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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Cyclin-abhängige Kinase 1 (Cdk1) wird in der G2-Phase des Zellzyklus aktiviert und reguliert viele zelluläre Signalwege. Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine in-vitro- Kinase Assay mit Cdk1, wodurch die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites für zellulare Ziele von diesem wichtigen Kinase.

Zusammenfassung

Cyclin-abhängige Kinase 1 (Cdk1) ist ein master-Controller für den Zellzyklus in allen Eukaryoten und schätzungsweise 8-13 % des Proteoms phosphorylates; die Anzahl der identifizierten Ziele für Cdk1, besonders in den menschlichen Zellen ist jedoch nach wie vor niedrig. Die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites ist wichtig, da sie mechanistische Einblicke in wie Cdk1 Zellzyklus steuert. Regulierung des Zellzyklus ist entscheidend für die treuen Chromosom Abtrennung und Mängel in diesen komplizierten Prozess zu Chromosomenaberrationen und Krebs führen.

Hier beschreiben wir einen in-vitro- Kinase Assay, der verwendet wird, um Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites zu identifizieren. In diesem Test ist ein gereinigtes Protein phosphorylierten in Vitro kommerziell verfügbare menschliche Cdk1/cyclin B. erfolgreich Phosphorylierung wird bestätigt durch SDS-PAGE und Phosphorylierung Websites werden anschließend durch Massenspektrometrie identifiziert. Wir beschreiben auch Reinigung-Protokolle, die Ausbeute sehr reine und homogene Protein Vorbereitungen für die Kinase Assay und eine verbindliche Assay für die funktionale Verifikation der identifizierten Phosphorylierung-Standorte, die die Interaktion zwischen den Sonden ein klassischer nuklearen Lokalisierung-Signal (cNLS) und seine Nukleartransporten Rezeptor Karyopherin α. Experimentelles Design unterstützen, überprüfen wir Ansätze für die Vorhersage von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites von Proteinsequenzen. Zusammen stellen diese Protokolle einen sehr leistungsfähigen Ansatz, der Renditen Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites und mechanistische Studien in wie Cdk1 Zellzyklus steuert. Da diese Methode stützt sich auf gereinigten Proteinen, kann es zu jedem Modell Organismus und Erträge zuverlässige Ergebnisse, vor allem in Kombination mit Zelle funktionelle Studien angewendet werden.

Einleitung

Kinasen sind Enzyme, die Übertragung von Phosphatgruppen von ATP auf Substraten und regulieren viele zelluläre Prozesse. Diese Phosphorylierung ist reversibel, schnell, fügt zwei negative Ladungen und freie Energie speichert und gehört zu den häufigsten posttranslationale Modifikationen von Zellen verwendet. Cdk1, die auch bekannt als Zellteilung Zyklus Protein 2 Homolog (cdc2) ist ein master-Controller für den Zellzyklus in allen Eukaryoten1,2,3,4,5, und phosphorylates ein Geschätzte 8 bis 13 % des Proteoms6,7.

Während Proteomik-Studien haben viele Phosphorylierung Websites in den Proteinen, in den meisten Fällen identifiziert ist die Kinase verantwortlich für diese Änderungen unbekannt. Die Anzahl der bekannten Cdk1 Zielen, vor allem in menschlichen Zellen ist niedrig7. Die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites ist wichtig, da es mechanistische Studien, die festlegen ermöglicht, wie Cdk1 Zellzyklus steuert. Regulierung des Zellzyklus ist wichtig für Treue Chromosom Segregation und Zellteilung, und eine Vielzahl von zellulären Prozessen auftreten, um diese wichtige physiologische Funktion unterstützen müssen. Dazu gehören aufzuhalten, Transkription und Translation vor dem Beginn der Mitose sowie eine dramatische Reorganisation in zellulare Struktur und Organisation, z. B. Demontage der Kernhülle, Chromosom Kondensation und Montage der mitotischen Spindel. Deregulierung und Fehler in diesen Prozessen verursachen Krebs, Geburtsschäden oder mitotische Zelltod. Spezifische Inhibitoren des Cdk1 wie RO-3306 waren entwickelten8, die bieten leistungsstarke Tools für funktionelle Studien, und einige dieser Inhibitoren sind derzeit in klinischen Studien zur Behandlung von Krebs (siehe9 zur Überprüfung).

Hier beschreiben wir einen in-vitro- Kinase Assay, der die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites ermöglicht. In diesem Test wird kommerziell verfügbare menschliche Cdk1/cyclin B verwendet, um eine gereinigte Ziel Protein in Vitrophosphorylieren. Phosphorylierung eines Substrates erhöht seine Masse und fügt zwei negative Ladungen; daher bestätigt erfolgreiche Phosphorylierung eine aufwärts Verschiebung der Protein Gel Band auf SDS-PAGE. Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites werden anschließend durch Massenspektrometrie Analyse des Proteins in Vitro phosphoryliert identifiziert. Experimentelles Design unterstützen, überprüfen wir auch Berechnungswerkzeuge und Referenzen für die Vorhersage von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites die Proteinsequenz. Darüber hinaus erläutern wir im folgenden Reinigung-Protokolle, die sehr reine und homogene Protein Vorbereitungen für die Kinase Assay ergeben. Schließlich identifizierte Phosphorylierung Websites durch funktionelle Studien überprüft werden müssen, und eine einfache Bindung-Assay wird hier beschrieben, für diesen Zweck. Kombiniert, ist dies ein sehr leistungsfähiges Ansatz, der Renditen Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites und mechanistische Studien in wie Cdk1 den Zellzyklus7,10,11 steuert. Da diese Methode auf gereinigten Proteinen angewiesen ist, kann es zu jedem Modell Organismus und Erträge zuverlässige Ergebnisse angewendet werden. Funktionale Überprüfung des erhaltenen Phosphorylierung Websites in Vitro wird jedoch empfohlen, wie Zellen zusätzliche regulatorische Mechanismen, z. B. posttranslationale Modifikationen, Interaktionspartner oder zellulären Lokalisation verfügen, kann Phosphorylierung Websites oder unzugänglich für die Anerkennung von Cdk1 rendern.

