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Erratum Notice

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Zusammenfassung

O9-1 ist eine Zell-Linie multipotent Maus Neuralleiste. Hier beschreiben wir detaillierte Schritt für Schritt Protokolle für die Kultivierung O9-1-Zellen, O9-1-Zellen in bestimmten Zelltypen differenzieren und genetisch manipuliert O9-1-Zellen mit SiRNA-vermittelten Zuschlag oder CRISPR-Cas9 Genom-Bearbeitung.

Zusammenfassung

Zellen der Neuralleiste (NCCs) migrieren multipotenten Stammzellen, die in verschiedene Zelltypen differenzieren und mehrere Gewebe und Organe entstehen können. Die Zellinie O9-1 ergibt sich aus der endogenen Maus embryonalen NCCs und behält seine Multipotenz. Jedoch unter bestimmten Kulturbedingungen O9-1-Zellen können in verschiedene Zelltypen differenzieren und in einer Vielzahl von Anwendungen in der Forschung eingesetzt werden. Vor kurzem, haben mit der Kombination aus Maus und O9-1 Zelle Studien, wir gezeigt, dass das Nilpferd Weg Effektoren Signaltechnik, Yap und Taz in der Neuralleiste stammenden kraniofazialen Entwicklung eine wichtige Rolle spielen. Obwohl die Kultivierung Prozess für O9-1 Zellen komplizierter als bei anderen Zelllinien, ist O9-1-Zell-Linie ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung von NCCs in Vitro. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Kultivierung der O9-1-Zell-Linie um seine Stemness sowie Protokolle zur Differenzierung von O9-1-Zellen in verschiedene Zelltypen, wie glatten Muskelzellen und Osteoblasten zu erhalten. Darüber hinaus werden Protokolle beschrieben, für die Durchführung von Gen Verlustfunktion-Studien in O9-1-Zellen mithilfe von CRISPR-Cas9 löschen und kleine interferierende RNA-vermittelte Zuschlag.

Einleitung

Neuralleiste (NCCs) multipotenten Stammzellen-ähnliche Zellen sind mit einem bemerkenswerten wandernden Fähigkeit und vorübergehende Existenz während der Embryonalentwicklung. NCCs entstehen zwischen der Oberfläche Ektoderm und das Neuralrohr und Migrieren auf andere Teile des Embryos während der embryonalen Entwicklung1. Basierend auf ihrer Funktionsbereiche, können in mehrere verschiedene Arten, einschließlich kranialen, Stamm, vagalen, Sakral, und kardiale NCCs NCCs eingestuft werden. Darüber hinaus können NCCs in mehrere Linien der Zelle, wie glatten Muskelzellen, Knochenzellen und Neuronen, differenzieren und geben Anlass zu verschiedenen Geweben2,3. Die Entwicklung der NCCs zeichnet sich durch eine komplexe Reihe von morphogenetischen Ereignisse, die durch verschiedene Molekulare Signale abgestimmt sind. Angesichts der komplexen Regulation der NCCs und ihre wichtigen Beiträge zu zahlreichen Strukturen, kann die Dysregulation des NCC Entwicklung häufig zu angeborenen Missbildungen, welches Konto für fast 30 % aller menschlichen angeborenen Missbildungen führen. Anomalien bei der Neuralleiste Entwicklung führen zu gespaltenen Lippe/Gaumen, fehlerhaft Nase Bildung, Syndrome, Mängel wie defekte kardiale Ausflusstrakt oder sogar die Kindersterblichkeit1,4,5, 6 , 7. Verständnis der molekularen Mechanismen des NCC Entwicklung ist wichtig für die Entwicklung von Therapien für Krankheiten, die durch Mängel im NCC-Entwicklung. Mit der Einsatz von verschiedenen in Vitro und in Vivo nähert sich8,9,10,11,12,13,14 ,15, erhebliche Fortschritte in der NCC-Forschung. In Vivo, Tiermodelle, darunter Hühner, Amphibien, Zebrafisch und Mäusen wurden verwendet, um NCCs1zu untersuchen. Darüber hinaus wurden menschliche Embryonen eingesetzt, um den Prozess der NCC-Migration in der frühen menschlichen Embryo Entwicklung16zu studieren. In-Vitrozellmodelle für NCCs, wie menschliche NCCs aus der Patienten subkutanen Fettgewebes, wurden verwendet, um die Parkinson-Krankheit17untersuchen. Die O9-1 NCC-Linie, die ursprünglich von massenkulturen des endogenen NCCs isoliert vom E8.5 Maus Embryonen18abgeleitet wurde, ist eine leistungsstarke zellenmodell für das Studium NCCs. vor allem unter Kulturbedingungen nicht zu unterscheiden, O9-1-Zellen sind multipotente Stammzellen-ähnliche NCCs. Allerdings können unter unterschiedlichen Kulturbedingungen O9-1-Zellen in angesehenen Zelltypen, wie z. B. die glatten Muskelzellen, Osteoblasten und Chondrozyten Gliazellen18unterschieden werden. Diese Eigenschaften gegeben, wurden O9-1-Zellen im großen und ganzen für NCC-bezogene Studien, wie z.B. untersuchen die molekulare Mechanismen der kranialen Gesichtsbehandlung Mängel19,20eingesetzt.

