Aufzeichnung von räumlich eingeschränkt Schwingungen im Hippocampus Verhalten der Mäuse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Aufzeichnung des lokalen Feldes Potentiale mit Multi-Schaft, die lineare Silicon-Sonden. Umwandlung der Signale mit Hilfe der aktuellen Quelle dichteanalyse ermöglicht die Rekonstruktion der lokalen elektrischen Aktivität im Hippocampus Maus. Mit dieser Technik können räumlich begrenzten Gehirn Schwingungen frei beweglichen Mäusen untersucht werden.

Zusammenfassung

Das lokale Feld-Potenzial (LFP) ergibt sich aus Ionen-Bewegungen über neuronalen Membranen. Da die Spannung von LFP-Elektroden erfasst das summierte elektrische Feld eine große Menge von Hirngewebe widerspiegelt, ist die Gewinnung von Informationen über lokale Aktivitäten eine Herausforderung. Studium der neuronale Mikroschaltungen, erfordert jedoch eine sichere Unterscheidung zwischen wirklich lokale Veranstaltungen und Volumen durchgeführt Signale mit Ursprung in fernen Hirnregionen. Aktuelle Quelle Dichte (CSD) Analyse bietet eine Lösung für dieses Problem durch die Bereitstellung von Informationen über aktuelle Senke und Quelle in der Nähe der Elektroden. In Hirnarealen mit laminarer Cytoarchitecture wie Hippocampus erhalten Sie eindimensionale CSD durch Schätzung der zweiten räumliche Ableitung von der LFP. Hier beschreiben wir eine Methode zur Aufzeichnung Multilaminar drängendere mit linearen Silizium-Sonden in den dorsalen Hippocampus implantiert. CSD-Spuren werden auf einzelne Ableger der Sonde berechnet. Dieses Protokoll beschreibt somit ein Verfahren um räumlich begrenzten neuronalen Netzes Schwingungen im Hippocampus von frei beweglichen Mäuse zu beheben.

Einleitung

Schwingungen in die LFP engagieren sich kritisch in Informationsverarbeitung durch neuronale Schaltkreise. Sie decken ein breites Spektrum an Frequenzen, von langsamen Wellen (~ 1 Hz) bis hin zu schnellen Wellen Schwingungen (~ 200 Hz)¹. Unterschiedliche Frequenzbänder sind verbunden mit kognitiven Funktionen, einschließlich Gedächtnis, emotionale Verarbeitung und Navigation^2,3,4,5,6,7. Stromfluss über neuronalen Membranen bildet den größten Teil des LFP Signal⁸. Kationen in der Zelle (z.B. durch Aktivierung der erregenden glutamatergen Synapsen) stellen eine aktive Stromsenke (da kostenlos das extrazelluläre Medium verlässt). Im Gegensatz dazu zeigt net Fluss der positiven Ladung auf das extrazelluläre Medium, z. B. durch Aktivierung des Gabaergen hemmenden Synapsen, eine aktive Stromquelle an dieser Stelle. In neuronalen Dipole sind Stromsenken mit passiven Quellen gepaart, aufgrund der Strömungen beeinflussen Membran kostenlos an entfernten Standorten zu kompensieren.

Das elektrische Feld durch neuronale Remoteprozessen produziert auch beträchtliche Spannung Durchbiegungen auf einer Aufnahme Elektrode führen kann und somit fälschlicherweise als ein lokales Ereignis angesehen werden könnte. Dieses Volumen-Leitung stellt eine ernste Herausforderung für die Interpretation der LFP-Signale. CSD-Analyse gibt Auskunft über lokale Stromsenken und Quellen zugrunde liegenden LFP signalisiert und umfasst daher ein Mittel zur Verringerung der Auswirkungen der Band Leitung⁸. In laminierte Strukturen wie der Hippocampus erhalten Sie durch die zweite räumliche Ableitung von der LFP, aufgenommen von Äquidistanten Elektroden angeordnet senkrecht bis laminar Flugzeuge⁹eindimensionale CSD-Signale. Das Aufkommen von im Handel erhältlichen linearen Silizium Sonden ermöglichte Forscher, die CSD-Methode für das Studium der lokalen Schwingung Aktivität im Hippocampus zu nutzen. Beispielsweise wurde nachgewiesen, dass unterschiedliche Gamma Schwingungen in eine Schicht-spezifisch in die CA1 Bereich¹⁰entstehen. Darüber hinaus hat CSD Analyse unabhängige Hot Spots der Gamma-Aktivität in den wichtigsten Zellschicht der dentate Gyrus¹¹identifiziert. Wichtig ist, waren diese Ergebnisse nur in lokalen CSD aber nicht im LFP-Signale erkennbar. CSD-Analyse liefert somit ein mächtiges Werkzeug um Einblick in die batteriegestützte Operationen des Hippocampus.