Cdk1 erkennt eine Konsens-Phosphorylierung-Website, die besteht aus (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), wo X ist keine Rückstände und ein Serin oder Threonin der Ort der Phosphorylierung ist. Besonders wichtig für die Anerkennung ist das Vorhandensein von Prolin in der + 1-Position. Darüber hinaus werden grundlegende Rückstände in den + 2 oder + 3 Positionen bevorzugt, mit die meisten Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites mit einer Lys oder Arg auf die + 3 position6,12.

Aktivierung des Cdk1 ist streng geregelt und führt zu Beginn der Mitose1,2,3,4,5. Im Allgemeinen hängt die Aktivität von cyclin-abhängigen Kinasen ihre Assoziation mit deutlichen Cyclin (cyclin A, B, C, D und E in den Menschen), die bei oszillierenden Ebenen in der gesamten Zellzyklus13ausgedrückt werden. Cdk1 Ausdruck ist konstant über den Zellzyklus und die Regulierung ihrer Tätigkeit stützt sich auf seine Assoziation mit den regulatorischen Untereinheiten cyclin A und cyclin B5,13,14,15, als gut als Post-translationalen Modifikationen. Bildung des Cdk1/cyclin B-Komplex ist erforderlich für die Kinase Aktivierung5,14,15,16,17,18. In der G2-Phase cyclin B übersetzt in das Zytosol und importiert in den Zellkern, wo es an Cdk15,14,15,16,17,18 bindet; jedoch wird Cdk1/cyclin B inaktiviert durch Phosphorylierung an Thr14 und Tyr15 Rückstände von der menschlichen Cdk1-hemmenden Kinasen Myt1 (cdc2-hemmenden membranassoziierten Tyrosin und Threonin-spezifische Kinase) und Wee1, bzw.19gehalten, 20,21. In der Spätphase der G2 Dephosphorylation Thr14 und Tyr15 durch Zellteilung Zyklus 25 Phosphatase (cdc25) aktiviert die Kinase-Aktivität des Cdk1/cyclin B-Komplex und löst die Einleitung der Mitose12,14, 18 , 20 , 22 , 23. Phosphorylierung des Thr161 auch für Cdk1/cyclin B Aktivierung ist erforderlich und wird durch Cdk7, die Aktivierung von Cdk-Kinase (CAK)18vermittelt. Abbau von cyclin B in Anaphase inaktiviert Cdk1, so dass Ausstieg aus Mitose24,25. Aktivierung des Cdk1/cyclin B wird daher ein komplizierter Prozess. Die hier vorgestellten Protokoll erfolgt mit handelsüblichen Cdk1/cyclin B. Während rekombinante Expression dieses Komplexes in Insektenzellen es aktiviert in Vivo durch endogene Kinasen14,20 ist und bleibt aktiv im gereinigten Zustand. Die daraus resultierende aktive, rekombinante menschliche Cdk1/cyclin B eignet sich für in-vitro- Kinase-Assays.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites in den menschlichen Zentromer Protein F (CENP-F)10. CENP-F ist ein Kinetochor-Protein, das befindet sich im Zellkern während der meisten Zeit der Interphase (G1 und S-Phase) und der Ausfuhr nach dem Zytosol in der G2 Phase26,27,28 in einer Cdk1-abhängigen Weise10, 11. nuklearen Lokalisierung durch einen zweiseitigen cNLS26gewährt wird. cNLSs werden von den Nukleartransporten Faktor Karyopherin α, erkannt, die zusammen mit Karyopherin β und RanGDP, die Einfuhr von cNLS-Cargo in den Zellkern29erleichtert. Nuclear Export in der G2-Phase wird über eine unbekannte Export Weg10erleichtert. Sobald CENP-F in die Zellflüssigkeit befindet, es wird eingestellt, um die Kernhülle und wiederum stellt den motor Protein Komplex dynien30,31. Dieser Weg ist wichtig, den Kern der Centrosome entsprechend während der Anfangsphase der mitotischen Spindel Baugruppe in ein dynien-abhängigen Weise positionieren ist wichtig für das richtige Timing der mitotischen Eintrag und ein grundlegender Vorgang im Gehirn Entwicklung30,31,32. Beginnend in der G2-Phase, wird CENP-F auch in das Kinetochor eingebaut wo hat wichtige Aufgaben für Treue Chromosom Abtrennung27,28,33,34,35 . Ein wichtigster regulatorische Schritt dieser Wege ist der nuklearen Export von CENP-F in der G2-Phase, die Cdk110,11abhängig ist. Wir beschreiben hier ein Protokoll für die Identifizierung von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites in die cNLS CENP-f Phosphomimetic Mutationen dieser Seiten verlangsamen nuclear Import von CENP-F, was darauf hindeutet, dass Cdk1/cyclin B direkt zellulären Lokalisation der CENP-F durch Phosphorylierung von seinem cNLS10regelt.

Insgesamt, dieser in-vitro- Kinase Assay ermöglicht die Identifikation von spezifischen Substraten für die Kinase Cdk1. Purified Zielproteine phosphorylierten in Vitro durch die im Handel erhältlichen Cdk1/cyclin B-Komplex und die Phosphorylierung Websites sind werden anschließend durch Massenspektrometrie identifiziert. Die Identifikation des Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites unterstützt mechanistische Studien, die zeigen, wie Cdk1 Zellzyklus steuert.

