JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол поклеточного электрохимических экспериментов для изучения вклада протонного транспорта по ставке внеклеточного переноса электронов через внешней мембраны цитохромов комплекс в Shewanella oneidensis MR-1.

Аннотация

Прямых электрохимических обнаружения c-типа цитохрома комплексы, встроенных в бактериальной внешней мембраны (внешней мембраны c-типа цитохрома комплексов; ОМ c- Cyts) имеет недавно возникла как Роман поклеточного аналитического метода характеризовать бактериальной переноса электронов от дыхательной цепи на улицу клетки, называют внеклеточного переноса электронов (EET). Хотя были исследованы пути и кинетика электронов потока во время реакции EET, поклеточного Электрохимический метод для изучения воздействия транспорта катион, связанные с EET еще не созданы. В настоящем исследовании примером биохимического метода рассмотреть воздействие кинетической изотопа дейтерия (ки) на EET через ом c- Cyts, используя модель микробом, Shewanella oneidensis MR-1, описан. КИ на процесс EET могут быть получены, если EET через ом c- Cyts действует как тариф ограничивая шаг в микробной текущего производства. С этой целью, перед добавлением D2O супернатанта решения был заменен свежие средства массовой информации, содержащие достаточное количество электронов доноров поддержать уровень вверх метаболических реакций и удалить планктонных клетки из единой однослойная биопленки на рабочем электроде. Альтернативные методы для подтверждения ограничения скорости шаг в микробной текущего производства как EET через ом c- Cyts также описаны. Наш метод поклеточного электрохимического анализа для изучения кинетики протонного транспорта может быть применен к другим Электроактивные микробных штаммов.

Введение

Электрохимические методы непосредственно характеризуют редокс белка в нетронутыми бактериальной клетке недавно появились после обнаружения металла сокращение микробных штаммов, например S. oneidensis MR-1 или Geobacter sulfurreducens СПС, которые имеют внешняя мембрана тип c тситохрома комплексы (ом c-Cyts) подвергается ячейку внешней1,2,3,4,5. ОМ c- Cyts посредником переноса электронов от дыхательной цепи для твердых субстратов внеклеточно расположенных. Этот транспорт называется внеклеточного переноса электронов (EET)1,6 и представляет собой критический процесс для новых биотехнологий, в частности микробные топливные элементы6. Таким образом чтобы понять основной EET кинетики и механизмов и ее связь с микробной физиологии, ом c -Cyts были исследованы с помощью поклеточного электрохимии4,7, в сочетании с микроскопией 8 , 9,10,спектроскопии11и молекулярной биологии2,4. Напротив методы для изучения последствий EET-связаны катионов транспорта, например, протонов, на кинетику EET в живых клетках едва созданы, несмотря на протонного транспорта через бактериальной мембраны, что решающую роль сигнализации, гомеостаза и энергии производство12,,1314. В настоящем исследовании, мы опишем технику для изучения воздействия протонного транспорта на кинетику EET в ячейке S. oneidensis MR-1 с помощью поклеточного электрохимических измерений, которая требует идентификации тариф ограничивая шаг в микробные текущего производства15.

Прямой способ оценить вклад протонного транспорта на связанные EET является эффект кинетическая изотопа дейтерия (ки). КИЕ наблюдается как изменения в кинетика электронов передачи после замена протонов с ионы дейтерия, который представляет воздействия транспорта протон электрон передачи кинетики16. Теория KIE, сама была создана хорошо с использованием электрохимических измерений с очищенной ферментов17. Однако, поскольку текущее производство в S. oneidensis MR-1 результаты из нескольких, разнообразных и меняющихся процессы18, один не может идентифицировать просто EET как процесс ограничения скорости. Соблюдать KIE на Протон транспортных процессов в сочетании с EET, мы должны подтвердить, что микробные текущего производства ограничивается переноса электронов через ом c- Cyts к электроду. Для этой цели мы заменили супернатанта решение с свежей средой, с высокой концентрацией лактата как донора электрона на оптимальный рН и температурные условия перед KIE измерения; Эта замена служил две роли: (1) повысить уровень вверх метаболических процессов, по сравнению с EET и (2) опущены плавательный клетки в надосадке освобожден от биопленки монослоя S. oneidensis MR-1 на рабочих электродом ( Индия легированный оловом оксид (ITO) электрод). Представлен подробный протокол призван помочь новичкам сохранить и подтвердить, что процесс EET курс определение шаг.