In diesem Protokoll bieten wir einen umfassenden Leitfaden um eindimensionale CSD-Signale mit Silizium-Sonden zu erhalten. Diese Methoden ermöglichen Benutzern, lokalisierte Oszillation Ereignisse im Hippocampus von Mäusen, Verhalten zu untersuchen.

Protokoll

Alle Methoden, bei denen lebende Tiere sind durch das Regierungspräsidium Freiburg im Einklang mit dem deutschen Tierschutzgesetz genehmigt worden.

1. Vorbereitungen

1. Entwerfen Sie und erstellen Sie eine entsprechende einsatzwerkzeug vorübergehend tragen die Silizium-Sonde und der Elektrode Stecker während des Prozesses der Implantation. Siehe Abbildung 1 für ein Beispiel benutzerdefinierte gebaute einsatzwerkzeug.
2. Lösen Sie vorsichtig die Silizium Sonde und Elektrode Connector aus der Verpackung mit Keramik Spitzen Pinzette.
3. Heben Sie die Anschlussplatine und sicher befestigen Sie es mit einem Krokodil-Klemme an einem Ständer befestigt.
4. Verwenden ein Stereoskop, richten Sie die Sonde mit dem Einsetzwerkzeug mit Keramik-bestückte Zangen. ~ 2 mm Auftragen von Paraffinwachs geschmolzen mit einer linken, die Sonde auf das einsatzwerkzeug zu kleben. Achten Sie darauf, nicht um die Sonde Shanks während dieses Vorgangs zu berühren.
5. Fixieren Sie die Elektrode-Connector an der Welle das einsatzwerkzeug mit standard Klebeband. Beachten Sie, dass je nach Hersteller, Massekabel müssen die Anschlussplatine Elektrode vor der Implantation verlötet werden könnte. Entfernen Sie die Isolierung von zwei kurze Stücke von Lack-isolierten Kupferdraht mit Lötzinn mit einem Lötkolben (400 ° C) angewendet. Löten Sie das Massekabel an die entsprechenden Schlitze in der Elektrode Anschlussplatine.
6. Entfernen Sie die Isolierung von zwei zusätzliche Stücke des kupfernen Drahtes. Wickeln Sie jeden blanken Kupferdraht dreimal um eine Edelstahlschraube (1 mm Durchmesser, 2 mm Länge). Gelten Sie Flussmittel zum Löten von Stahl geeignet und Löten Sie den Kupferdraht an der Unterseite des Schraubverschlusses. Stellen Sie sicher, dass die untere Hälfte des Schraubengewindes bleibt von Zinn frei.
7. Verwenden Sie ein standard-Multimeter für elektrische Kontaktierung zwischen Draht und Schrauben zu überprüfen.
8. Desinfizieren Sie die Schäfte der Silizium-Sonde und den Boden Schrauben durch Eintauchen in 70 % igem Ethanol (10 s).
9. Bereiten Sie eine Schutzhülle für das Implantat Sonde durch den Kopf eines Kunststoffs Pasteurpipette in zwei Hälften schneiden.