Protokoll

(1) Vorhersage von Cdk1-spezifische Phosphorylierung Webseiten, die auf die Proteinsequenz

  1. Analysieren Sie vor Beginn der Kinase Assay die Proteinsequenz für vorhergesagten Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites und suchen Sie die Literatur für experimentell etablierten Phosphorylierung Websites mit unbekannten Kinase Spezifität zu. Verwenden Sie die folgenden Tools, Datenbanken und Referenzen, die zusammengefasst sind.
    1. Verwenden Sie die iGPS 3.0 Software36,37 (http://gps.biocuckoo.org/online_full.php) Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites in der Zielsequenz Proteins vorherzusagen. Verwenden Sie den Link hier für eine umfassende Vorhersage, die Anmerkungen der Sekundärstruktur und Oberfläche Zugänglichkeit enthält.
    2. Geben Sie in der Software die Proteinsequenz im FASTA-Format. Überprüfen Sie für Kinase Spezifität Serin/Threonin-Kinase, Zolltransitdokumente, CDK, CDC2 CDK1zu, und deaktivieren Sie alle anderen Besonderheiten. Klicken Sie auf Mittel als die Schwelle, und klicken Sie auf die Schaltfläche " senden ".
    3. Vergleichen Sie die resultierende vorhergesagten Sites mit Cdk1 Konsens Phosphorylierung Website (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg).
    4. Wichtig ist, überprüfen Sie die vorhergesagte Website für die Proline neben der phosphorylierten Rückstand (einige Cdk1 Substrate sind bei einer minimalen Website (Ser/Thr-Pro)6,12phosphoryliert). Überprüfen Sie darüber hinaus grundlegende Rückstände, die in den + 2 oder + 3 Positionen, mit die meisten Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites mit einer Lys oder Arg auf der + 3 Position6,12bevorzugt werden.
  2. Überprüfen Sie auch die Website für die Anerkennung, zugänglich ist, wie das Vorhandensein einer vollständigen Konsens-Website für Cdk1 Phosphorylierung nicht ausreicht.
    1. Überprüfen Sie die Oberfläche Zugänglichkeit und Sekundärstruktur Vorhersage Anmerkung in der iGPS-Ausgabe, die besagt, ob die Website vorhergesagt wird, zugänglich zu machen; N - und C-Termini der Proteine sind in vielen Fällen flexibel und zugänglich für Phosphorylierung.
    2. Wenn eine x-ray-Struktur des Zielproteins verfügbar ist, überprüfen Sie vermeintliche Phosphorylierung-Zugang durch die Überprüfung ihrer Position in der Struktur.
  3. Suche Literatur für experimentell etablierten Phosphorylierung Websites mit unbekannten Kinase Spezifität mit UniProtKB/Swiss-Prot Datenbank38 (http://www.uniprot.org).
    1. Geben Sie den Namen des Proteins in das Suchfeld ein und klicken Sie auf die Schaltfläche " Suchen ". Wählen Sie die richtige Reihenfolge-Eintrag. Phosphorylierung Websites sind kommentiert und im Abschnitt Aminosäure Änderungen verwiesen.
    2. Suche für Proteomics Studien der mitotischen Auszüge aus menschlichen Zelle Linien7,39,40, die besonders nützlich sind, weil Cdk1 aktiv in der G2-Phase des Zellzyklus wird.
  4. Zweiseitigen cNLS durch NLSmapper (optional) zu identifizieren.
    Hinweis: Für Proteine, die shuttle zwischen dem Zytosol und der Kern, ist ein gemeinsamer Mechanismus für die Regulierung der zellulären Lokalisation der Phosphorylierung des zweiseitigen cNLS in die-1 Position des großen Motiv von Cdk1. Die Phosphorylierung abschafft nuklearen Lokalisierung in die G2 Phase10,41,42,43.
    1. Identifizieren Sie für solche pendelt Proteine die cNLS in die Proteinsequenz durch NLSmapper43 (http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi). Die Proteinsequenz als Text im Feld Sequenz einfügen, wählen Sie einen Cut-Off-Wert von 5,0 und suchen die NLS in der gesamten Regionzu wählen. Klicken Sie auf Vorhersagen NLS .
    2. Vergleichen Sie die daraus resultierenden vorhergesagten cNLS gegen die Konsensussequenz einen zweiseitigen cNLS, bestehend aus das kleine Motiv (Lys-Arg), ein Linker mindestens 10 Rückstände und das große Motiv (Lys-Lys/Arg-X-Lys/Arg), wo X ist keine Rückstände, die nicht negativ geladen ist .
    3. Überprüfen Sie, ob die prognostizierte Cdk1 Phosphorylierung Website (*) sich neben dem großen Motiv in der-1-Position des Linkers befindet: Ser/Thr*-Pro/X-X-Lys-Lys/Arg-X-Lys/Arg.
      Hinweis: Die Phosphorylierung des zweiseitigen cNLS in die Position-1 Cdk1 entstand als Regelmechanismus für zellulären Lokalisation für mehrere pendelt Proteine10,41,42, 43.