Hier ausführliche Protokolle sind zur Verfügung gestellt für die Aufrechterhaltung O9-1-Zellen, O9-1-Zellen in verschiedene Zelltypen differenzieren und O9-1-Zellen zu manipulieren, indem Sie gen Verlustfunktion-Studien mit CRISPR-Cas9 Genom-Bearbeitung und kleine interferierende RNA (SiRNA) durchführen- Knockdown Technologien vermittelt. Als ein repräsentatives Beispiel bezeichnet man die Verwendung von O9-1-Zellen, Yap und Taz Verlustfunktion zu studieren. Yap und Taz sind die nachgelagerten Effektoren das Nilpferd Signalweg, der spielt eine entscheidende Rolle in der Zell-Proliferation, Differenzierung und Apoptose. Der Hippo-Weg wurde auch gezeigt, wichtig in der Entwicklung und Homöostase von mehreren verschiedenen Geweben und Organen sowie in der Pathogenese der verschiedenen Krankheiten20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Die Kernkomponenten von Hippo-Signalisierung gehören Tumorsuppressor steril 20-Like Kinasen Mst1/2, WW Domäne-haltigen Salvador Gerüst Protein und die großen Tumor-Suppressor-Homolog (Lats1/2)-Kinasen. Nilpferd-Signalisierung Yap und Taz Aktivität hemmt und fördert deren Abbau im Zytoplasma. Ohne Unterdrückung von Hippo Yap und Taz translozieren in Kerne und fungieren als transkriptioneller Co-Aktivatoren. Wir vor kurzem zeigte, dass speziell Inaktivierung der Hippo Signalisierung Effektoren Yap und Taz in Maus NCCs mithilfe der Wnt1Cre und Wnt1Cre2SOR Treiber führte zu embryonalen Tödlichkeit bei E10.5 mit schweren Kraniofaziale defekte20. Wir haben auch Studien mit O9-1-Zellen um zu untersuchen, die Rolle von Yap und Taz in NCCs durchgeführt. Um Yap und Taz Funktion im NCC Proliferation und Differenzierung, Yap und Taz Zuschlag zu untersuchen wurden Zellen mit SiRNA in O9-1-Zellen erzeugt und Yap -Knockout-Zellen wurden mittels CRISPR-Cas9 Genom-Bearbeitung erzeugt. Die gleichen Gen Verlustfunktion-Strategien können auf unterschiedliche Zielgene in andere Bahnen angewendet werden. Darüber hinaus können Gewinn Funktionsstudien und Transfektion Assays auf O9-1-Zellen, Genfunktion und Regulation zu studieren auch angewendet werden. Die hier beschriebenen Protokolle sollen von den Forschern als Führer für die Kultivierung O9-1-Zellen um multipotenten Stemness beizubehalten, zur Differenzierung von O9-1-Zellen in andere Zelltypen unter verschiedenen Kulturbedingungen und für das Studium der Genfunktion verwendet werden und die molekularen Mechanismen der NCCs.

Protokoll

1. Vorbereitung vor O9-1 Zellkultur

Hinweis: Basale Medien O9-1 Zellkultur müssen durch Inzucht Sandos Mäuse Thioguanine/Ouabain-resistente (STO) Maus fibroblastenzellen konditioniert sind; Daher müssen STO Zellen gewonnen und zubereitet, wie unten beschrieben vor Beginn der Zellkultur O9-1.

