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요약

여기 선물이 전체 셀 전기 화학 실험 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 복잡 한 외부 막 한다 통해 extracellular 전자 전송의 속도를 양성자 수송의 기여를 공부 하는 프로토콜.

초록

직접 c의 전기 화학 검출-시 토 크롬 단지 세균 외부 막에 포함 된 입력 (외부 막 c-입력 시 토 크롬 복합물; 톰 c-대련 청 려)는 최근 소설 전체 셀 셀 외관 호흡기 체인에서 세균성 전자 수송 특성 분석 방법으로, 세포 외 전자 전송 (동유럽 표준시)로. 통로 동유럽 표준시 반응 동안 전자 흐름의 속도, 조사 하는 동안 전체 셀 전기 메서드 동유럽 표준시와 관련 된 양이온 수송의 영향 검토를 하지 아직 설립 되었습니다. 현재 연구에서 중수소 활동적인 동위 원소 효과 (KIE) 동유럽 표준시에 옴 c를 검사 하는 생 화 확 적인 기술의 예-대련 청 려 모델 미생물, Shewanella oneidensis 미스터-1을 사용 하 여 설명 되어 있습니다. 동유럽 표준시 프로세스에 KIE 옴 c통해 동유럽 표준시-대련 청 려 미생물 현재 생산에서 속도 제한 단계 역할을 하는 경우에 얻어질 수 있다. 끝으로, D2O의 추가 하기 전에 표면에 뜨는 솔루션 업스트림 신진 대사 반응의 속도 지원 하 고 유니폼에서 planktonic 세포를 제거 하는 전자 기증자의 충분 한 금액을 포함 하는 신선한 미디어로 대체 되었습니다. 작업 전극에 단층 biofilm입니다. 속도 제한 확인 대체 방법을 미생물 현재 생산에서 단계 옴 c통해 동유럽 표준시-대련 청 려도 설명 됩니다. 양성자 전송 속도 론 조사를 위한 전기 화학 분석 결과 전체 셀의 우리의 기술은 다른 electroactive 미생물 계통에 적용할 수 있습니다.

서문

직접 하는 그대로 세균 세포에서 산화 환 원 단백질 전기 기술을 최근 금속 감소 미생물 긴장, S. oneidensis 씨-1 등 Geobacter sulfurreducens PCA의 발견 이후 등장 외부 막 시 토 크롬 c 형 단지 (OM c-대련 청 려) 셀 외부1,2,3,,45에 노출 되어 있다. 톰 c-대련 청 려 호흡기 체인에서 extracellularly 있는 고체 기판에 전자 수송 중재. 이 전송 extracellular 전자 전송 (동유럽 표준시)1,6 이라고 하 고 미생물 연료 전지6등 신흥 바이오에 대 한 중요 한 과정 이다. 따라서, 기본 동유럽 표준시 속도 론 및 메커니즘 및 미생물 생리학에 그것의 연결을 이해 하 옴 c-대련 청 려 되었습니다 조사 전체 셀 전기 화학4,7, 현미경과 결합을 사용 하 여 8 , 9, 분광학10,11, 그리고 분자 생물학2,4. 반면, 동유럽 표준시 관련 된 양이온 수송, 예를 들어, 양성자, 살아있는 세포에서 동유럽 표준시 활동에 미치는 영향을 조사 하는 방법 부족 하 게 설립 되어, 세균 막 중요 한 역할을가지고 걸쳐 양성자 수송에도 불구 하 고 신호, 항상성, 및 에너지 생산12,,1314. 현재의에서 연구, 우리는 양성자 수송 필요의 속도 제한 단계 식별 전체 셀 전기 화학 측정을 사용 하 여 S. oneidensis 씨-1 셀에 동유럽 표준시 활동에의 영향을 검사 하는 기법을 설명 미생물 현재 생산15.