(2) Expression rekombinanter Proteine in Escherichia Coli

  1. Verwenden Sie die Ausdruck Plasmiden von Schritte 2.1.1-2.1.2 für den Ausdruck von rekombinanten Proteinen in E. Coli.
    1. Um dem menschlichen CENP-F (Rückstände 2.987 3.065) Ausdruck erstellenerstellen, generieren Einsätze durch die Verstärkung von DNA-Fragmente durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) von einem Full-Length CENP-F-Konstrukt (GenBank Beitritt: U19769.1). Verwenden Sie die folgenden Primer: AGTCGGGGATCCCAGCAATCTAAACAAGATTCCCG und AGTCGGCTCGAGTCATTATTCTGCAGGGTGAATACCACTCATG.
      Hinweis: Das Full-Length menschlichen CENP-F-Plasmid wurde großzügig von Dr. X. Zhu, Institute for Biological Sciences, chinesische Akademie von Wissenschaften, Shanghai, China zur Verfügung gestellt.
      1. Klonen Sie die Einlage in den pGEX6p1-Vektor mit BamHI und XhoI Restriktionsschnittstellen. Verwenden Sie dieses Plasmid N-terminale Glutathion S-Transferase (GST) Fusionsproteine CENP-f (Rückstände 2.987 3.065) zum Ausdruck bringen.
        Hinweis: GST-Tag können Sie durch die PreScission Protease (im folgenden als PS Protease bezeichnet) abgespalten.
    2. Für die menschliche Karyopherin α-Ausdruck erstellen, generieren Einsätze durch die Verstärkung von DNA-Fragmente mittels PCR aus einer durchgehenden Karyopherin α2 cDNA Vorlage (Sequenz Beitritt NM_002264.3; Primer: GCACTACATATGTCCACCAACGAGAATGCTAATA und TCACGCCTCGAGTTATCAAAAGTTAAAGGTCCCAGGAGCC).
      Hinweis: Aufgrund der Ähnlichkeit der Isoformen, ist dieses Karyopherin α2-Konstrukt im nachfolgenden Text als Karyopherin α bezeichnet.
      1. Klonen Sie die Einlage in den pET28a-Pres-Vektor mit NdeI und XhoI Restriktionsschnittstellen.
        Hinweis: Dies ist eine modifizierte pET28a Vektor, in dem die Sequenz-Codierung für die Thrombin-spaltstelle durch eine Sequenz ersetzt wurde, die für eine PS-Protease-spaltstelle kodiert. Dieses Plasmid verwenden, um ein Schmelzverfahren Protein der Karyopherin α mit einer N-terminalen seiner6auszudrücken-Tag, wo die seine6-Tag aus durch PS-Protease gespalten werden kann.
  2. Führen Sie Site-verwiesene Mutagenese mit einem Kit, um Punktmutationen an ein Zielproteinzu erstellen.
  3. Die rekombinanten Proteinen in E. Coli für die anschliessende Reinigung Ausdrücken.
    1. Machen Sie folgende Bestände: 50 mg/mL Kanamycin (1:1, 000-Stammlösung), 35 mg/mL Chloramphenicol in 70 % Ethanol (1:1 000), 100 mg/mL Ampicillin (1:1, 000) und 1 M Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG; 1:5, 000).
    2. Steril filtern die Bestände und Lagerung bei-20 ° C. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-wechseln für IPTG.
    3. Verwandeln Sie 1 µL expressionsplasmid in 50 µL kompetente Zellen des Stammes E. Coli Rosetta 2 (DE3) pLysS, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    4. Platte die Kultur auf Agar Luria-Bertani (LB) mit Chloramphenicol (35 µg/mL LB) und Ampicillin (100 µg/mL LB) für die CENP-F Konstrukt oder Chloramphenicol und Kanamycin (50 µg/mL Kultur) für das Karyopherin-α-Konstrukt. Inkubieren Sie die Platten für 12-20 h bei 37 ° c
    5. Wählen Sie eine einzelne Kolonie und impfen Sie 50 mL LB ergänzt mit Antibiotika (siehe Punkt 2.3.4) zu. Inkubieren Sie die Vorkultur unter Schütteln bei 160-180 u/min für 12-20 h bei 37 ° c
    6. Bereiten Sie 1 L LB Medium in einer 2.800 mL verblüfft Fernbach Kolben. Zwei Fläschchen für jede Vorkultur und Autoklaven machen sie. Um die Belüftung zu ermöglichen, füllen Sie die Kolben zu mehr als zwei Drittel der Flasche Volumen nicht. Erlenmeyerkolben können auch verwendet werden.
    7. Antibiotika (Schritt 2.3.4) und 10 mL einer sterilen gefiltert 40 % (w/V) Glukose-Lösung pro 1 L von gekühlten lb hinzufügen 20 mL Vorkultur pro 1 L LB-Medium hinzufügen.
      Hinweis: Die Extinktion bei 600 nm eine 01:10 Verdünnung von der Vorkultur zwischen 0,15-0,2 sollen.
    8. Inkubieren Sie die Kolben unter Schütteln bei 160-180 u/min bei 37 ° c Messung der Extinktion bei 600 nm der Bakterienkultur regelmäßig. Wenn die Extinktion 0,5-0,6 erreicht, induzieren Proteinexpression durch Zugabe von 0,2 mM IPTG (200 µL 1 M Lager pro 1 L LB-Medium).
      Hinweis: Es ist wichtig, dass die Zellen auf die korrekte Absorption induziert werden. Normalerweise dauert es 3 bis 4 h, um dieses Stadium zu erreichen.
    9. Inkubieren Sie die Kolben beim Schütteln für 3 h bei 37 ° c Ernte der Zellen durch Zentrifugation (15 min, 4.100 x g, 4 ° C, ausschwenkbare Rotor). Verwerfen Sie den überstand. Aufschwemmen der Zelle-Pellets in 20 mL GST-Bindung Puffer (CENP-F) oder seine6-Bindung Puffer (Karyopherin α) pro 1 L Kultur. Speichern Sie die Zellen bei-80 ° C.
      1. Vorbereiten den GST-Bindung-Puffer (10 mM Tris pH 8.0 bei 25 ° C, 150 mM NaCl, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,5 mM EDTA) und seine6-Puffer (10 mM Tris pH 8.0 bei 25 ° C, 250 mM NaCl, 5 mM Imidazol pH 8,0, 5 mM β-Mercaptoethanol (BME)) im Voraus verbindlich.