  1. Aktive STO Zellkultur
    1. Bereiten Sie Medien für aktive STO Zellen durch eine komplette Dulbecco Kultivierung des Adlers Medien (DMEM) modifiziert mit 7 % fetalen bovine Serum (FBS) (embryonale Stammzelle-Kultur-Klasse), 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 2 mM L-Glutamin (Endkonzentrationen vor sind angegeben).
      Hinweis: STO Medium ist für den Anbau von aktiven STO-Feeder-Zellen verwendet. Penicillin, Streptomycin und L-Glutamin können Niederschlag im Speicher bilden; lösen Sie durch pipettieren vor Gebrauch vollständig auf.
    2. Bestreichen Sie eine Kultur-Zellplatte standard 100 mm mit 0,1 % Gelatine für 30 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie nach der Inkubationszeit die zusätzliche Gelatine. Verwenden Sie die Platte sofort nach der Beschichtung.
      Hinweis: Alternativ decken Sie die Platte mit STO Medien ab und lassen Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator zu vermeiden, die Trocknung der Platte (Dies ist nur für eine kurzfristige Speicherung und nicht für die Speicherung von vorbeschichteten Platten gemeint).
    3. Die STO-Zellen schnell in einem 37 ° C Wasserbad Auftauen; Wischen Sie die Cryoröhrchen mit 70 % Ethanol vor Eröffnung, und sofort übertragen Sie das ganze Fläschchen von Zellen auf einem Zentrifugenröhrchen.
    4. Die STO-Medien die Zentrifugenröhrchen tropfenweise hinzufügen; das Verhältnis von Volumen der Zellen, Medien ist 01:10.
    5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 180 X g für 3 min bei RT
    6. Durch sanfte pipettieren und Transfer Zellen auf die Gelatine beschichtete Platte mischen.
    7. Lassen Sie STO-Zellen für 24 h in ein standard-Inkubator (37 ° C, 5 % CO2) wachsen.
    8. Ändern des Mediums (erst, nachdem die Zellen haften) 24 h nach Aussaat und entsorgen das alte Medium.
    9. Überprüfen Sie STO Zellen jeden Tag unter ein Mikroskop und Passage bei 80 % Konfluenz.
      1. Bevor Sie beginnen STO Zelle passagierung, Beschichten Platten mit 0,1 % Gelatine (Gelatine entspricht die Hälfte des Wachstums Medien für dieses Schiff) für 30 min bei Raumtemperatur.
      2. Um STO Zellen passage, Aspirieren Wachstumsmedien und Zellen mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zweimal waschen (PBS in ein gleiches Volumen an Wachstumsmedien hinzufügen).
      3. Aspirieren PBS und Hinzufügen von 0,25 % Trypsin-EDTA (Lautstärke entsprechend der Schiffsgröße); dann, bei 37 ° C für 5 min inkubieren.
        Hinweis: Für eine 100 mm-Platte verwenden Sie, Wachstumsmedien 10 mL und 3 mL Trypsin-Lösung. Verwenden Sie für eine 150-mm-Platte 20 mL Wachstumsmedien und 8 mL Trypsin-Lösung. Das Volumen der Waschpuffer verwendet ist gleich dem Volumen des Wachstumsmedium.
      4. Trypsin mit ein gleiches Volumen der STO-Medien zu inaktivieren. STO Samenzellen zu neuen Platten mit einem Verhältnis von 1:3 bis 01:10.
        Hinweis: Ein gemeinsames expandierendes System ist in einem 100 mm Platte, dann eine 150 mm Platte dann vier 150 mm Platten aus einer Cryoröhrchen erweitern und schließlich zu 16 150 mm Lamellen.
  2. Inaktivierung und Einfrieren von STO Zellen
    1. Für die Zubereitung von 2 x Einfrieren Medien, fügen Sie Folgendes zum STO Medien (Endkonzentrationen sind angegeben): 20 % FBS, 20 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO).
    2. Nach dem Mischen, Filter 2 x Einfrieren Medien (Pore Größe 0,22 µm) zu sterilisieren und bis zur Verwendung bei 4 ° C lagern. Machen Sie 2 X Einfrieren Medien am gleichen Tag verwenden und entsorgen ungenutzte einfrierende Medien.
    3. Bereiten Sie Mitomycin C Lösung mit PBS-Puffer in einer Konzentration von 0,5 mg/mL. Mitomycin C in gepufferter Kochsalzlösung auflösen, kleben Sie die Flasche auf einem Vortexer und Wirbel bei einer niedrigen Einstellung für ca. 45 min die Partikel vollständig auflösen.
      Hinweis: Mitomycin C ist leicht empfindlich und schwer zu lösen.
      Achtung: Mitomycin C ist akut toxisch und kann Krebs verursachen. Nur mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung zu behandeln.
    4. STO Zellen zu inaktivieren, indem Sie die vorhandenen Medien eine Endkonzentration von 0,01 mg/mL Mitomycin C hinzufügen. 2 h in einem standard brutmaschine (37 ° C, 5 % CO2) inkubieren.
    5. Waschen Sie Platten (150 mm) mit 20 mL PBS, zweimal nach Inaktivierung mit Mitomycin C.
    6. Aspirieren Sie die PBS-Lösung, distanzieren Sie Zellen mithilfe von 8 mL 0,25 % Trypsin-EDTA und inkubieren Sie für 5 min in ein standard befeuchtete brutmaschine (37 ° C, 5 % CO2).
    7. Trypsin mit 8 mL STO Medien zu inaktivieren.
    8. Übertragen Sie die Zelle-Lösung auf einem Zentrifugenröhrchen. Kombinieren Sie mehr als eine Platte in einem Zentrifugenröhrchen, Zeit zu sparen. Zentrifuge für 5 min bei 180 X g.
    9. Den überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL PBS.
    10. Verwenden Sie 10 µL der Zelle Lösung, um Zellen zählen mithilfe einer Hemocytometer. Zählen der Zellen in der gerasterten Zentralplatz und multiplizieren Sie die Zahl durch 10 erhalten4 zu bestimmen, die Anzahl der Zellen pro 1 mL. Doppelt zu zählen und die zwei Zahlen, um die letzte Schätzung der Anzahl der Zellen pro Milliliter zu erhalten im Durchschnitt.
    11. Zentrifugieren Sie Zellen für 5 min bei 180 X g.
    12. Aspirieren Sie PBS und der Zelle Pellet fügen Sie 1:1 (nach Volumen) STO und 2 X Einfrieren Medien hinzu. Stellen Sie die Lautstärke für eine endgültige Zellkonzentration von 4 x 106 Zellen/mL (dieser Betrag ist gut für eine 100 mm-Platte).
      Hinweis: zum Beispiel aus vier 150-mm-Platten mit insgesamt 60 x 106 Zellen, frieren Sie ein, 4 x 106 Zellen pro Cryoröhrchen, mit jedem Cryoröhrchen mit 1 mL der Lösung der Zelle. Vier Platten Ausbeute ca. 15 Cryovials (60/4 = 15). Hinzugeben Sie 7,5 mL STO Medien und 7,5 mL 2 x Einfrieren Medien zur Zelle Pellet, aufschwemmen und Aliquote 1 mL in jede Cryoröhrchen.
    13. Aufschwemmen von langsam pipettieren einfrierende Medien mit Pellet-Zelle. 1 mL der Zelle Lösung auf jeder Cryoröhrchen übertragen und entsprechend beschriften.
    14. Legen Sie Cryovials in einem Lidern Styroporbox (Dies stellt eine langsame Abkühlgeschwindigkeit, das Überleben der Zellen verbessert). Übertragen Sie Feld auf-80 ° C Gefrierschrank für mindestens 24 h vor der Übertragung die Cryoröhrchen zu flüssigem Stickstoff.
      Hinweis: Für beste Ergebnisse, minimieren Sie die Zelle zählen sowohl Zeit als auch die Zeit zwischen Zellen 2 X Einfrieren Medien hinzufügen und Übertragung von Fläschchen bis-80 ° C.