1 직접 연결 된 동유럽 표준시에 양성자 수송의 기여를 평가 방법은 중수소 활동적인 동위 원소 효과 (KIE)입니다. 인기의 전자 전송 속도 론16양성자 교통 영향을 나타내는 중수소 이온, 양성자의 교체 시 전자 전송 속도에서 변화 관찰입니다. KIE 자체의 이론은 잘 설립 되었습니다 정제 효소17전기 화학 측정을 사용 하 여. 그러나, S. oneidensis 씨-1에 현재 생산, 여러 다양 한, 그리고 변동 과정18에서 결과, 이후 하나 확인할 수 없습니다 단순히 동유럽 표준시 속도 제한 과정으로. 관찰 하기 위해 동유럽 표준시 함께 양성자 전송 프로세스에 인기, 우리는 미생물 현재 생산 옴 c통해 전자 전송에 의해 제한 됩니다 확인 해야-대련 청 려 전극에. 이 목적을 위해 우리 신선한 매체에서 최적 pH 및 온도 조건 KIE 측정; 전에 전자 기증자로 젖 산의 높은 농도 포함 하는 표면에 뜨는 솔루션 대체 이 교체 봉사 두 역할: (1) 동유럽 표준시에 비해 업스트림 신진 대사 과정의 속도 향상 하 고 (2) 작업 전극 (에 S. oneidensis 씨-1의 단층 biofilm에서 발표 하는 상쾌한 수영 셀 생략 인듐 주석 첨가 산화물 (ITO) 전극). 새로운 실무자 유지 하 고 동유럽 표준시 프로세스 속도 결정 단계는 확인을 있도록 제시 상세한 프로토콜 것입니다.

프로토콜

1. ITO 전극 (그림 1)에 S. oneidensis 씨-1의 단층 Biofilm의 형성

참고: 다른 미생물과 전기 화학 반응 기의 오염을 방지 하기 위해, 모든 미디어, 구현 및 전기 화학 반응 기의 구성 한다 살 균 되어야 사전에. 때 깨끗 한 벤치에 모든 절차를 지휘 한다 S. oneidensis 씨-1 셀을 사용 하 고 전기 원자로 건설.

  1. S. oneidensis 씨-1 셀의 재배
    참고: S. oneidensis 씨-1의 단층 biofilm 형성 되었다는 이토에는 조건에 따라 전극 보고 이전4.
    1. S. oneidensis 씨-1 세포 성장, S. oneidensis 씨-1 파운드 매체 (20 g/L) 160 rpm에서 떨고 호 기성 조건에서 24 시간에 30 ° C에서의 15 mL에 Luria Bertani (파운드) (20 g/L) 및 bacto agar (15 g/L)로 구성 된 한 천 배지에서 성장 한 식민지를 추가 합니다.
    2. 10 분 동안 6000 × g 에서 세포 현 탁 액을 원심 및 정의 된 매체 (pH 7.8)의 15 mL에 결과 셀 펠 릿 resuspend (DM: NaHCO3 [2.5 g/L], CaCl2·2H2O [0.08 g/L], NH4Cl [1.0 g/L] MgCl2· 6 H2O [0.2 g/L], NaCl [10 g/L], 그리고 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] [HEPES; 7.2 g/L] ethanesulfonic 산), 젖 산 10 m m와 0.5 g/L 효 모 추출 물, 탄소 소스로 보충 및 S. oneidensis 씨-1에 대 한 추적 요소 각각.
    3. 또한 160 rpm에서 떨고와 12 h 30 ° C에서 aerobically 세포 현 탁 액을 배양 하 고 원심 다시 10 분 세척을 위한 6000 × g 에서 DM 매체와 두 번 결과 셀 펠 릿은 화학 전에 6000 × g에서 10 분 원심 분리 하 여 실험입니다.
  2. 3-전극 전기 화학 반응 (그림 1)의 건설
    1. 반응 기의 하단에 작업 전극으로 ITO 기판을 넣어.
    2. 그 후, 삽입 유리 실린더 (2 cm의 직경) 및 소계 (PTFE) 커버. 그런 다음 삽입 Ag/AgCl (포화 KCl)와 백 금 철사는 원자로에 참조 및 카운터 전극으로 각각.
      참고: 공기 및 솔루션의 누설을 방지 하기 위해 각 구성 요소 간의 부 틸 고무 시트를 삽입 합니다.
    3. DM의 4.0 mL 10mm 젖 산으로 보충 하 고 0.5 g/L 효 모 추출 화학 반응 기에 추가 합니다.
    4. 전기 화학 반응 기에서 누설 확인, 전기 화학 반응 화학 반응 기 내부의 혐 기성 조건을 유지 하기 위해 20 분 이상으로 질소 가스 흐름.
      참고: 다른 미생물 오염을 방지 하기 위해, 가스 한다 필터링 전에 그것은 전기 화학 반응으로 흐른다.
    5. 전기 화학 반응 기는 potentiostat에 연결 하 고 적용 0.4 V (표준 수소 전극 대 그녀) ITO 전극에는 외부 물 순환 시스템을 사용 하 여 30 ° C에서 전기 화학 반응 기의 온도 유지.
      참고: 외부 전기 분야의 영향을 방지 하기 위해, 전기 화학 반응 기는 패러데이 케이지에 배치 되어야 합니다.
  3. S. oneidensis 씨-1 세포 (그림 1 및 그림 2)의 전기 화학 경작
    1. 1.1 600 1.43의 광학 밀도에 단계에서 얻은 서 스 펜 션의 셀 밀도 조정 10 m m 0.5 g/L 및 젖 산 효 모에 의해 보충 하는 dm nm (OD600) 추출.
      참고: 올바른 세600를, 1.43 OD600 조정 전에 대 한 UV 분석기에 OD600 ≤ 0.8의 세포 현 탁 액을 적용 됩니다.
    2. 세포 현 탁 액의 0.3 mL 주사기를 사용 하 여 주입 포트를 통해 전기 화학 반응 기에 추가: 원자로에서 OD600 0.1로 변경.
      참고: OD600 와 0.3 mL 셀 서 스 펜 션의 추가 = 1.43 OD600 와 솔루션의 4.3 ml에서 4.0 mL 중간 결과 포함 하는 전기 원자로에 0.1 =. 다른 원자로 사용 하 여 다른 볼륨, 셀 밀도의 계산이 필요 합니다.
    3. 0.4 V (그녀) 대 25 h ITO 전극에 잠재적인 응용 프로그램을 계속 합니다.
      참고: ITO 전극에 단층 biofilm의 형성에 대 한 생산된 전류 전시 그림 2에서 50% 미만의 편차 확인 합니다.