3. Reinigung des rekombinanten Proteins durch Glutathion-Affinitätschromatographie und Gel Filtration

  1. Machen Sie folgende Bestände: 1 M DVB-t (1:1, 000 Lager, steril mit 0,2 µM Porengröße filtriert und entgast); 250 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF; 1:1,000 Lager in Dimethylsulfoxide). Shop bei-20 ° C. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-wechseln.
  2. Die folgenden Puffer zu machen und auf 4 ° c abkühlen
    1. Bereiten Sie den GST-Bindung Puffer mit 10 mM Tris pH 8.0 bei 25 ° C, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,5 mM EDTA.
    2. Bereiten Sie den GST-Elution Puffer mit 10 mM reduziert Glutathion (0,15 g/50 mL) in einem Puffer von 50 mM Tris pH 8.0 bei 25 ° C, 150 mM NaCl, 1 mM DTT aufgelöst. Bestätigen Sie, dass der pH-Wert des Puffers endgültige 8.0 ist und verwenden Sie am selben Tag, die, den es gemacht wurde.
    3. Bereiten Sie den Gel-Filtration-Puffer mit 20 mM Tris pH 7,5 bei 25 ° C, 60 mM NaCl, 2 mM DTT. Steril Filtern den Puffer mit einem Flaschenverschluss Filter (0,2 µM Porengröße). Entgasen Sie den Puffer unter Rühren unter Vakuum (-6 Psi) für 15 min.
    4. Fügen Sie DVB-t, alle oben genannten Puffer am Tag der Nutzung.
  3. Tauen Sie die Zellen aus Abschnitt 2, DIE CENP-F Konstrukt enthalten. Stellen Sie die Lautstärke auf 40 mL mit dem GST-Bindung-Puffer. Fügen Sie 1 mM DTT, 0,25 mM PMSF, 0,5 mM EDTA (0,5 M-Stammlösung, pH 8,0), 7 mg Benzamidine Hydrochlorid (1 mM) und 40 mg D/L Methionin.
    Hinweis: Um proteolytischen Abbau zu verringern, führen Sie alle Schritte bei 4 ° C, vorzugsweise in einem kalten Raum, sofern nicht anders angegeben. Halten Sie Zellen, Lysates und gereinigtes Proteinfraktionen auf Eis zu allen Zeiten, und fügen Sie Protease-Inhibitoren. Um Oxidation von Cystein und Methionin Rückstände zu verhindern, fügen Sie Reduktionsmitteln wie DVB-t und Methionin am Tag des Experiments. Um proteolytischen Abbau zu reduzieren, arbeiten Sie schnell durch die einzelnen Schritte.
  4. Lyse der Zellen in einem sonikator wie folgt. Ein Becherglas mit der lysate füllen und in ein Eis-Wasserbad eintauchen. Beschallen Sie die Kultur (1 min 40 s, bei 100 W (50 %) Ausgang/Amplitude, mit 10 s Impulse und 10 s Rest Zyklen). Fügen Sie 250 µM PMSF nach Beschallung. Überprüfen Sie die Zelle lysate, die sollten transparenter und nicht mehr dickflüssig sein.
  5. Klar die lysate durch Zentrifugieren bei 12.000-40.000 x g, 25 min, 4 ° C. Verwenden Sie Rundboden Zentrifuge Röhren und einem festen Winkel Rotor.
  6. Durchführen Sie Gewichtsausgleich durch Zugabe von 2 mL Glutathion Agarose 1:1 Gülle zu einem Einweg Chromatographiesäule. Die Ergebnisspalte haben ein Volumen von 1 mL. Waschen Sie die Spalte mit 25 mL Reinstwasser und 25 mL GST-Bindung Puffer.
  7. Durchzuführen Sie Bindung wie folgt. Arbeiten in einem Kühlraum oder cold-Box, Dekantieren Sie lysate aus den Pellets. Filtern der lysate (0,2 µm Porengröße) und Gießen Sie sie auf die Säule gesteckt. Verschließen Sie die Spalte und gleichzeitig sanft Nutating für 30 min bei 4 ° c inkubieren
  8. Waschen Sie die Spalte legen Sie es auf einem Gestell lassen Sie das Harz zu begleichen, und sammeln Sie die Durchströmung. Waschen Sie die Spalte zweimal mit 25 mL GST-Bindung Puffer.
  9. Eluieren Sie durch proteolytische Spaltung.
    1. Stecken Sie die Spalte. Fügen Sie 400 µL der GST-Bindung Puffer und 250 µL PS Protease (2 mg/mL Brühe mit einer Aktivität von 1.000 U/mg, entweder im Labor gereinigt oder gekauft, siehe Tabelle der Materialien hinzu).
    2. Verschließe die Spalte und sanft schwenken, um das Harz in den Puffer aufzuwirbeln. Inkubieren Sie die Spalten für 16-20 h bei 4 ° c Fügen Sie dann 4 mL GST-Bindung Puffer zu eluieren proteolytisch gespalten CENP-F-Fragment aus der Spalte.
  10. Glutathion elution
    1. Stecken Sie die Spalte fügen Sie 4 mL von GST-Elution Buffer (4 Spalte Volumen hinzu) und inkubieren Sie für 10 min in der gebundenen GST-Tag eluieren. Das Eluat zu sammeln. Die Spalten vor der Wiederverwendung zu regenerieren, wie vom Hersteller beschrieben.
  11. Analysieren der PS Protease Elution Bruch und Glutathion Elution Bruchteil von SDS-PAGE auf 16 % Acrylamid Gele. Durchführen Sie die Gele von Coomassie blau Elektrophorese mit 25 V/cm für 45 min. Fleck. Die PS Protease Bruch wird das gereinigte CENP-F-Fragment enthalten, während die Glutathion-Fraktion gespalten GST-Tags enthalten sein wird. Inspizieren Sie das Gel zur Beurteilung der Effizienz der proteolytischen Spaltung.
  12. Konzentrieren sich die PS Protease-Eluat bis 0,5 mL mit zentrifugalen Filtereinheiten mit einem Molekulargewicht von 3 kDa cutoff (siehe Tabelle der Materialien). Fügen Sie das Eluat in das obere Fach des Filters und Zentrifugieren Sie es in 10-15 min-Schritten bei 4.100 x g, 4 ° C (ausschwenkbare Rotor), die Probe zu konzentrieren. Mischen Sie, indem Sie nach jedem Schritt pipettieren.
  13. Eine geeignete gel Filtration Spalte zu verbinden (siehe Tabelle der Materialien für den Erwerb von Informationen) zu einem schnellen Protein Flüssigkeitschromatographie (FPLC) System, und mit 1 Spalte Volumen von Gel Filtration Puffer equilibrate.
  14. Zentrifugieren Sie das konzentrierte CENP-F-Fragment in einem Microcentrifuge (20 min, 21.700 x g, 4 ° C). Einlegen der Probe auf die Säule und mit 1 Spalte Volumen von Gel Filtration Puffer eluieren. 0,6 mL Fraktionen zu sammeln.
    Hinweis: Die Gel-Filtration-Puffer ist für die Kompatibilität mit dem nachfolgenden Kinase Assay optimiert. Testen Sie, ob das Zielprotein in diesen Puffer stabil ist. Wenn es nicht stabil ist, versuchen Sie, mehr Natrium-Chlorid.
  15. Analysieren Sie die Peak-Brüche durch SDS-PAGE (Schritt 3.11). Bündeln Sie die Peak-Fraktionen, die reine CENP-F-Fragmente enthalten. Die gereinigten CENP-F-Fragmente zu konzentrieren , bis 3,3 mg/mL (Schritt 3.12). Analysieren Sie die gereinigten CENP-F-Fragmente durch SDS-PAGE (Schritt 3.11).
  16. Protein-Konzentrationsbestimmung
    1. Verdünnen der Probe 1: 100 in Reinstwasser und legen Sie sie in ein Quarz Mikro-Küvette. Rekord-Spektren in einem Wellenlängenbereich von 220-300 nm in einem Spektrophotometer.
      Hinweis: Die Protein-Konzentration c (mg/mL) leitet sich aus der folgenden Gleichung:
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  17. 50 µL-Aliquots des gereinigten Proteins in 0,5 mL mikroröhrchen und Schockfrosten machen Sie in flüssigem Stickstoff. Speichern der Aliquote bei-80 ° C.