(2) O9-1 Zellkultur

  1. O9-1 Zellkultur basale Medien vorbereiten, indem man folgendes in DMEM (Endkonzentrationen sind angegeben): 15 % FBS, 0,1 mM minimale wesentlichen Medien (MEM) nichtessentiellen Aminosäuren, 1 mM Natrium Pyruvat, 55 mM Beta-Mercaptoethanol, 100 U/mL Penicillin, 100 U/mL Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 103 Einheiten/mL Leukämie hemmenden Faktor (LIF; unmittelbar vor der Anwendung hinzugefügt, keine Lager Flasche hinzu), und 25 ng/mL Fibroblasten Wachstumsfaktor-Basic (bFGF; unmittelbar vor der Anwendung hinzugefügt, keine Lager Flasche hinzu).
  2. Filter die basalen Medien (Pore Größe 0,22 µm) zu sterilisieren und wickeln Sie in Alufolie um vor Licht zu schützen.
  3. Sammeln Sie konditionierte basale Medien aus inaktivierten STO Zellen.
    Hinweis: Fahren Sie erst mit inaktivierten STO Zellgewinnung. Basale Medien O9-1 von STO Zellplatten gesammelt werden im folgenden als konditionierten basale Medien bezeichnet.
    1. Tauwetter inaktiviert STO Zellen schnell wie oben beschrieben (ein Cryoröhrchen mit 4 x 106 Zellen ist gut für eine 100 mm-Platte und ergibt etwa 100 mL konditioniert basale Medien nach 10 Tagen der Sammlung). Samen inaktiviert STO Zellen auf die Gelatine beschichtete Platte mit STO-Medien. Können Sie Zellen über Nacht in einem standard befeuchteten Inkubator (37 ° C, 5 % CO2) befestigen.
    2. 24 h nach dem Auftauen STO Zellen, die bestehenden STO-Medien zu verwerfen und mit den basalen Medien ersetzen.
      Hinweis: Keine hinzu LIF und bFGF inaktivierten STO Zelle Kultur Gerichte; nur O9-1 Zelle Kultur Gerichte hinzufügen.
    3. Alle 24 h Medien mithilfe von basalen Medien O9-1 ändern und sammle die basalen Medien von STO Zellplatten in eine Flasche. Wickeln Sie die Flasche mit konditionierten basale Medien in Folie um vor Licht zu schützen. Speichern Sie alle gesammelten Medien bei 4 ° C.
      Hinweis: Da die Zellen inaktiviert wurden, sie erscheinen nicht so gesund, wie sie es nach einigen Tagen der Sammlung; Dieses soll erwartet werden.
    4. Optional um auf Verschmutzung prüfen, sammeln Sie die basalen Medien täglich Sammlung in verschiedenen Röhren (statt eine Flasche) in Folie verpackt. Mit einer 24-Well-Platte, 1 mL der Medien aus jeden Tag in jede Vertiefung und inkubieren Sie über Nacht in einem standard Inkubator für bakterielle Kontamination unter dem Mikroskop zu überprüfen.
      Hinweis: Die Medien bleibt eine rote Farbe, wenn gibt es keine Kontamination aber Änderungen an gelb, wenn bakterielle Kontamination vorliegt.
    5. Nach dem Sammeln konditioniert basale Medien für 10 Tage, verwerfen die STO-Zellen. Mähdrescher (falls zutreffend) alle gesammelten bedingte basale Medien und Filter sterilisieren (Pore Größe 0,22 µm) in eine sterile Flasche. Wickeln Sie die Flasche in Folie, um vor Licht zu schützen. Halten Sie die gefilterten konditionierten basalen Medien bei 4 ° C für maximal einen Monat ab dem Datum der Filter.