протокол

1. формирование монослоя биопленки S. oneidensis MR-1 на Ито электрода (рис. 1)

Примечание: Для предотвращения загрязнения электрохимических реактора с другими микробами, все средства массовой информации, внедряет и компонентов электрохимических реактора должны быть простерилизованы заранее. Когда с использованием клеток S. oneidensis MR-1 и строительства электрохимического реакторов, все процедуры должны проводиться на лавочке чистой.

  1. Культивирование клеток S. oneidensis MR-1
    Примечание: Однослойная биопленки S. oneidensis MR-1 был сформирован на Ито электрода условий сообщалось ранее4.
    1. Рост клеток S. oneidensis MR-1, добавьте один колонии S. oneidensis MR-1 выросла на плите агар составе Бертани Лурия (LB) (20 г/Л) и bacto агар (15 г/Л) в 15 мл среды фунтов (20 г/Л) на 30 ° C в течение 24 ч в аэробных условиях встряхивании в 160 об/мин.
    2. Центрифуга суспензию клеток на 6000 × g за 10 мин и Ресуспензируйте Пелле результирующая ячейка в 15 мл определенной среды (pH 7,8) (DM: NaHCO3 [2,5 г/Л], CaCl2·2H2O [0,08 г/Л], NH4Cl [1,0 г/Л], MgCl2· 6 H2O [0,2 г/Л], [10 г/Л], NaCl и 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic кислоты [HEPES; 7,2 г/Л]), с 10 мм молочной кислоты и 0,5 г/Л дрожжевой экстракт как источник углерода и микроэлементов для S. oneidensis MR-1 , соответственно.
    3. Далее культивировать суспензию клеток высокоусвояемого при 30 ° C в течение 12 ч при встряхивании в 160 об/мин и центрифуги снова на 6000 × g для 10 минут вымыть результирующая ячейка Пелле дважды с DM среднего центрифугированием 10 мин на 6000 × g перед электрохимические эксперимент.
  2. Строительство 3 электрод электрохимических реактора (рис. 1)
    1. Ставлю ITO подложке рабочих электродом в нижней части реактора.
    2. Впоследствии вставьте стеклянный цилиндр (диаметром 2 см) и крышкой из политетрафторэтилена (ПТФЭ). Затем вставьте Ag/AgCl (KCl насыщенных) и провод платины реактора как ссылка и Счетчик электродов, соответственно.
      Примечание: Для предотвращения утечки воздуха и решения, вставьте лист бутилкаучука между каждого компонента.
    3. Добавление 4.0 мл дм, дополненные лактат 10 мм и 0,5 г/Л дрожжевой экстракт в электрохимических реактора.
    4. После подтверждения, что нет никакой утечки из электрохимических реактора, поток газ азот в электрохимических реактора более 20 мин для поддержания анаэробных условий внутри электрохимических реактора.
      Примечание: Для предотвращения загрязнения с другими микробами, газ должны быть отфильтрованы прежде, чем она впадает в электрохимических реактора.
    5. Подключите электрохимических реактора к потенцио и применять 0,4 V (по сравнению с стандартным водорода электрода, она) к электроду Ито, сохраняя температуру электрохимических реактора при 30 ° C, с помощью системы циркуляции воды внешнего.
      Примечание: Чтобы предотвратить эффект внешнего электрического поля, электрохимических реактора должны помещаться в клетку Фарадея.
  3. Электрохимические культивирования клеток S. oneidensis MR-1 (рис. 1 и рис. 2)
    1. Отрегулируйте плотность ячеек подвески, полученные на этапе 1.1 оптической плотности 1.43 600 Нм (600OD) с DM, дополнен 10 мм молочной кислоты и 0,5 г/Л дрожжей экстракт.
      Примечание: Чтобы получить правильный ОД600, примените суспензию клеток ОД600 ≤ 0,8 UV-vis-спектрометр до корректировки ОД600 до 1,43.
    2. Добавление 0,3 мл суспензии клеток в электрохимический реактор через порт впрыска, с помощью шприца: OD600 в реакторе изменяется до 0,1.
      Примечание: Добавление 0,3 мл суспензии клеток с ОД600 = 1.43 в электрохимических реактора, содержащие 4.0 мл средние результаты в 4.3 мл раствора с ОД600 = 0.1. При использовании других реакторов с различными объемами, расчет плотности ячейки не требуется.
    3. Продолжить потенциальное применение на 0,4 V (или она) Ито электрод для 25 ч.
      Примечание: Для образования монослоя биопленки на Ито электрода, убедитесь, что произведенные ток exhibits отклонение меньше, чем 50% из рисунка 2.