2. Implantation Operation

1. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente (Schere, feine Spitze Pinzetten, chirurgische Klemmen) mit einem heißen Perle Sterilisator. Wischen Sie alle Oberflächen mit 70 % Ethanol.
2. Anästhesie mit Isofluran 3 % Sauerstoff geliefert bei ~ 1 L/min zu induzieren.
   1. Verwenden Sie für die Wartung 1-1,5 % Isofluran. Beachten Sie, dass die Isofluran-Konzentration erforderlich, um chirurgische Toleranz zu erreichen von Tier zu Tier unterschiedlich sein kann.
   2. Stabile chirurgische Toleranz wird erreicht, wenn das Tier reagiert nicht auf Zeh kneifen. Die Atemfrequenz der Maus zu überwachen und ggf. die Konzentration von Isofluran.
   3. Wenden Sie Salbe auf das Tier Augen Austrocknen zu verhindern.
3. Montieren Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen durch sanft Ohr Bars in den Gehörgang einführen. Sobald der Kopf der Maus durch die Ohr-Balken stabilisiert wird, platzieren Sie ein Mundstück über die Schnauze für kontinuierliche Isofluran Lieferung. Platzieren Sie den Mauszeiger über ein Heizkissen auf Handtuch oder Pad und Buprenorphin subkutan zu injizieren (0,05 - 0,1 mg/kg Körpergewicht) um postoperative Analgesie zu gewährleisten.
4. Rasieren Sie den Kopf mit einem standard Rasierer zu und Desinfizieren Sie die Haut mit 70 % Ethanol. Chirurgische Scheren, einen Einschnitt in die Haut entlang der Mittellinie des Schädels und die Haut mit chirurgischen Klammern öffnen.
5. Richten Sie den Kopf des Tieres mit Hilfe von einer stereotaktischen Alignment-Tool zur Ebene Bregma und Lambda. Es sollte weniger als 50 µm Höhenversatz zwischen Bregma und Lambda. Darüber hinaus definiert Ebene, die den Kopf entlang der Mediolateral Achse durch Messung der Tiefe von Bregma am Schädel an der Oberfläche Abstände Links und rechts (z. B. 1 mm Links und rechts der Bregma). Stellen Sie die Neigung des Kopfes, bei Bedarf.
6. Reinigen Sie den Kopf mit 3 % Wasserstoffperoxid und mit sterilen Baumwolle Tücher wischen Sie trocken.
7. Bestimmen Sie den Speicherort der die Kraniotomie relativ Bregma mit einer entsprechenden stereotaktischen Atlas¹².
8. Bohren Sie mit einem 0,9 mm Bohrkopf, zwei Schraubenlöcher in den Knochen über das Kleinhirn, Boden und Referenz Schrauben zu platzieren. Darüber hinaus sind 1-3 Löcher für Verankerung Schrauben wünschenswert, das Implantat zu stabilisieren. Die Lage des Ankerschrauben richtet sich nach den Speicherort der die Kraniotomie. Platzieren Sie für die Implantation in Hippocampus Ankerschrauben über kontralateralen parietalen und ipsilateral frontalen Kortex. Stecken Sie die Schrauben in den Knochen mit einem geeigneten Schraubendreher. Achten Sie darauf, nicht in das Gehirn eindringen.
9. Durchführen Sie die Kraniotomie durch langsam Ausdünnung des Schädels mit dem Bohrer in einem rechteckigen Bereich um die Implantation Seite. Befeuchten Sie häufig die Knochen mit steriler Phosphatpuffer (PB). Die verbleibenden ausgedünnte Schädel kann sanft durchbohrt und mit Hilfe einer feinen (27G) Injektionsnadel und Pinzette entfernt.
10. Die Dura Mater sorgfältig mit einer dünnen Injektionsnadel (27G) durchstoßen. Bilden Sie einen kleinen Haken durch die Spitze der Nadel mit einer Pinzette biegen und ziehen Sie die Dura für die Entfernung. Gelten Sie PB um die Gehirn-Oberfläche Austrocknen verhindert wird.
11. Das einsatzwerkzeug Elektrode auf einem stereotaktischen Halter montieren, NULL die Sonde am Bregma, und bewegen Sie die Sonde in der stereotaktischen Koordinaten über die Kraniotomie. Dringen Sie langsam in die Oberfläche des Gehirns. Stellen Sie sicher, dass die Sonde Wellen nicht biegen. Implantation durch Blutgefäße zu vermeiden.
12. Senken Sie langsam die Sonde bis ~ 200 µm über die gewünschte Tiefe. Decken Sie die Kraniotomie und Ableger der Silizium-Sonde mit sterilisierter Vaseline für Schutz. Wenden Sie dental Zement um die Basis der Sonde auf die Verankerung Schraube in den Schädel zu beheben.
13. Gerade nach dem Zement auftragen, langsam bewegen der Sonde auf die Solltiefe. Voran die letzten ~ 200 µm nach Anwendung des Zements seitliche Bewegung der Sonde reduziert und sorgt für minimalen Gewebeschädigung im Zielgebiet. Beachten Sie, dass die Aushärtezeit des Zements verwendet diesen Schritt des Protokolls auswirken kann. Überspringen Sie mit schnell heilen Zement diesen Schritt und Implantat direkt die Sonde die Zieltiefe zur Vermeidung von Schäden an der Silizium-Sonde.
14. Nachdem der Zement ausgehärtet ist, lassen Sie die Sonde aus dem Einsetzwerkzeug durch Schmelzen des Wachses mit einem linken.
15. Lassen Sie die Anschlussplatine vom Gerät einfügen und positionieren Sie es an einem geeigneten Ort auf den Schädel mit einem Krokodil Klemme an der Einfügemarke Griff befestigt. Im Falle einer Sonde Implantation in den Hippocampus setzen Sie die Connector-Platine am kontralateralen Parietal Knochen. Befestigen Sie die Anschlussplatine an den Schädel mit dental Zement.
16. Löten Sie Boden und Referenz Drähten Connector Board an den Seilen über das Kleinhirn, die zwei Schrauben befestigt.
17. Schneiden Sie die Schutzabdeckung auf die richtige Höhe und legen Sie es über die Silizium-Sonde. Befestigen Sie die Abdeckung auf der Anschlussplatine und Schädel mit dental Zement, die Haut um den exponierten Schädel zu vermeiden. Nähen die Haut um den Implantationsort ist in der Regel nicht erforderlich.