2. 젖 산 10 m m (그림 3)와 신선한 DM 매체와 상쾌한의 교체

  1. 잠재적인 응용 프로그램을 중지 하 고 전기 화학 반응 기는 potentiostat와 물 순환 시스템에서 분리 합니다.
  2. 10 m m와 신선한 DM 매체와 상쾌한의 대체 젖이 나올
    1. DM를 포함 하는 매체에서 산소를 제거 하 10mm 젖 산 20 분 이상으로 병에 질소 가스 흐름.
    2. 천천히 흐르는에서 주사기를 사용 하 여 전기 화학 반응 기 내부의 모든 상쾌한 제거 질소 가스 (그림 3a, b).
      참고: 질소 가스에 의해 ITO 전극에는 biofilm를 위반을 피하기 위해, 가스 액체 표면 위의 흐름 해야 합니다.
    3. (그림 3c) 주사기를 사용 하 여 10mm 젖 산을 포함 하는 신선한 DM의 4.0 mL를 추가 합니다.
      참고: ITO 전극에는 biofilm를 위반을 피하기 위해, 전기 화학 반응 기의 벽을 따라 중간을 주사 천천히. 유지 하기 위해 젖은 biofilm, 매체 상쾌한의 제거 후 즉시 추가 되어야 합니다. 상쾌한의 제거 후 중간까지 1 분의 주입 S. oneidensis 씨-1는 biofilm에서 현재 생산을 영향을 주지 않습니다.
    4. 전기 화학 반응 기의 벽에 부착 된 상쾌한의 모두 제거를 전기 화학 반응 기 경사
    5. 총에 세 번 단계 2.2.2-2.2.4를 반복 합니다.
  3. 가스 흐름을 중지 하 고 potentiostat 다시, 303 공화국에서 ITO 전극 (그녀) 대 0.4 V 적용에 전기 화학 반응 기를 연결