4. Reinigung des rekombinanten Proteins durch Ni-NTA Affinitätschromatographie

  1. Die folgenden Puffer zu machen und auf 4 ° c abkühlen lassen
    1. Vorbereiten der seiner6-Bindung Puffer mit 10 mM Tris pH 8.0 bei 25 ° C, 250 mM NaCl, 5 mM Imidazol pH 8,0, 5 mM BME. Alle Puffer BME am Tag der Verwendung hinzufügen.
    2. Vorbereiten der seiner6-Waschpuffer auf die gleiche Weise wie die seine6-Puffer verbindlich, aber mit 20 mM Imidazol.
    3. Vorbereiten der seiner6-Elution Buffer in der gleichen Weise wie die Bindung Puffer aber mit 150 mM Imidazol.
  2. Auftauen der Zellen aus Abschnitt 2, die die Karyopherin α enthalten konstruieren und stellen Sie die Lautstärke auf 40 mL mit seinem6 -Bindung Puffer. 5 mM BME, 0,250 mM PMSF, 7 mg Benzamidine Hydrochlorid (1 mM) und 40 mg D/L Methionin hinzufügen.
    1. Gehen Sie wie in den Schritten 3,4-3,8 mit folgenden Varianten beschrieben: Verwenden Sie seine6-Bindung Puffer anstelle von GST-Bindung Puffer für alle Schritte. Anstelle von Glutathion Agarose, verwenden die Nickel-Affinität 4 mL gel (siehe Tabelle der Materialien), um die Spalte zu bilden, die eine Spalte Volumen von 2 mL haben wird.
      Hinweis: Nickel Affinität Spalten sind nicht kompatibel mit DVB-t und EDTA. Anstelle von Nickel Affinität Gel, Ni2 +- Nitrilotriacetic Säure (NTA) Agarose eingesetzt werden, wenn die Imidazol-Konzentration in der Elution Buffer auf 250 mM erhöht wird (siehe Tabelle der Materialien).
  3. Waschen die Spalten mit seinen68 mL-Waschpuffer.
  4. Elute die Karyopherin α mit 12 mL seine6-Elution buffer und Eluat durch SDS-PAGE (Schritt 3.11) zu analysieren.
  5. Fügen Sie 250 µL Protease PS (Schritt 3,9), das Eluat und 16-20 h bei 4 ° c inkubieren In der Zwischenzeit das Eluat zweimal gegen 1 L seine6Dialyse-Bindung Puffer für 2-20 h, mit einem 6-8 kDa Molekulargewicht cutoff eine Dialysemembran.
  6. Regenerieren Sie die Nickel-Affinität-Gel-Spalte, wie vom Hersteller beschrieben. Equilibrate die Spalte mit 25 mL seine6-Bindung Puffer. Die Spalte fügen Sie der dialysierten Eiweiß hinzu und führen Sie den verbindlichen Schritt aus , wie unter Punkt 3.7 beschrieben.
  7. Die Durchströmung zu sammeln, die gereinigten Karyopherin α enthält (mit seinem6-Tag gespalten aus), und eluieren das restliche Protein mit einer zusätzlichen 4 mL seine6-Bindung Puffer. Diese Fraktionen zu bündeln. Dann die Spalten mit 12 mL seine6eluieren-Elution Puffer. Dieser Teil enthält Verunreinigungen.
  8. Analysieren der uncleaved und gespalten Karyopherin α von Schritten 4,4-4,5 und die beiden Fraktionen der Elution von diesem Schritt durch SDS-PAGE (Step 3.11), die Effizienz seiner6zu bewerten-tag-Spaltung und Reinheit.
  9. 8 mg/mL und Schockfrosten in flüssigem Stickstoff (Schritte 3.15-3.17) konzentrieren sich die Karyopherin α .