3. Aufrechterhaltung O9-1-Zellen

Hinweis: Arbeiten basale Medien O9-1 ist Filter sterilisiert konditioniert basale Medien, welche LIF (Endkonzentration 103 Einheiten/mL) und bFGF (Endkonzentration 25 ng/mL) werden sofort hinzugefügt, um die Zelle Kulturschale vor Gebrauch. Der Datenträger muss vor Licht geschützt und bei 4 ° c gelagert

  1. Rückgewinnung von O9-1-Zellen
    1. Tauen Sie die Lager Flasche der Basalmembran Matrix (z.B.Matrigel) langsam über Nacht bei 4 ° C, Aliquote vorzubereiten.
    2. Fügen Sie 5 mL DMEM mit 10 % FBS bis 5 mL der Lager Basalmembran Matrix Membran. Mischen Sie gut durch Pipettieren mit kalten Pipettenspitzen bei-20 ° c gelagert Halten Sie die Flasche und aliquoten originalröhren auf Eis. Frieren Sie Aliquote in verschiedenen Bänden (0,5 mL oder 1 mL Aliquote) je nach den Bedürfnissen des Experiments. Vermeiden Sie Einfrieren Auftauen Basalmembran Matrix mehrere Male.
      Hinweis: Basalmembran Matrix polymerisiert schnell bei Raumtemperatur; Verwenden Sie kalt Pipettenspitzen und halten Sie Röhren kühl, wenn Sie arbeiten, um ungewollte Polymerisation zu vermeiden.
    3. Tauen Sie ein Aliquot der Basalmembran Matrix bei 4 ° C oder auf Eis 2 h vor Beginn des Experiments. Speichern Sie die Matrix bei 4 ° C nicht über einen längeren Zeitraum.
    4. Verwenden Sie Filter sterilisiert DMEM mit 10 % FBS zum Verdünnen der Basalmembran-Matrix, um eine Endkonzentration von 0,5 mg/mL, die Platten zu beschichten. Beschichten Sie Platten mit der Basalmembran Matrix (0,5 mg/mL) bei Raumtemperatur für 1 h stellen Sie sicher, dass es die Platte deckt (siehe Abbildung 1).
    5. Kippen Sie die Platte, wenn die Basalmembran Matrix um zu vermeiden, berühren die beschichtete Oberfläche Absaugen; Trocknen Sie Platten bei 37 ° C für 30 min. Trocken Sie beschichtete Platten nicht übermäßig.
      Hinweis: Fahren Sie nur, wenn alle Medien und Reagenzien einsatzbereit sind (bedingt basale Medien, steril gefiltert 10 % FBS in DMEM, LIF und bFGF).
    6. O9-1-Zellen schnell indem man die Cryoröhrchen in einem 37 ° C Wasserbad zu erholen; langsam schwenken Sie das Fläschchen bis die Lösung vollständig wendet sich an Flüssigkeit und sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    7. Übertragen Sie die Zelle-Lösung von Cryoröhrchen (ca. 1 mL) auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 5 Bände von DMEM mit 10 % FBS (Filter mit einem Filter Porengröße von 0,22 µm sterilisiert) und aufzuwirbeln.
    8. Zentrifuge für 3 min bei 180 X g. Aspirieren Sie den überstand ohne zu stören die Zelle Pellet. Aufzuwirbeln Sie die Zelle Pellet (durch Antippen) in konditionierten basale Medien ergänzt mit LIF und bFGF. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hemocytometer.
      Hinweis: Konditionierte basale Medien ergänzt mit LIF und bFGF ist entscheidend für die Multipotenz der Zelllinie O9-1 zu erhalten. Darauf achten, das richtige Medium zur Vermeidung von unbeabsichtigten Zelldifferenzierung hinzufügen.
    9. Samenzellen von 10.000 bis 15.000 Zelle/cm2 , 6-Well-Platte. Ermöglichen Sie Zellen zu befestigen und wachsen in eine Standardzelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO2) über Nacht vor dem Wechsel der Medien.
    10. Sicherstellen Sie, dass die Zellen verbunden sind, bevor Sie fortfahren, Medien (gesunde angeschlossenen Zellen aussehen wie in Abbildung 2gezeigt) zu ändern.
    11. Ändern Sie Nährmedien immer am nächsten Tag nach der Wiederherstellung der O9-1-Zellen (konditionierte basale Medien ergänzt mit LIF und bFGF verwenden).
  2. Durchgang von O9-1-Zellen