3. Erholung nach der Operation

1. Wenden Sie geeignete schmerzstillende Behandlung für mindestens 2 Tage (z. B. subkutane Injektionen von Buprenorphin alle 6 h tagsüber und im Trinkwasser über Nacht mit Carprofen (4-5 mg/kg Körpergewicht) subkutan alle 24 h kombiniert). Single-Gehäuse wird empfohlen, um Schäden an das Implantat.
2. Mindestens eine Woche für die Wiederherstellung zu ermöglichen. Wenden Sie sich an lokalen Tierschutzrichtlinien.

4. Datenerfassung

1. Rekord drängendere von frei beweglichen Mäuse verwenden ein passende Datenerfassungssystem, verbunden durch einen Kommutator. Drängendere erwerben, verwenden Sie eine Abtastfrequenz von 1 bis 5 kHz. Höhere Abtastraten (20-30 kHz) sind erforderlich, wenn Monoblock-Entladungen sind zusammen mit der LFP aufgezeichnet werden.
2. Speichern Sie raw-Aufnahme-Dateien der einzelnen Kanäle für offline-Analyse.

5. Histologie

1. Nach Abschluss der Aufnahme tief betäuben des Tieres (z.B. 2 g/kg Körper Gewicht Urethan injiziert intraperitoneal). Bestätigen Sie die Narkose Zustand durch mangelnde Reaktion bis zu den Zehen kneifen.
2. Durchspülen Sie die Maus-Transcardially mit eiskalten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (~ 1 min) gefolgt von 4 % Paraformaldehyd (~ 10 min) mit standard Intracardial Perfusion Methoden¹³. Vor Perfusion, elektrolytische schädigendes der Aufnahme Websites möglicherweise durch durchgeführt (z. B. durch die Anwendung von 10-20 V der Konstante Spannung für bis zu 1 s). Alternativ Fluoreszenzfarbstoffen auf den Schaft Tipps angewendet, bevor Implantation verwendet werden kann, um Identifikation zu verfolgen. Testen die verschiedenen Methoden zur Identifizierung von Elektrodenpositionen, optimale Ergebnisse mit verschiedenen Arten von Silizium-Sonden zu erzielen wird empfohlen.
3. Schneiden Sie Gehirn-Abschnitte (~ 100 µm) und Färben Sie die Scheiben mit 4'-6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 1 µg/mL) gefolgt von drei Waschschritten in PB (jede 10 min bei Raumtemperatur).
4. Die Abschnitte auf einen Objektträger zu platzieren, geben Sie einen Tropfen der Einbettung von Medium und Abdeckprofil mit einem Deckglas. Lassen Sie die einbettende mittlere über Nacht trocknen bei Raumtemperatur.
5. Mit einem Epifluoreszenz oder konfokale Laserscanning-Mikroskop, den Standort der Aufnahme Websites identifizieren.
6. Zur Wiederherstellung der Silizium-Sonde für die weitere Verwendung zu versuchen, halten Sie die Sonde mit einem Krokodil-Klemme und lassen Sie die Sonde aus dem Schädel durch sorgfältig Schmelzen des dental Zements mit einem Lötkolben (400 ° C). Achten Sie darauf, nicht um die Sonde Shanks während dieses Vorgangs zu berühren!
7. Waschen Sie die Sonde in heißes destilliertes Wasser (~ 80 ° C, 15 min), gefolgt von enzymatischen Lösung (1 % Tergazyme in destilliertem Wasser, 30 min bei Raumtemperatur) und ein weiteres waschen Schritt in destilliertem Wasser (15 min). Beachten Sie, dass die Erfolgsquote bei der Sonde Wiederherstellung niedrig ist.