5. in-vitro- Kinase Assay mit Cdk1/Cyclin B

  1. In-vitro- Kinase assay
    Hinweis: Bei der Ankunft die Kinase, kleine aliquoten, Schockfrosten sie in flüssigem Stickstoff und speichern Sie diese bei-80 ° C. Verwenden Sie innerhalb von 6 Monaten. Während das Molekulargewicht 34 kDa für Cdk1 und 48 kDa für cyclin B, ist die scheinbare Molekulargewicht von cyclin B auf SDS-PAGE ca. 60 kDa.
    1. Bereiten Sie die 10 x PK Puffer (im Lieferumfang der Kinase) mit 0,5 M Tris-HCl, 0,1 M MgCl2, 1 mM EDTA, 20 mM DTT, 0,1 % Brij 35, pH 7,5 bei 25 ° C.
    2. 10 x ATP-Vorrat vorbereiten: eine Lösung von 4 mM ATP in 1 x PK Puffer zu machen, und überprüfen Sie die endgültigen pH-Wert des Bestands. Vermeidung von Frost-Tau-wechseln und kleine Aliquote bei-20 ° C lagern.
    3. Mix-40 µL CENP-F fragment (in einer Konzentration von 3,3 mg/mL oder 400 µM), 6 µL 10 x PK-Puffer, 3 µL Reinstwasser, 6 µL ATP 10 X Lager und 5 µL menschlichen Cdk1/cyclin B (1 µg, 100 U) in eine 0,5 mL reaktionscup.
      Hinweis: Die CENP-F-Fragment hat eine molare Masse von 8,6 kDa und vier Cdk1-spezifische Phosphorylierung Sites. Für ein neues Substrat Einstellen der Kinase-Konzentration in der Probe nach der molaren Konzentration des Proteins und die Anzahl der Phosphorylierung Websites. Die Tätigkeit der menschlichen rekombinante Cdk1/cyclin B-Ware ist 20.000 U/mL, und die spezifische Aktivität liegt bei 1.000.000 U / mg. 1 U ist definiert als die Menge an Cdk1/cyclin B erforderlich, um die Übertragung von 1 Pmol von Phosphat an Cdk1 Peptid Substrat PKTPKKAKKL-NH2 katalysieren (50 µM) in 1 min bei 30 ° C (siehe Tabelle der Materialien).
    4. Bereiten Sie eine Kontrollreaktion ohne Cdk1/cyclin B. Incubate Reaktionen in einem Wasserbad für 1-16 h bei 30 ° C.
  2. 2.5 µL der Kinase Assay Reaktion zu analysieren und 2,5 µL des Steuerelements durch SDS-PAGE (Step 3.11), Verwendung eines Gels mit 16 % Acrylamid. Um die Auflösung zu erhöhen, die Laufzeit zu verlängern.
  3. Fügen Sie ein gleiches Volumen 6 M Guanidin-Hydrochlorid-Lösung der verbleibenden Kinase Assay Reaktion (und an die Steuerung). Die endgültige Guanidin-Hydrochlorid-Konzentration werden 3 M. analysieren diese Proben durch Massenspektrometrie (Kap. 6) identifizieren Phosphorylierung oder eine Massenspektrometrie-Anlage zur Analyse der Proben schicken und dann ausführen Überprüfung () Funktion (Siehe Abschnitt 7).
    Hinweis: Für die anschließende Massenspektrometrie-Analyse ist es sehr wichtig, dass die Phosphorylierung Effizienz der einzelnen Seiten ist so hoch wie möglich, vorzugsweise 100 %, da sonst die Phosphorylierung Websites können nicht zugeordnet werden. Stark Phosphorylierung Effizienz, größere Mengen an Cdk1/cyclin B hinzufügen und die Inkubationszeit bis 16 h zu erhöhen. Die Konzentration von ATP kann auch verdoppelt werden.
  4. Für die Problembehandlung durchführen eines in-vitro- Kinase Assays CENP-f (Rückstände 2.987 3.065) als Positivkontrolle. Verwenden Sie frische Chargen des Cdk1/cyclin B mit hohen Aktivitäten.

6. Bestimmung der Cdk1-spezifische Phosphorylierung Standorte durch Massenspektrometrie

  1. Führen Sie zu denaturieren und die Proteinproben Entsalzen, Microbore umgekehrter Phase Flüssigchromatographie mit einer PLRP300-Spalte.
  2. Um die Anzahl der Phosphorylierung Standorte im CENP-F Fragment zu erhalten, analysieren Sie die intakt in Vitro phosphoryliert CENP-F 84-Mer durch Electrospray Ionisierung Ionenfallen Massenspektrometrie (ESI-ITMS)44,45.
  3. Zur Beurteilung der Phosphoamino sauren Standort des CENP-F phosphoryliert bereiten die Trypsin verdaut , des in-vitro- Proteinproben CENP-F. Entsalzen Sie die Trypsin verdaut mit pipettieren Tipps Entsalzung.
  4. Analysieren Sie die Folgen Übersichten der CENP-F durch Electrospray Ionisierung Fourier transformieren Ion Cyclotron Resonance Massenspektrometrie (MS ESI-FTICR). Führen Sie Analysen auf eine ESI-FTICR Massenspektrometer mit einer Ansammlung von 169 µs.
    Hinweis: Die Genauigkeit der Massen von ESI-FTICR MS bestimmt ist innerhalb von 0,005 amu. Um das Verhältnis der einzelnen phosphorylierten Arten jeweils auf die Gesamt-Protein-Menge zu quantifizieren, bestimmen Sie die Peak-Höhen von der Massenspektren.