    1. Wenn O9-1-Zellen 80 % Konfluenz erreichen, tauen Sie die Basalmembran Matrix und bereiten Sie eine Basalmembran Matrix-beschichtete Platte wie oben beschrieben. Fügen Sie konditionierte basale Medien ergänzt mit LIF und bFGF des Schiffes hinzu. Alternativ fügen Sie DMEM ohne FBS, die Basalmembran Matrix vor dem Austrocknen und Lagern in einem standard befeuchtete brutmaschine für nicht mehr als 3 Tage.
    2. O9-1-haltigen Brunnen (6-Well-Platte) mit 2 mL Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) zweimal spülen und pipette vorsichtig um nicht zu verlieren Zellen.
    3. Zellen mit 1 mL Trypsin-EDTA 0,05 % bei 37 ° C für 3 min. neutralisieren Trypsin mit einer gleichen Menge von DMEM mit 10 % distanzieren FBS. Immer wieder pipette die Flüssigkeit über die gesamte Fläche des Brunnens, so viele Zellen von der Platte wie möglich zu trennen.
      Hinweis: Trypsin-Konzentration ist 0,05 % statt 0,25 %. Verwenden Sie DPBS, um aus dem Lager Flasche verdünnen.
    4. Vermeiden Sie Luftblasen erzeugen, wenn Zellen aus der Platte liegt.
    5. Übertragen Sie alle Zelle Lösung zu einem Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 3 min bei 180 X g. Aspirieren Sie den überstand ohne zu stören die Zelle Pellet. Aufschwemmen der Zelle Pellet in das Zentrifugenröhrchen durch sanfte pipettieren in konditionierten basale Medien mit LIF und bFGF ergänzt.
    6. Verwenden Sie eine Hemocytometer, um die Ergebniszelle zählen, wie oben beschrieben. Samenzellen (10.000 bis 15.000 Zellen/cm2) auf die beschichtete Platte zubereitet wie 3.1.4 zu 3.1.8 beschrieben. Einen Brunnen von einem 6-Well-Platte würde 100.000 Zellen Samen benötigen.
    7. Zellen zu befestigen und wachsen in eine Standardzelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO2) zu ermöglichen. Ändern Sie Nährmedien immer am nächsten Tag nach passagierung O9-1-Zellen.
  3. Einfrieren von O9-1-Zellen
    1. 2 x Medien O9-1 Zellen einfrieren vorbereiten, verdünnen die folgenden in DMEM (Endkonzentrationen sind angegeben): 40 % FBS und 20 % DMSO.
    2. Filter 2 x Einfrieren Medien zu sterilisieren und halten Sie es bei 4 ° C. 2 x Einfrieren Medien müssen am Tag erfolgen, die es verwendet wird. Entsorgen Sie alle unbenutzte einfrierende Medien.
      Hinweis: Frieren Sie O9-1-Zellen bei 80 % Konfluenz ein.
    3. Spülen Sie Brunnen mit DPBS zweimal; Pipette vorsichtig zu verlieren Zellen.
    4. Zellen mit 0,05 % Trypsin-EDTA bei 37 ° C für 3 min zu distanzieren, dann neutralisieren Trypsin mit einer gleichen Menge von 10 % FBS in DMEM. Immer wieder pipette die Flüssigkeit über die gesamte Fläche des Brunnens, so viele Zellen von der Platte wie möglich zu trennen.
    5. Übertragen Sie alle Teller Inhalt zu einem Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 3 min bei 180 X g. Den überstand abgesaugt und fügen Sie 2 mL PBS und Aufschwemmen durch Antippen.
    6. Verwenden Sie 10 µL der Zelle Lösung, um Zellen zu zählen, indem Sie mit einem Hemocytometer, wie oben beschrieben.
    7. Zentrifugieren Sie Zelle Lösung für 3 min bei 180 X g. Den überstand abgesaugt und passen Sie die Anzahl der basalen Medien benötigt; Fügen Sie dann die gleiche Menge 2 X Einfrieren Medien.
      Hinweis: Zellen werden in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/mL (1 mL pro Cryoröhrchen) eingefroren.
    8. Zellen auf Cryovials übertragen und entsprechend beschriften. Legen Sie Cryovials innerhalb einer geschlossenen Polystyrol Box für eine langsame Abkühlgeschwindigkeit bei-80 ° C für mindestens 24 h vor der Übertragung an flüssigem Stickstoff.
      Hinweis: Für beste Ergebnisse, minimieren Sie die Zelle zählen Zeit und die Zeit zwischen dem Hinzufügen 2 x Einfrieren Medien und Übertragung von Fläschchen bis-80 ° C.