6. CSD-Analyse

1. Mit Hilfe einer geeigneten Analyseumgebung (z.B. Python), konvertieren LFP Daten von einer einzelnen Schaft zum CSD durch Annäherung an die zweite räumliche Ableitung entlang des Schafts als
   
   wo LFP_{n, t} ist die LFP-Signal auf die n-^th -Elektrode zum Zeitpunkt t und ΔZ ist der Abstand zwischen Elektrode. Beachten Sie, dass aufgrund der n-1 und n+ 1-Operationen, der CSD der ersten und letzten Elektroden des Schaftes abgeschätzt werden kann, die unter Berücksichtigung während der Platzierung der Sonde werden muss. Implementieren der Näherungsformel mit ein kurzes Segment des Codes, die das CSD-Signal für jede Elektrode während der Iteration über Zeit (siehe ergänzende Codedatei) berechnet.
2. Verwenden Sie die erhaltenen CSD-Signal für weitere Analysen (z. B. Studium bestimmte Frequenzbänder des Gehirns Schwingungen durch Anwendung der Bandpass-Filter).

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt das einsatzwerkzeug für die Implantation von Silizium-Sonden verwendet. Aufnahmen von chronisch implantierten Silizium-Sonden Ausrichtung der CA1-Region und das Granulat Zellschicht von dentate Gyrus sind in Abbildung 2dargestellt. Während der freien Bewegung in der Homecage verzeichneten wir drängendere aus der Sonde-Ableger. Um die Wirkung der Lautstärke Wärmeleitung zu minimieren, wurden die erhaltenen S...

Diskussion

Zunehmende Beweise zeigen, dass Gehirn Schwingungen in hippocampal neuronalen Schaltkreisen in diskreten räumlichen Bereichen^10,11,16auftreten. CSD-Analyse reduziert drastisch den Einfluss der Lautstärke Wärmeleitung, eine entscheidende Voraussetzung für das Studium der lokalen Schwingung Veranstaltungen. Mit diesem Video stellen wir eine Anleitung zur Maus Hippocampus für die Analyse von CSD Daten Silizium Sonden implantie...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crocodile clamp with stand	Reichelt Elektronik	HALTER ZD-10D
Silicon probe	Cambridge Neurotech	P-series 32
Stereoscope	Olympus	SZ51
Varnish-insulated copper wire	Bürklin Elektronik	89 F 232
Ground screws	Screws & More GmbH (screwsandmore.de)	DIN 84 A2 M1x2
Flux	Stannol	114018
Ceramic-tipped forceps	Fine Science Tools	11210-60
Paraffine Wax	Sigma-Aldrich	327204
Cauterizer	Fine Science Tools	18010-00
Soldering iron	Kurtz Ersa	OIC1300
Multimeter	Uni-T	UT61C
Ethanol	Carl Roth	9065.1
Pasteur pipettes	Carl Roth	EA65.1
Heat sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Stereotaxic frame	David Kopf	Model 1900
Stereotaxic electrode holder	David Kopf	Model 1900
Isoflurane	Abbvie	B506
Oxygen concentrator	Respironix	1020007
Buprenorphine	Indivior UK Limited
Electrical shaver	Tondeo	Eco-XS
Heating pad	Thermolux	463265/-67
Surgical clamps	Fine Science Tools	18050-28
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H1009
Sterile cotton wipes	Carl Roth	EH12.1
Drill	Proxxon	Micromot 230/E
21G injection needle	B. Braun	4657527
Phosphate buffer/phosphate buffered saline
Stereotaxic atlas	Elsevier	9.78012E+12
Surgical scissors	Fine Science Tools	14094-11
Surgical forceps	Fine Science Tools	11272-40
27G injection needles	B. Braun	4657705
Vaseline
Dental cement	Sun Medical	SuperBond T&M
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50mg/ml
Recording amplifier	Intan Technologies	C3323
USB acquisition board	Intan Technologies	C3004
Recording cables	Intan Technologies	C3216
Electrical commutator	Doric lenses	HRJ-OE_FC_12_HARW
Acquisition software	OpenEphys (www.open-ephys.org)	GUI	allows platform-independent data acquisition
Computer for data acquisition
Analysis environment	Python (www.python.org)		allows platform-independent data analysis
Urethane	Sigma-Aldrich
Vibratome	Leica	VT1000
Microscope slides	Carl Roth	H868.1
Cover slips	Carl Roth	H878.2
Embedding medium	Sigma-Aldrich	81381-50G
Distilled water	Millipore	Milli Q	Table-top machine for the production of distilled water
Tergazyme	Alconox	Tergazyme