7. funktionale Verifikation: Prüfung der Auswirkungen von Phosphomimetic Mutationen auf Protein-Protein-Wechselwirkungen durch analytische Größe Ausgrenzung Chromatographie

Hinweis: für die funktionelle Überprüfung der identifizierten Cdk1-spezifische Phosphorylierung Websites, Phosphomimetic Mutanten CENP-F Fragmente entstanden , indem die identifizierten Phosphorylierung Standorte mit Aspartates. Die negative Ladung der Aspartate ahmt die Wirkung von Phosphorylierung. Eine S3048D Mutante des Fragments CENP-F (Rückstände 2.987 3.065) entstand.

  1. Für funktionale Verifikation die Bindung von Wildtyp vergleichen und CENP-F Phosphomimetic Fragmente Karyopherin α. verwenden Sie eine analytische Gel Filtration als verbindliche Assay. Für die analytische Gel Filtration CENP-F-Fragmente durch Glutathion-Affinitätschromatographie (Schritte 3.1-3.12) zu reinigen und den Gel Filtrationsschritt überspringen.
  2. Das Protein 5-6 mg/mL zu konzentrieren. Schockfrosten Sie Protein Aliquots in flüssigem Stickstoff (Schritte 3.15-3.17).
  3. Mix der gereinigten CENP-F-Fragmente (0,1 mg Wildtyp oder die S3048D Variante) und gereinigt Karyopherin α (0,7 mg) in einem Molverhältnis von 1:1. Die Probe-Lautstärke zu 200 µL mit Gel Filtration Puffer. Inkubation der Probe für 30 min auf Eis, Filtern Probe (0,2 µm Porengröße) und deaktivieren Sie die Probe durch Zentrifugieren (25 min, 21.700 x g, 4 ° C)
  4. Trennen Sie die Probe durch Größe Ausgrenzung Chromatographie (Schritte 3.13-3.14). Verwenden Sie einen Gel Filtration Puffer bestehend aus 20 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, und 2 mM DTT. Durchführen Sie die analytische Gel Filtration Experimente unter identischen Bedingungen für alle Proben.
  5. Die analytische Gel Filtration Spalte mit Molekulargewicht Standards bekannter Molmasse zu kalibrieren, wie vom Hersteller beschrieben.
  6. Analysieren der Elution Fraktionen um 16 % SDS-PAGE (Schritt 3.11).

Ergebnisse

Wir haben vor kurzem einen in-vitro- Kinase Assay (Abbildung 1) verwendet, um Cdk1-spezifische Phosphorylierung Seiten in einem Fragment CENP-F zu ermitteln, die ein cNLS10enthalten. Dieses Signal verleiht nuklearen Lokalisierung von CENP-F während des größten Teils der Interphase. In der G2-Phase ist CENP-F aus dem Zellkern in das Zytosol in gewissem Sinne Cdk1-abhängige exportiert. Mechanistische Einblicke, wie Cdk1 rege...

Diskussion

Unsere in-vitro- Kinase Assay ist eine sehr leistungsfähige Methode zur Identifizierung von molekularer Zielstrukturen für die Kinase Cdk1, die eine übergeordnete Steuerung des Zellzyklus und reguliert viele wichtige zelluläre Prozesse. Die Methode bestimmt, ob ein gereinigtes Protein ein Substrat für Cdk1 ist und ermöglicht die Identifizierung von spezifischen Phosphorylierung Websites. Dies erleichtert die mechanistische Studien zur Regulation zellulärer Prozesse durch Phosphorylierung durch Cdk1.

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken Dr. David King, Howard Hughes Medical Institute, University of California in Berkeley für Massenspektrometrie Analyse und hilfreichen Kommentare. Wir danken Dr. Xuelian Zhu Shanghai Institutes for Biological Sciences, chinesische Akademie von Wissenschaften, Shanghai, China für die Bereitstellung eines Full-Length CENP-F-Konstrukt. Zu guter Letzt danken wir Dr. Susan Bane, Dr. Brian Callahan und Dr. Christof Grewer an der Binghamton University für den Zugriff auf Geräte. Diese Forschung wurde von der Forschungsgemeinschaft für die State University of New York und der Fakultät für Chemie, State University of New York at Binghamton finanziert.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2800 ml baffled Fernbach flaskCorning44232XL
ampicillinGold BiotechnologyA-301-25
ATPFisher ScientfiicBP413-25
benzamidine hydrochlorideMillipore SigmaB6506-25
bottletop filterCorning431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mLNew England BiolabsP6020
Cdk1/cyclin B (alternate source)EMD Millipore14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source)InvitrogenPV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK bufferNew England BiolabsP6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmidAvailable upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotorThermo Scientific10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranesEMD MilliporeUFC900324
chlorampenicolGold BiotechnologyC-105-100
D/L methionineAgros Organics / Fisher125650010
desalting pipet tips: Zip tipsMillipore SigmaZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cmBiorad7321010
dithiothreitolGold BiotechnologyDTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strainEMD Millipore71403
electrospray ionization Fourier transform ionBruker AmazonApex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometerBruker Amazoncustom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cyThermo Scientific97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLCGE Healthcare29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare28990944
glutathione agarosePierce16101
glutathione, reducedMillipore SigmaG4251-50g
incubation shaker: multitron shakerInforsI10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosideGold BiotechnologyI2481C50
kanamycinGold BiotechnologyK-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmidAvailable upon request.
Luria Bertani mediumFisher ScientfiicBP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigeratedEppendorf5401000013
microtubes (0.5 ml)Eppendorf30121023
microtubes (1.5 ml)Eppendorf30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gelMillipore SigmaP6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmidMillipore SigmaGE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluorideGold BiotechnologyP470-10
PS protease: PreScission proteaseGE Healthcare27084301
Phos-tag acrylamideWako Pure Chem. Ind.304-93521
reduced gluthathioneMillipore SigmaG4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)Fisher Scientfiic055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange LightningAgilent210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifierBranson15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)Spectrum Labs08 670B
swing out rotor TX-1000Thermo Scientific10033-778

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