(4) Manipulation von O9-1-Zellen

  1. Durchführung von SiRNA Zuschlag in O9-1-Zellen
    1. Auftauen und eine 24-Well-Platte mit Basalmembran Matrix Mantel, oben beschriebenen (Schritte 3.1.4–3.1.8) vor Beginn des Experiments. Erholen Sie und Samen Sie O9-1-Zellen, so dass sie bis zu 60 % bis 80 % confluency wachsen.
    2. Verdünnen Sie Liposomen in serumfreien Medien nach der entsprechenden gut Volumen. Verdünnen Sie SiRNA in serumfreien Medien ins Finale. Verdünnte Liposomen in einem vom Hersteller empfohlenen Verhältnis fügen Sie verdünnten SiRNA hinzu. Mischen Sie gut durch pipettieren und inkubieren.
      Hinweis: Anleitung des Herstellers auf dem Volume verwendet, Zeit und Temperatur der Inkubation.
    3. Hinzu kommt eine entsprechende Volumen der SiRNA-Lipid-Komplex Zellen entsprechend den Empfehlungen des Herstellers.
    4. Inkubieren Sie Zellen für 24 h in einer Standardzelle Kultur Inkubator (37 ° C, 5 % CO2). Nachgelagerten Schritte als geeignete (Auszug RNA, Extrakt Proteine, Färbung, etc..)
      Hinweis: SiRNA Knockdown Zeiten und Konzentrationen variieren je nach der individuellen Experiment.
  2. Durchführung von Gen Knockout in O9-1-Zellen mithilfe von CRISPR-Cas9 Genom-Bearbeitung
    Hinweis: Beziehen sich auf die bisher veröffentlichten Protokoll für die Verwendung von CRISPR-Cas9 in Säugetierzellen Linien29. Hier ist eine vereinfachte Beschreibung der CRISPR-Cas9 Genom-Bearbeitung und damit verbundenen Schritte.
    1. Erhalten Sie SgRNA Sequenzen mithilfe eines SgRNA-Design-Tools.
    2. Verbinden Sie die SgRNA, pSpCas9 (bb) - 2a - GFP Vektor30.
    3. Transfizieren Sie O9-1-Zellen mit der Vektor über ein standard Lipofektion Protokoll gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
    4. Inkubieren Sie Zellen in einem Standardzelle Kultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 24 h.
    5. Durchführen Sie Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) basierend auf GFP/7-AAD. GLP + einzelne Samenzellen in 96-Well-Platten.
    6. Wachsen Sie die Zellen in den Inkubator für weitere 4 Tage. Entsorgen Sie alle Brunnen mehr als eine Kolonie.
    7. Durchführen Sie PCR mit Primer entwickelt, für die Erkennung der Löschung. PCR nachlaufen Sie PCR-Produkte auf ein Agarosegel Bandgröße zu bewerten. Überprüfen Sie die Ko-Effizienz erreicht, indem CRISPR-Cas9 Editingby Durchführung Western blotting (ein Beispiel von Yap ko-Ergebnissen ist in Abbildung 3dargestellt).