3. 동유럽 표준시 과정 (그림 4)에 인기를 측정 하는 중수소 물 추가

  1. S. oneidensis 씨-1의 단층 biofilm에서 현재 생산 안정적 이며 빠른 속도로 증가 하지 않습니다 확인 합니다. 현재 가파르게 증가 하는 경우 현재 5% 증가 10 분 이상에서 안정화 될 때까지 기다립니다.
    참고: 다른 미생물 긴장의 오염 없이 ITO 전극에 단층 biofilm의 형성 확인 되었다 rDNA 시퀀스와 ITO 전극에 biofilm의 스캐닝 전자 현미경 이미지를 보고 이전4. 동유럽 표준시 프로세스 속도 제한의 확인에 대 한 추가 왕복 전자 중재자 100 µ M 안트라퀴논-1-된 α-AQS () 등의 효과 모니터링 합니다. 15 대 한 자세한 내용은 참조 및 대표적인 결과 섹션을 참조 하십시오.
  2. 농도 0.5% (v/v) D2O 원자로에 주사기를 사용 하 여 전기 화학 반응으로 무산 소 50% (v/v) D2O의 40 µ L를 추가 합니다.
    참고: D2O 추가 의해는 biofilm 손상을 방지, 주사 D2O drop-wise.
  3. 전류 안정화를 기다립니다 하 고 이후 추가 D2O 4.0% (v/v).
    참고: KIE 값 (D2O 및 H2O의 현재 생산의 비율)를, 현재 생산에 H2O 추가의 동일한 볼륨의 효과 확인 하십시오.

결과

0.4 V (그녀) 대에서 잠재적인 응용 프로그램의 25 h, 후 단층 biofilm 이전 스캐닝 전자 현미경 검사 법 또는4confocal 현미경 검사 법 의해 확인 되었다 이토 유리의 작업 전극에 형성 되었다. 단층 biofilm의 형성 중 S. oneidensis 씨-1에서 현재 생산의 대표적인 시간 과정은 그림 2에 표시 됩니다. 비록 현재는 모든 측정에 변경, 단층 biofi...

토론

우리의 전체 셀 전기 화학 분석 결과 단백질 전기에 비해 몇 가지 기술적인 이점이 있다. 단백질 정화 다단계 시간이 걸리는 절차 필요, 우리의 전체 셀 메서드 자체 조직된 biofilm 형성 세포 배양 후의 어느 날 걸립니다. 톰 c간의 안정적인 상호 작용을 달성 하기 위해-대련 청 려 고 전극, 우리 필요만 살 균과 청소의 전극 표면; 톰 c를 향하는 동안, 전극에 부착 단백질4

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 작품 과학 진흥 (JSP) KAKENHI 보조금 번호 24000010, 17 H 04969, 일본 사회에서 특별히 추진 연구 및 JP17J02602, 미국 사무실의 해군 연구 글로벌 (N62909-17-1-2038)는 선진적인 재정적으로 지원 했다. Y.T.는 JSP 연구원 이며 프로그램을 통해 JSP에 대 한 선도 대학원 학교 (공로) 지원.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass cylinderN/AN/ACustom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and baseN/AN/ACustom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubberN/AN/ACustom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
SeptaGL Science3007-16101Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrodeGEOMATECNo.0001Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrodeHOKUTO DENKOHX-R5Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wireThe Nilaco CooporationPT-351325Used as a counter electrode
Luria-Bertani (LB) Broth, MillerBecton, Dichkinson and Company244620Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1
Bacto agarBecton, Dichkinson and Company214010
Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS)TCIA1428
Flavin mononucleotide (FMN)Wako184-00831
NaHCO3Wako191-01305Used for defined medium (DM)
CaCl2 · 2H2OWako031-00435Used for DM
NH4ClWako011-03015Used for DM
MgCl2 · 6H2OWako135-00165Used for DM
NaClWako191-01665Used for DM
2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES)DOJINDO346-08235Used for DM
Sodium Lactate SolutionWako195-02305
Bacto Yeast ExtractBecton, Dichkinson and Company212750
Deuterium oxide (D, 99.9%)Cambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-PKAdditive for kinetic isotope effect experiments
IncubatorTOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.LTI-601SDUsed for precultivation
ShakerTAITECNR-3Used for precultivation
Autoclave machineTOMY SEIKO CO. LTD.LSX-500Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean benchSANYOMCV-91BNFUsed to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separatorEppendorf5430RRotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generatorPuequ CO. LTD.PNTN-2Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometerSHIMADZUUV-1800Used for optimization of cell density
PotentiostatBioLogicVMP3Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulatorAS ONETR-1AUsed for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cageHOKUTO DENKOHS-201SUsed for electrochemical experiments

참고문헌

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