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Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo de toda a célula eletroquímicos experimentos para estudar a contribuição do transporte de protões para a taxa de transporte de elétrons extracelular através do membrana externa citocromos complexos em Shewanella oneidensis MR-1.

Resumo

Direto de deteção eletroquímica de c-tipo complexos citocromo embutidos na membrana externa bacteriana (membrana externa c-tipo complexos citocromo; OM c- Cyts) tem recentemente emergiu como um método analítico de células inteiras romance para caracterizar o bacteriano transporte de elétrons da cadeia respiratória para o exterior da célula, referido como o transporte de elétrons extracelular (EET). Enquanto o caminho e a cinética do fluxo de elétrons durante a reação de EET têm sido investigados, um método eletroquímico de células inteiras para examinar o impacto do transporte de cátion associado com EET não ainda foi estabelecido. No presente estudo, um exemplo de uma técnica bioquímica para examinar o efeito de cinética isótopo deutério (KIE) sobre EET através de OM c- Cyts usando um micróbio de modelo, Shewanella oneidensis MR-1, é descrita. A KIE sobre o processo EET pode ser obtido se a EET através de OM c- Cyts atua como o passo limitante na produção atual microbiana. Para o efeito, antes da adição de D2O, o sobrenadante foi substituído com mídia fresca contendo uma quantidade suficiente do doador de elétron para suportar a taxa de upstream reações metabólicas e para remover as células planctônicas de um uniforme monocamada biofilme sobre o eletrodo de trabalho. Métodos alternativos para confirmar o limitante passo na produção atual microbiana como EET através de OM c- Cyts também são descritos. Nossa técnica de um ensaio eletroquímico células inteiras para investigar a cinética de transporte de prótons pode ser aplicada a outras cepas microbianas eletroativos.

Introdução

Surgiram recentemente Técnicas eletroquímicas para caracterizar diretamente uma proteína redox em uma célula bacteriana intacta desde a descoberta de cepas microbianas redução de metal, como S. oneidensis MR-1 ou Geobacter sulfurreducens PCA, que tem complexos de citocromo c-tipo de membrana externa (c-Cyts OM) expostos à célula exterior1,2,3,4,5. O OM c- Cyts mediar o transporte de elétrons da cadeia respiratória para substratos sólidos localizado extracelularmente. Este transporte é referido como transporte de elétrons extracelular (EET)1,6 e é um processo crítico para biotecnologias emergentes, tais como células de combustível microbianas6. Portanto, para entender a cinética EET subjacente e mecanismos e a sua ligação à fisiologia microbiana, OM c -Cyts foram investigados usando toda a célula eletroquímica4,7, combinado com microscopia 8 , 9, espectroscopia de10,11e biologia molecular2,4. Em contraste, métodos para investigar o impacto do transporte de cátion EET-associados, por exemplo, os prótons, na cinética EET em células vivas foram mal estabelecidos, apesar do transporte de protões através das membranas bacterianas, tendo um papel crítico sinalização, homeostase e energia produção12,13,14. No presente estudo, descrevemos uma técnica para examinar o impacto do transporte de prótons na cinética EET em S. oneidensis MR-1 célula usando medições eletroquímicas célula inteira, que requer a identificação da etapa limitante de produção atual de microbiana15.

Uma maneira direta para avaliar a contribuição do transporte de prótons sobre a EET associado é o efeito de cinética isótopo deutério (KIE). A KIE é observável como a mudança na cinética de transferência de elétrons sobre a substituição de prótons com íons de deutério, que representa o impacto do transporte de prótons na transferência de elétrons cinética16. A teoria de KIE em si bem estabeleceu usando medições eletroquímicas com enzimas purificada17. No entanto, desde que a produção atual em S. oneidensis MR-1 resulta do múltiplo, processos diversos e flutuação18, um não pode simplesmente identificar EET como o processo limitante. Para observar o KIE em processos de transporte de prótons juntamente com EET, precisamos confirmar que a atual produção microbiana é limitada pelo transporte de elétrons através de OM c- Cyts para o eletrodo. Para este efeito, substituímos a solução sobrenadante por meio fresco, que contém uma alta concentração de lactato como doador de elétron no pH ideal e as condições de temperatura antes da medição KIE; Esta substituição serviu dois papéis: (1) reforçada a taxa dos processos metabólicos montante em comparação com a EET e (2) omitido as células de natação no sobrenadante libertado o biofilme monocamada de S. oneidensis MR-1 sobre o trabalho do eléctrodo ( eletrodo de estanho dopado com óxido (ITO) índio). O protocolo detalhado apresentado destina-se a ajudar novos praticantes manter e confirmar que o processo EET é o passo determinante de taxa.

Protocolo

1. formação de um biofilme monocamada de S. oneidensis MR-1 em um eletrodo de ITO (Figura 1)

Nota: Para evitar a contaminação do reator eletroquímico com outros micróbios, toda a mídia, Implementos e componentes do reator eletroquímico devem ser esterilizadas com antecedência. Quando usando células S. oneidensis MR-1 e construir os reatores eletroquímicos, devem efectuar-se todos os procedimentos em uma bancada limpa.