(5) O9-1-Zell-Differenzierung

  1. Differenzierung der O9-1-Zellen in Osteoblasten
    1. Um osteogene Differenzierung Medien vorzubereiten, verdünnen Sie Folgendes im Alpha-MEM (Endkonzentrationen sind angegeben): 0,1 mM Dexamethason, 100 ng/mL Knochen morphogenetische Protein 2 (BMP2), 50 µg/mL Ascorbinsäure, 10 mM b-glycerophosphat, 10 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 mg/mL Streptomycin.
    2. Erkennen des Osteoblasten-Markers Osteocalcin, in differenzierten Osteoblasten durch Immunostaining wie in Abbildung 4dargestellt.
      Hinweis: Osteogene Differenzierung kann auch mit anderen Markern, Osteoblasten oder mit Alizarin rote Färbung oder alkalische Phosphatase Färbung ausgewertet werden.
  2. Differenzierung der O9-1-Zellen in Chondrozyten
    1. Um Knorpelzelltransplantation Differenzierung Medien vorzubereiten, verdünnen Sie Folgendes im Alpha-MEM (Endkonzentrationen sind angegeben): 5 % fetalen Kälberserum (FCS), 1 % Insulin-Transferrin-Selen (ITS), 100 U/mL Penicillin, 100 mg/mL Streptomycin, 10 ng/mL transformieren Wachstumsfaktor-Beta (TGF-b3), 50 mg/mL Ascorbinsäure, 10 ng/mL BMP2, Dexamethason 0,1 mM und 1 mM Natrium Pyruvat.
    2. Ersten Kultur pro Monolage O9-1 Zellen mit knochenbildenden Medien für 3 Tage und dann trypsinize und Kultur als Micromass Format in Knorpelzelltransplantation Differenzierung Medien für weitere 7 Tage.
    3. Esel Chondrogenic Differenzierung mit Alcian Blau Färbung oder Marker der Chondrozyten.
  3. Differenzierung der O9-1-Zellen in glatten Muskelzellen
    1. Um glatte Muskulatur Zelle Differenzierung Medien vorzubereiten, verdünnen die folgenden in DMEM (Endkonzentrationen sind angegeben): 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 10 % FBS.
    2. Esel-Glattmuskel-Zell-Differenzierung mit Immunfluoreszenz-Färbung mit Antikörper gegen Marker der glatten Muskelzellen, wie Aktin glatte Muskulatur (SMA), als ein Beispiel in Abbildung 5dargestellt.
  4. Differenzierung der O9-1-Zellen in Gliazellen
    1. Um Gliazelle Differenzierung Medien vorzubereiten, verdünnen Sie die folgenden in DMEM/F12 (Endkonzentrationen sind angegeben): 1 x B-27 Ergänzung, 2 mM L-Glutamin, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL Penicillin, 100 mg/mL Streptomycin, 50 ng/mL LIF und 1 % Hitze-inaktivierten FBS.
    2. Bewerten Sie Glia-Zell-Differenzierung durch Immunfluoreszenz-Färbung mit Antikörper gegen Gliazelle Markierungen wie Fettsäure-bindendes Protein 7 (FABP7) ausführen.

Ergebnisse

Das Ziel unserer Knockdown und Knockout Experimente war Studie zu den Auswirkungen von Yap und Taz -des-Verlustfunktion in O9-1-Zellen. Vor den Knockdown und Knockout versuchen müssen wir sicherstellen, die basale Medien und Kultur O9-1 Zellen wie oben beschrieben (z. B. Basalmembran Matrix Bedürfnisse decken die ganze Platte wie in Abbildung 1und O9-1-Zellen erholte sich vorzubereiten von flüssigem Stickstoff wie in ...

Diskussion

Das NCC ist ein vielseitig und wichtigen Beitrag zu verschiedenen Geweben und Organen während der embryonalen Morphogenese. O9-1-Zell-Linie unterhält das Potenzial, sich in viele verschiedene Zelltypen differenzieren und die in-Vivo -Merkmale der NCCs, so dass es eine nützliche in-vitro- Werkzeug für die Untersuchung Genfunktion und molekulare Regulation in NCCs imitiert. Die unterschiedliche Status der O9-1-Zellen kann verschiedene Neuralleiste Nachkommen in Vivo, je nach Kulturbedingungen...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Nicole Stancel, Ph.d., ELS, von wissenschaftlichen Publikationen des Texas Heart Institute, Unterstützung redaktionelle. Wir danken auch die folgenden Finanzierungsquellen: die American Heart Association nationale Zentrum Wissenschaftler Development Grant (14SDG19840000, J. Wang), der 2014 Lawrence-Forschungspreis aus Rolanette und Berdon Lawrence Knochen Krankheit Programm von Texas (, J. Wang ), und die National Institutes of Health (DE026561 und DE025873, J. Wang, DE016320 und DE019650, R. Maxson).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Active STO feeder cellsATCCATCC CRL-1503Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X
O9-1 mouse cranial neural crest cell lineMillipore SigmaSCC049
DMEM, high glucose, no glutamineGibco11960-044
DMEM, high glucoseHycloneSH30243.01
FBS (fetal bovine serum)Millipore SigmaES-009-B
Penicillin - streptomycinGibco15140-122
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
Gelatin from porcine skinSigmaG1890
Trypsin-EDTA 0.25% in HBSSGenesee Scientific25-510
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesiumLonza17-512F
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100XxGibco11140-050
Sodium pyruvate (100 mM)Gibco11360-070
2-MercaptoethanolSigmaM-7522
ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/mLMillipore SigmaESG1106
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)R&D Systems233-FB-025
Mitomycin CRoche10107409001
Matrigel matrixCorning356234
DMSO (dimethylsulfoxide)Millipore SigmaMX1458-6
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778-075
Opti-MEM I (1x)Gibco31985-070
Minimum essential medium, alpha 1x with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamineCorning10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNADharmaconL-041057
ON-TARGETplus Non-targeting PoolDharmaconD-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNADharmaconL-046247
FCS (fetal calf serum)
ITS (insulin-transferrin-selenium)
TGF-b3
Ascorbic acid
BMP2 (bone morphogenetic protein 2)
Dexamethasone
B-27 supplement

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.

Step 2.1 was updated from:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

to:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

Step 5.1.1 was updated from:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.

to:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.

Step 5.2.1 was updated from:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

to:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

Step 5.4.1 was updated from:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

to:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

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