2. Замена супернатант со свежими DM средний с лактат 10 мм (рис. 3)

  1. Остановить потенциальное применение и отсоедините электрохимический реактор от потенцио и системы циркуляции воды.
  2. Замена супернатант со свежими DM средний с 10 мм лактата
    1. Поток газа азота в бутылку, содержащие DM с 10 мм лактата более 20 мин для удаления кислорода из среды.
    2. Медленно извлеките все супернатант внутри электрохимических реактора с помощью шприца, под проточной газ азот (Рисунок 3А, b).
      Примечание: Чтобы избежать нарушения биопленки на электроде Ито азот газ, газ должна течь над поверхностью жидкости.
    3. Добавление 4.0 мл свежего дм, содержащие 10 мм лактат, с помощью шприца (рис. 3 c).
      Примечание: Чтобы избежать нарушения биопленки на электроде Ито, медленно вводить среднего вдоль стены электрохимических реактора. Чтобы сохранить влажные биопленки, носитель следует добавить сразу же после удаления супернатант. Инъекции средних по 1 мин после удаления супернатант не влияет на текущее производство от биопленки S. oneidensis MR-1.
    4. Наклонной электрохимических реактора для удаления всех супернатант прикреплена к стене электрохимических реактора.
    5. Повторите шаги 2.2.2-2.2.4 три раза в общей сложности.
  3. Остановить поток газа и подключить электрохимических реактора к потенцио снова, применяя 0,4 V (или она) к электроду Ито в 303 K.

3. добавление воды дейтерия для измерения KIE на процесс EET (рис. 4)

  1. Убедитесь, что текущее производство от биопленки монослоя S. oneidensis MR-1 является стабильным и не быстро увеличиваться. Если ток резко увеличивается, подождите, пока тока стабилизируется в течение 5% увеличение свыше 10 мин.
    Примечание: Формирование монослоя биопленки на Ито электрода без загрязнения других микробных штаммов был подтвержден рДНК последовательности и сканирования электрона микроскопических изображений биопленки на Ито электрода, как сообщалось ранее,4. Для подтверждения ставки ограничения в процессе EET контролировать эффект добавления челночные электрона посредников например 100 мкм присутствии антрахинона-1-сульфонат (α-AQS). В разделе Представитель результаты и ссылки15 для более подробной информации.
  2. 40 мкл аноксии 50% (v/v) D2O, в электрохимический реактор с помощью шприца, таким образом, чтобы концентрация составляет 0,5% (v/v) D2O в реакторе.
    Примечание: Чтобы предотвратить повреждение биопленки добавлением D2O, придать D2O каплям.
  3. Подождите для тока стабилизации и впоследствии добавить Д2O до 4,0% (v/v).
    Примечание: Чтобы получить значение Ки (отношение текущего производства при наличии D2O и H2O), проверьте эффект такой же объем H2O Добавление текущего производства.

