenir des conditions anaérobies dans le réacteur électrochimique.
      Remarque : Pour éviter la contamination par d’autres microbes, le gaz doit être filtré avant elle se jette dans le réacteur électrochimique.
    5. Connectez le réacteur électrochimique d’un potentiostat et appliquer + 0,4 V (versus l’électrode standard à hydrogène, elle) à l’électrode ITO, maintenir la température du réacteur électrochimique à 30 ° C à l’aide d’un système de circulation d’eau externe.
      Remarque : Pour éviter l’effet d’un champ électrique extérieur, le réacteur électrochimique devrait être placé dans une cage de Faraday.
  3. Électrochimique culture de cellules de MR-1 S. oneidensis (Figure 1 et Figure 2)
    1. Ajuster la densité des cellules de la suspension obtenue à l’étape 1.1 à une densité optique de 1,43 à 600 nm (OD600) avec DM complétée par de la levure de lactate et 0,5 g/L 10 mM extrait.
      Remarque : Pour obtenir la bonne OD600, appliquer la suspension cellulaire de OD600 ≤ 0,8 à un spectromètre UV-visible avant réglage de l' OD600 à 1,43.
    2. Ajouter 0,3 mL de la suspension cellulaire dans le réacteur électrochimique par l’orifice d’injection à l’aide d’une seringue : l' OD600 dans le réacteur passe à 0,1.
      Remarque : L’ajout de suspension cellulaire 0,3 mL avec OD600 = 1,43 dans réacteur électrochimique contenant 4,0 mL résultats moyenne à 4,3 mL de la solution avec un OD600 = 0,1. Lorsque vous utilisez d’autres réacteurs avec des volumes différents, le calcul de la densité cellulaire est nécessaire.
    3. Continuer l’application potentielle à + 0,4 V (par rapport à elle) à l’électrode ITO pour 25 h.
      Remarque : Pour la formation d’un biofilm monocouche sur une électrode ITO, assurez-vous que le courant produit montre un écart de moins de 50 % par rapport à la Figure 2.

2. remplacement du liquide surnageant avec un milieu frais DM avec 10 mM de Lactate (Figure 3)

  1. Arrêter l’application potentielle et déconnectez le réacteur électrochimique de la potentiostat et le système de circulation d’eau.
  2. Remplacement du liquide surnageant avec un milieu frais DM avec 10 mM de lactate
    1. L’azote gazeux se jettent dans une bouteille contenant des DM avec 10 mM de lactate pendant 20 min pour enlever l’oxygène du milieu.
    2. Retirez lentement tous le surnageant à l’intérieur du réacteur électrochimique à l’aide d’une seringue, en s’écoulant l’azote gazeux (Figure 3 a, b).
      Remarque : Pour éviter de casser le biofilm sur l’électrode ITO par gaz d’azote, le gaz doit circuler au-dessus de la surface du liquide.
    3. Ajouter 4,0 mL de DM frais contenant du lactate de 10 mM à l’aide d’une seringue (Figure 3C).
      Remarque : Pour éviter de casser le biofilm sur l’électrode ITO, injecter lentement le milieu le long du mur du réacteur électrochimique. Pour garder le biofilm humide, la moyenne s’ajouteront immédiatement après l’élimination du surnageant ; Injection de la moyenne jusqu'à 1 min après l’élimination du surnageant n’influe pas sur la production actuelle de biofilm de S. oneidensis MR-1.
    4. Incliner le réacteur électrochimique pour retirer tout le liquide surnageant fixé au mur du réacteur électrochimique.
    5. Répétez les étapes 2.2.2-2.2.4 trois fois au total.
  3. Arrêter l’écoulement de gaz et brancher le réacteur électrochimique pour le potentiostat nouveau, appliquant + 0,4 V (par rapport à elle) à l’électrode ITO à 303 K.

3. l’addition d’eau de deutérium pour mesurer la KIE sur le processus EET (Figure 4)

  1. Confirmer que la production actuelle d’un biofilm monocouche de S. oneidensis MR-1 est stable et n’augmente pas rapidement. Si le courant augmente fortement, attendez que le courant se stabilise au sein d’une augmentation de 5 % pendant 10 min.
    Remarque : La formation d’un biofilm monocouche sur une électrode ITO sans contamination des autres souches microbiennes a été confirmée par des séquences des ADNr et une balayage image microscopique de l’électron du biofilm sur une électrode ITO, tel que rapporté précédemment4. Pour la confirmation de la limitation de vitesse par le processus EET, surveiller l’effet de l’ajout de navette électron médiateurs tels que 100 µM anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS). Reportez-vous à la section des Résultats représentant et référence15 pour plus de détails.
  2. Ajouter 40 µL d’anoxique 50 % (v/v) D2O dans le réacteur électrochimique à l’aide d’une seringue telle que la concentration est de 0,5 % (v/v) D2O dans le réacteur.
    Remarque : Pour éviter d’endommager le biofilm par addition de2O D, injecter la D2O goutte-à-goutte.
  3. Attendez que le courant se stabilise et ajoutez ensuite la D2O jusqu'à 4,0 % (v/v).
    Remarque : Pour obtenir la valeur KIE (le ratio de la production actuelle en présence D2O et H2O), vérifier l’effet du même volume d’addition2O H sur la production actuelle.

Résultats

Après 25 h de demande potentielle, à + 0,4 V (par rapport à elle), un biofilm monocouche a été formé sur l’électrode de travail du verre ITO, qui a été précédemment confirmée par un microscope électronique à balayage ou une microscopie confocale4. L’évolution temporelle représentatifs de la production actuelle de M. S. oneidensis -1 lors de la formation d’un biofilm monocouche est montrée dans la Figure 2

Discussion

Notre essai électrochimique cellule entière a plusieurs avantages techniques par rapport à l’électrochimie de protéine. Tandis que la purification de la protéine nécessite des procédures fastidieuses multi-étapes, notre méthode de cellule entière prend une journée de formation de biofilm auto-organisé après culture cellulaire. Pour parvenir à une interaction stable entre OM c- Cyts et l’électrode, nous avons besoin seulement de stérilisation et de nettoyage de la surface de l’électrode ;...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu financièrement par une subvention pour spécialement favorisé la recherche de la Japan Society for Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Number 24000010, 17H 04969 et JP17J02602, la nous Bureau du Naval Research Global (N62909-17-1-2038). Y.T. est chercheur JSPS et pris en charge par JSPS grâce au programme pour les écoles supérieures menant (mérite).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass cylinderN/AN/ACustom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and baseN/AN/ACustom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubberN/AN/ACustom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
SeptaGL Science3007-16101Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrodeGEOMATECNo.0001Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrodeHOKUTO DENKOHX-R5Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wireThe Nilaco CooporationPT-351325Used as a counter electrode
Luria-Bertani (LB) Broth, MillerBecton, Dichkinson and Company244620Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1
Bacto agarBecton, Dichkinson and Company214010
Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS)TCIA1428
Flavin mononucleotide (FMN)Wako184-00831
NaHCO3Wako191-01305Used for defined medium (DM)
CaCl2 · 2H2OWako031-00435Used for DM
NH4ClWako011-03015Used for DM
MgCl2 · 6H2OWako135-00165Used for DM
NaClWako191-01665Used for DM
2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES)DOJINDO346-08235Used for DM
Sodium Lactate SolutionWako195-02305
Bacto Yeast ExtractBecton, Dichkinson and Company212750
Deuterium oxide (D, 99.9%)Cambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-PKAdditive for kinetic isotope effect experiments
IncubatorTOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.LTI-601SDUsed for precultivation
ShakerTAITECNR-3Used for precultivation
Autoclave machineTOMY SEIKO CO. LTD.LSX-500Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean benchSANYOMCV-91BNFUsed to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separatorEppendorf5430RRotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generatorPuequ CO. LTD.PNTN-2Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometerSHIMADZUUV-1800Used for optimization of cell density
PotentiostatBioLogicVMP3Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulatorAS ONETR-1AUsed for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cageHOKUTO DENKOHS-201SUsed for electrochemical experiments

Références

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