  1. Cultivo de células de S. oneidensis MR-1
    Nota: Um biofilme monocamada de S. oneidensis MR-1 foi formado em um ITO eletrodo as condições a seguir relatado anteriormente4.
    1. Para o cultivo de células de S. oneidensis MR-1, adicione uma colônia de S. oneidensis MR-1 cultivadas em uma placa de ágar compreendendo Luria-Bertani (LB) (20 g/L) e bacto ágar (15 g/L) em 15 mL de meio LB (20 g/L) a 30 ° C por 24 h em condições aeróbias, com agitação a 160 rpm.
    2. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 6.000 × g por 10 min e resuspenda o pellet de células resultante em 15 mL de meio definido (pH 7,8) (DM: NaHCO3 [2,5 g/L], O [0,08 g/L], CaCl2·2H2NH4Cl [1,0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L] e 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ácido etanesulfónico [HEPES; 7,2 g/L]), completados com lactato de 10 mM e 0,5 g/L de extrato de levedura como fonte de carbono e oligoelementos para S. oneidensis MR-1 , respectivamente.
    3. Além disso, cultivar a suspensão de eritrócitos por via aeróbia a 30 ° C, por 12 h com agitação a 160 rpm e centrifugar novamente a 6.000 × g por 10 min. Lave o centrifugado resultante duas vezes com DM médio por centrifugação por 10min a 6.000 g × antes da eletroquímica experimento.
  2. Construção de um reator eletroquímico do três-elétrodo (Figura 1)
    1. Colocar um substrato ITO como o eletrodo de trabalho na parte inferior do reator.
    2. Posteriormente, inserir um cilindro de vidro (diâmetro de 2 cm) e um cover de politetrafluoretileno (PTFE). Em seguida inserir Ag/AgCl (KCl saturado) e um fio de platina no reator como os eletrodos de referência e contador, respectivamente.
      Nota: Para evitar o vazamento de ar e solução, insira uma folha de borracha butílica entre cada componente.
    3. Adicione 4,0 mL de DM suplementado com lactato de 10 mM e extracto de levedura 0,5 g/L no reator eletroquímico.
    4. Depois de confirmar que não há nenhum vazamento do reator eletroquímico, fluxo do gás do nitrogênio no reator eletroquímico mais 20 min para manter condições anaeróbicas dentro do reator eletroquímico.
      Nota: Para evitar a contaminação com outros micróbios, o gás deve ser filtrado antes de ela flui para o reator eletroquímico.
    5. Conectar o reator eletroquímico para um potentiostat e aplicar 0,4 V (contra eletrodo padrão de hidrogênio, ela) para o eletrodo de ITO, mantendo a temperatura do reator eletroquímico a 30 ° C, usando um sistema de circulação de água externa.
      Nota: Para evitar o efeito de um campo elétrico externo, o reator eletroquímico deve ser colocado em uma gaiola de Faraday.
  3. Eletroquímico cultivo de S. oneidensis MR-1 células (Figura 1 e Figura 2)
    1. Ajustar a densidade da célula da suspensão obtida na etapa 1.1 para uma densidade óptica de 1,43 a 600 nm (OD600) com DM, complementada pela levedura de lactato e 0,5 g/L de 10mm extrair.
      Nota: Para obter o correto OD600, aplica a suspensão de células de OD600 ≤ 0.8 a um espectrómetro de UV-vis antes de ajustar o OD600 para 1,43.
    2. Adicionar 0,3 mL de suspensão de células no reator eletroquímico através do orifício de injeção usando uma seringa: o OD600 no reator muda para 0,1.
      Nota: A adição de 0,3 mL de suspensão de células com OD600 = 1,43 em reator eletroquímico contendo 4,0 mL resultados médios em 4,3 mL de solução com uma OD600 = 0.1. Ao utilizar outros reactores com volumes diferentes, o cálculo da densidade celular é necessário.
    3. Continue a aplicação potencial em 0,4 V (contra ela) para o eletrodo de ITO para 25 h.
      Nota: Para a formação de um biofilme monocamada sobre um eletrodo de ITO, certifique-se que a corrente produzida apresenta um desvio inferior a 50% da Figura 2.

2. substituição do líquido sobrenadante com meio fresco de DM com lactato de 10 mM (Figura 3)

  1. Interromper o aplicativo potencial e desconecte o potentiostat e o sistema de circulação de água do reator eletroquímico.
  2. Substituição do líquido sobrenadante com meio fresco de DM com 10 mM de lactato
    1. Fluxo do gás do nitrogênio em um frasco contendo DM com 10 mM de lactato mais 20 min para remover o oxigênio do meio.
    2. Remova lentamente todo o sobrenadante dentro do reator eletroquímico, usando uma seringa, fluindo sob o gás nitrogênio (Figura 3a, b).
      Nota: Para evitar a interrupção do biofilme sobre o eléctrodo ITO pelo gás do nitrogênio, o gás deve fluir acima da superfície do líquido.
    3. Adicione 4,0 mL de DM fresco contendo lactato de 10 mM, usando uma seringa (Figura 3C).
      Nota: Para evitar a interrupção do biofilme sobre o eléctrodo de ITO, injete lentamente o médio ao longo da parede do reator eletroquímico. Para manter o biofilme molhado, o meio deve ser adicionado imediatamente após a remoção do sobrenadante. Injeção do médio até 1 min após a remoção do sobrenadante não afeta a produção atual do biofilme de S. oneidensis MR-1.
    4. Inclinar o reator eletroquímico para remover todo o sobrenadante fixado na parede do reator eletroquímico.
    5. Repita as etapas 2.2.2-2.2.4 três vezes no total.
  3. Parar o fluxo de gás e conectar o reator eletroquímico para a potentiostat novamente, aplicando 0,4 V (contra ela) para o eletrodo de ITO no 303 K.

3. adição de água de deutério para medir a KIE sobre o processo EET (Figura 4)

  1. Confirme que a produção atual de um biofilme monocamada de S. oneidensis MR-1 é estável e não aumenta rapidamente. Se a corrente aumenta abruptamente, espere até que a corrente se estabiliza em um aumento de 5% mais de 10 min.
    Nota: A formação de um biofilme monocamada sobre um eletrodo de ITO, sem contaminação de outras cepas microbianas foi confirmada por sequências de rDNA e uma imagem de elétrons varredura microscópica do biofilme sobre um eletrodo de ITO, como relatado anteriormente4. Para confirmação da limitação taxa pelo processo de EET, monitore o efeito da adição de shuttling mediadores de elétrons como a 100 µM antraquinona-1-sulfonato (α-AQS). Consulte a seção de Resultados de representante e referência15 para maiores detalhes.
  2. Adicione 40 µ l de 50% (v/v) anóxica D2O no reator eletroquímico utilizando uma seringa de tal forma que a concentração é de 0,5% (v/v) D2O no reator.
    Nota: Para evitar danificar o biofilme por adição de2O D, injete o D2O drop-wise.
  3. Esperar a corrente estabilizar e posteriormente adicionar a D2O até 4,0% (v/v).
    Nota: Para obter o valor KIE (a taxa de produção atual na presença de D2O e H2O), verificar o efeito do mesmo volume de adição de H2O na produção atual.

Resultados

Após 25 h de potencial aplicação em 0,4 V (contra ela), formou-se um biofilme monocamada sobre o eletrodo de trabalho de vidro de ITO, que anteriormente foi confirmado por uma microscopia eletrônica ou uma microscopia confocal4. O curso de tempo representativa da atual produção do S. oneidensis MR-1 durante a formação de um biofilme monocamada é mostrado na Figura 2. Embora a corrente altera em cada medição, a corre...

Discussão

Nosso ensaio eletroquímico de célula inteira tem várias vantagens técnicas em comparação com eletroquímica de proteína. Enquanto a purificação de proteínas requer várias etapas procedimentos demorados, nosso método de célula inteira leva um dia de formação de biofilmes auto-organizado após a cultura de células. Para obter uma interacção estável entre OM c- Cyts e o eletrodo, precisamos apenas de esterilização e limpeza da superfície do eletrodo; não exige modificação de eletrodos para ...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado financeiramente por um subsídio para investigação especialmente promovido da sociedade para a promoção da ciência (JSPS) número de concessão KAKENHI 24000010, 17H 04969, Japão e JP17J02602, nos escritório do Naval Research Global (N62909-17-1-2038). Y.T. é um pesquisador de JSPS e apoiado por JSPS através do programa para liderar graduação escolas (mérito).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass cylinderN/AN/ACustom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and baseN/AN/ACustom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubberN/AN/ACustom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
SeptaGL Science3007-16101Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrodeGEOMATECNo.0001Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrodeHOKUTO DENKOHX-R5Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wireThe Nilaco CooporationPT-351325Used as a counter electrode
Luria-Bertani (LB) Broth, MillerBecton, Dichkinson and Company244620Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1
Bacto agarBecton, Dichkinson and Company214010
Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS)TCIA1428
Flavin mononucleotide (FMN)Wako184-00831
NaHCO3Wako191-01305Used for defined medium (DM)
CaCl2 · 2H2OWako031-00435Used for DM
NH4ClWako011-03015Used for DM
MgCl2 · 6H2OWako135-00165Used for DM
NaClWako191-01665Used for DM
2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES)DOJINDO346-08235Used for DM
Sodium Lactate SolutionWako195-02305
Bacto Yeast ExtractBecton, Dichkinson and Company212750
Deuterium oxide (D, 99.9%)Cambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-PKAdditive for kinetic isotope effect experiments
IncubatorTOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.LTI-601SDUsed for precultivation
ShakerTAITECNR-3Used for precultivation
Autoclave machineTOMY SEIKO CO. LTD.LSX-500Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean benchSANYOMCV-91BNFUsed to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separatorEppendorf5430RRotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generatorPuequ CO. LTD.PNTN-2Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometerSHIMADZUUV-1800Used for optimization of cell density
PotentiostatBioLogicVMP3Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulatorAS ONETR-1AUsed for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cageHOKUTO DENKOHS-201SUsed for electrochemical experiments

Referências

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