Результаты

После 25 h потенциальных приложений на 0,4 V (или она) однослойная биопленки был сформирован на рабочем электроде стекла ITO, который ранее был подтвержден confocal микроскопии4или растровая электронная микроскопия. Представитель время курс текущего производства...

Обсуждение

Наши поклеточного электрохимических пробирного имеет ряд технических преимуществ, по сравнению с белка электрохимии. В то время как очищение протеина требует длительных процедур многоступенчатый, наши поклеточного метод принимает один день самоорганизации биопленки после клеточно?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была финансовой поддержке целевых субсидий для специально поощрять исследования от японского общества для поощрения науки (JSP) номер гранта KAKENHI 24000010, 17H 04969 и JP17J02602, нас управлением военно-морских исследований глобальных (N62909-17-1-2038). Ю.ц. научный сотрудник JSP-страницы и поддерживается JSP-страницы через программы для ведущих выпускников школ (ЗАСЛУГИ).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass cylinderN/AN/ACustom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and baseN/AN/ACustom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubberN/AN/ACustom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
SeptaGL Science3007-16101Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrodeGEOMATECNo.0001Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrodeHOKUTO DENKOHX-R5Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wireThe Nilaco CooporationPT-351325Used as a counter electrode
Luria-Bertani (LB) Broth, MillerBecton, Dichkinson and Company244620Medium for precultivation of S. oneidensis MR-1
Bacto agarBecton, Dichkinson and Company214010
Anthraquinone-1-sulfonate (α-AQS)TCIA1428
Flavin mononucleotide (FMN)Wako184-00831
NaHCO3Wako191-01305Used for defined medium (DM)
CaCl2 · 2H2OWako031-00435Used for DM
NH4ClWako011-03015Used for DM
MgCl2 · 6H2OWako135-00165Used for DM
NaClWako191-01665Used for DM
2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES)DOJINDO346-08235Used for DM
Sodium Lactate SolutionWako195-02305
Bacto Yeast ExtractBecton, Dichkinson and Company212750
Deuterium oxide (D, 99.9%)Cambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-PKAdditive for kinetic isotope effect experiments
IncubatorTOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.LTI-601SDUsed for precultivation
ShakerTAITECNR-3Used for precultivation
Autoclave machineTOMY SEIKO CO. LTD.LSX-500Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean benchSANYOMCV-91BNFUsed to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separatorEppendorf5430RRotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generatorPuequ CO. LTD.PNTN-2Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometerSHIMADZUUV-1800Used for optimization of cell density
PotentiostatBioLogicVMP3Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulatorAS ONETR-1AUsed for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cageHOKUTO DENKOHS-201SUsed for electrochemical experiments

Ссылки

  1. Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).
  2. Bretschger, O., et al. Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants. Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).
  3. Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).
  4. Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
  5. Strycharz, S. M., et al. Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400. Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).
  6. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).
  7. Coursolle, D., Gralnick, J. A. Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1. Front. Microbiol. 3, (2012).
  8. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).
  9. McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy. ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).
  10. Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).
  11. Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).
  12. Myers, C. R., Nealson, K. H. Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).
  13. Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1. Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).
  14. Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex. Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).
  15. Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport. Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).
  16. Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions. Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).
  17. Cleland, W. W. The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms. J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).
  18. Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells. Front. Microbiol. 6, (2015).
  19. Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds. Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).
  20. Xie, X. S., Zubarev, R. A. Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth. Plos One. 9 (7), e102071 (2014).
  21. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
  22. Edwards, M. J., et al. Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer. Sci. Rep. 5, 11677 (2015).
  23. Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1. Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).
  24. Guo, J. B., et al. Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators. Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).
  25. Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions. J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).
  26. Myers, C. R., Myers, J. M. Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1. Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).
  27. Lower, B. H., et al. Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1. Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).
  28. Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation. Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).
  29. McMillan, D. G. G., et al. The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes. Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).
  30. Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
  31. McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia. Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).
  32. Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter. Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).
  33. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).
  34. Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1. J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).
  35. Rowe, A. R., et al. Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates. bioRxiv. , 116475 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

134bioelectrochemistry

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены