JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Erratum Notice
  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Erratum
  • Перепечатки и разрешения

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Резюме

O9-1 — линия клеток нейронные крест Multipotent с мышью. Здесь мы описываем подробные пошаговые протоколы для культивирования клеток O9-1, дифференциации клеток O9-1 в типы конкретных клеток и генетически манипулировать O9-1 клетки с помощью малых интерферирующих РНК опосредованной нокдаун или изменения генома ТРИФОСФАТЫ-Cas9.

Аннотация

Гребень нервной клетки (СЧД) переносятся Multipotent с экстрактами стволовых клеток, которые могут дифференцироваться в различных типов клеток и порождают множественные тканей и органов. O9-1 клеточная линия является производным от эндогенных мыши эмбриональные СЧД и поддерживает его multipotency. Однако в условиях конкретной культуры, O9-1 клетки могут дифференцироваться в различных типов клеток и использоваться в широком диапазоне исследований приложений. Недавно с сочетанием мыши и исследований клеток O9-1, мы показали, что бегемот, сигнальные пути эффекторов яп и таз играют важную роль в нейронные крест производные краниофациальных развития. Хотя процесс культивирования клеток O9-1 является более сложной, чем для других клеточных линий, O9-1 клеточная линия представляет собой мощный модель для изучения СЧД в пробирке. Здесь мы представляем собой протокол для культивирования клеток линии O9-1 для поддержания его stemness, а также протоколы для дифференциации клеток O9-1 в различных типов клеток, таких как гладких мышечных клеток и остеобластов. Кроме того описываются протоколы для выполнения исследования потери функции генов в клетках O9-1 с помощью удаления ТРИФОСФАТЫ-Cas9 и малые интерферирующие РНК опосредованной нокдаун.

Введение

Гребень нервной клетки (СЧД) являются Multipotent с экстрактами стволовых как клетки с замечательным миграционной способности и переходных существование во время эмбрионального развития. СЧД происходят между поверхности эктодермы и нервной трубки и мигрировать в другие районы эмбриона во время эмбрионального развития1. Основываясь на их функциональные домены, СЧД можно разделить на несколько различных типов, в том числе черепа, ствол, вагусной, сакральный и сердца СЧД. Кроме того СЧД могут дифференцироваться в несколько линий клеток, например, гладкомышечные клетки, костные клетки и нейроны и привести к возникновению различных тканей2,3. Развитие СЧД характеризуется сложной серии морфогенетических событий, которые настроены на различных молекулярных сигналов. Учитывая сложные регулирование СЧД и их важный вклад в многочисленные структуры, регуляции NCC развития часто может привести к врожденных врожденных дефектов, которые составляют около 30% всех человеческих врожденных врожденных дефектов. Аномалии в ходе разработки нейронные крест может привести к заячья губа/неба, недостатки формирования носа, синдромы, дефекты например дефектных сердца отток тракта, или даже младенческой смертности1,4,5, 6 , 7. понимание молекулярных механизмов развития НСС имеет важное значение для разработки методов лечения заболеваний, вызванных дефектами в развитии НКК. С использованием различных in vitro и in vivo подходы8,9,10,11,12,13,14 ,15, был достигнут значительный прогресс в исследованиях НКК. В естественных условиях, животных моделей, в том числе кур, земноводных, данио рерио и мышей, использовались для изучения СЧД1. Кроме того человеческие эмбрионы были использованы для изучения процесса миграции НКК в начале развития эмбриона человека16. В пробирке, ячейки модели для СЧД, таких как человека СЧД, которые возникли от пациента подкожной жировой клетчатки, использовались для изучения болезни Паркинсона17. NCC O9-1 линия, которая была первоначально производным от массовой культуры эндогенного СЧД, изолированных от зародышей мыши E8.518, является мощным ячеечная модель для изучения СЧД. Важно отметить, что в условиях культуры-дифференцируя, клетки O9-1 Multipotent с экстрактами стволовых как СЧД. Однако в условиях разной культуры O9-1 клетки могут быть продифференцированы в типы уважаемого клеток, таких как гладкомышечные клетки, остеобласты, хондроцитов и глиальных клеток18. Учитывая эти свойства, клетки O9-1 широко использовались для исследований, касающихся NCC, например расследование молекулярный механизм черепно лицевых дефектов19,20.

Здесь предоставляются подробные протоколы для поддержания клеток O9-1, дифференцируя O9-1 клеток в различных типов клеток и манипулирования O9-1 клетки, выполняя исследования потери функции гена с ТРИФОСФАТЫ-Cas9 изменения генома и малые интерферирующие РНК (siRNA)- при посредничестве нокдаун технологий. В качестве примера представитель описано использование клеток O9-1 для изучения яп и таз -из функция потерь. Вниз по течению эффекторов Бегемот, сигнальный путь, который играет важную роль в клеточной пролиферации, дифференциация и апоптоз YAP и таз. Бегемот путь также было показано важное значение в развитии и гомеостаза нескольких различных тканей и органов, а также в патогенезе различных заболеваний20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Основные компоненты Бегемот сигнализации включают опухоли подавитель стерильные 20-как киназы Mst1/2, WW домена содержащих Сальвадор эшафот белков и большие опухолевые супрессоры гомолога (Lats1/2) киназы. Бегемот сигнализации препятствует яп и таз активности и способствует их деградации в цитоплазме. Без репрессий бегемота яп и таз можно перемещать в ядрах и функционировать как транскрипционный анализ совместного активаторы. Мы недавно показали, что конкретно инактивации Бегемот сигнализации эффекторов яп и таз в мыши СЧД, используя Wnt1КРР и Wnt1Cre2SOR водителей привело к эмбриональной летальность в E10.5 с тяжелыми краниофациальных дефектов20. Мы также выполняются исследования с использованием клеток O9-1 для изучения роли Yap и таз в СЧД. Для изучения функции Yap и таз в НКК распространения и дифференциации, яп и таз нокдаун клетки были созданы в клетках O9-1 с помощью малых интерферирующих РНК, и яп нокаут клетки были созданы с помощью изменения генома ТРИФОСФАТЫ-Cas9. Те же стратегии потери функции гена могут применяться для различных целевых генов в другие пути. Кроме того получить из функция исследования и анализы transfection может применяться также к клеткам O9-1 для изучения функции гена и регулирования. Протоколы, описанные здесь, предназначены для использования следователями в качестве руководства для культивирования клеток O9-1 для поддержания Multipotent с stemness, для дифференциации клеток O9-1 в другие типы клеток в условиях разных культур и для изучения функции гена и молекулярные механизмы СЧД.

протокол

1. Подготовка перед O9-1 клеточная культура

Примечание: Базальной носители культуры клеток O9-1 должны было обусловлено Sandos инбредных мышей тиогуанин/Уабаин устойчивые (STO) фибробластов клетки мыши; Таким образом STO клетки должны быть получены и подготовлен как описано ниже, перед началом O9-1 клеточной культуры.

  1. Культура клетки активные STO
    1. Подготовить СМИ для культивирования активные клетки сто, делая полный Дульбекко изменение орла СМИ (DMEM) с 7% плода бычьим сывороточным (ФБС) (эмбриональных стволовых клеток культуры сорт), 100 ед/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мм L-глютамин (окончательный концентрации указаны).
      Примечание: STO средних используется для выращивания активной ячейки едока STO. Пенициллин, стрептомицин и L-глютамин могут образовывать осадков в хранилище; Растворите полностью закупорить перед использованием.
    2. Слой плиты культуры клеток стандартный 100 мм с желатином 0,1% для 30 мин при комнатной температуре. После инкубационного периода аспирационная дополнительных желатина. Используйте пластину сразу же после покрытия.
      Примечание: в качестве альтернативы, крышка с STO СМИ и оставить пластину в увлажненные инкубатор, чтобы избежать высыхания плиты (это означало только для краткосрочного хранения, а не для хранения ветротурбин пластины).
    3. Оттепель STO клетки быстро в ванну воды 37 ° C; Протрите cryovial с 70% этанол до открытия и немедленно перевести весь флакон клеток в пластиковых пробирок.
    4. Добавить медиа STO каплям пластиковых пробирок; отношение объема клетки к средствам массовой информации составляет 1:10.
    5. Центрифуга клетки на 180 x g 3 мин на RT.
    6. Смешайте нежный закупорить и передачи клетки к пластине с покрытием желатина.
    7. Разрешить STO клетки, чтобы расти в течение 24 ч в стандартной инкубатора (37 ° C, 5% CO2).
    8. Изменение среды (только после того, как клетки присоединиться) 24 ч после посева и утилизируйте старые среднего.
    9. Проверьте STO клетки каждый день под микроскопом и проход на 80% confluency.
      1. Перед началом STO клеток пассированый, пальто плит с 0,1% желатина (желатина объем равен половина роста объема средств массовой информации для этого судна) за 30 мин при комнатной температуре.
      2. Для прохода STO клетки, аспирационная питательных сред и вымыть клетки с фосфат амортизированное saline (PBS) дважды (добавить PBS, равным объемом питательных сред).
      3. Аспирационная PBS и добавить 0,25% трипсина ЭДТА (регулировка громкости в зависимости от размера судна); затем инкубации при 37 ° C за 5 мин.
        Примечание: Для 100 мм пластины, используйте 10 мл средства роста и 3 мл раствора трипсина. Для 150 мм пластины используйте 20 мл средства роста и 8 мл раствора трипсина. Объем буфера мытья равен объем роста средств массовой информации.
      4. Инактивирует трипсина с равным объемом сто средств массовой информации. Семя STO ячейки новые пластины с коэффициентом от 1:3 до 1:10.
        Примечание: Общее расширение схемы является расширение от одного cryovial в один 100 мм пластины, а затем одна пластина 150 мм, затем четыре 150 мм пластин и наконец до 16 пластин 150 мм.
  2. Инактивация и замораживание клеток STO
    1. Для приготовления 2 x замораживания средств массовой информации, добавьте следующее к сто СМИ (окончательный концентрации указаны): 20% FBS, 20% диметилсульфоксида (ДМСО).
    2. После смешивания, фильтр стерилизовать 2 x замораживания средств массовой информации (поры размер 0,22 мкм) и хранить его на 4 ° C до использования. Сделайте 2 x замораживания средств массовой информации в тот же день использования и Выбросьте неиспользованные замораживания средств массовой информации.
    3. Готовят раствор митомицин C в PBS на концентрации 0.5 мг/мл. Чтобы растворить митомицин C в PBS, лента бутылку на Вортекс и вихрь на низком настройки для приблизительно 45 минут для полного растворения частицы.
      Примечание: Митомицин C светло-чувствительной и трудно растворить.
      Предупреждение: Митомицин C остро токсичен и может вызвать рак. Обрабатывать только с надлежащего личного защитного оборудования.
    4. Инактивирует STO клетки путем добавления конечной концентрации 0,01 мг/мл митомицин C существующих средств массовой информации. Проинкубируйте втечение 2 ч внутри Стандартный инкубатора (37 ° C, 5% CO2).
    5. Мыть тарелки (150 мм) с 20 мл PBS дважды после дезактивации с митомицин C.
    6. Аспирационная решение PBS, разбить ячейки с помощью 8 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубировать в течение 5 мин внутри Стандартный увлажненные инкубатора (37 ° C, 5% CO2).
    7. Инактивирует трипсина с 8 мл сто средств массовой информации.
    8. Передача решения ячейки для пластиковых пробирок. Объедините более чем одной пластины в одном пластиковых пробирок для экономии времени. Центрифуги для 5 мин при 180 x g.
    9. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл PBS.
    10. Использование 10 мкл раствора ячейки для подсчета клеток с помощью Горяева. Подсчитать ячейки в сетке площади и умножить число, полученное путем 104 , чтобы определить количество клеток в 1 мл. Граф дважды и в среднем двух чисел для получения окончательной оценки числа клеток на миллилитр.
    11. Центрифуга клетки для 5 мин при 180 x g.
    12. Аспирационная PBS и добавить 1:1 (по объему) сто средств массовой информации и 2 x заморозки клеток Пелле. Отрегулируйте громкость для окончательного ячейки концентрации 4 х 106 клеток/мл (эта сумма является хорошо для одной пластины 100 мм).
      Примечание: К примеру, от четырех 150-мм пластин, давая в общей сложности 60 x 106 клеток, заморозить 4 x 106 клеток / cryovial, с каждой cryovial, содержащие 1 мл раствора клеток. Четыре пластины доходность около 15 криопробирки (60/4 = 15). Добавьте 7,5 мл STO СМИ и 7,5 мл 2 x замораживания средств массовой информации клетки Пелле, Ресуспензируйте и Алиготе 1 мл в каждом cryovial.
    13. Ресуспензируйте, медленно закупорить замораживания средств массовой информации с Пелле ячейки. Передача 1 мл раствора ячейки для каждого cryovial и маркировать соответствующим образом.
    14. Место криопробирки внутри закрытой крышкой из пенополистирола коробки (это обеспечивает медленный скорость охлаждения, которая улучшает выживаемость клеток). Переведите поле морозильник-80 ° C в течение 24 часов перед передачей cryovial жидкого азота.
      Примечание: Для достижения наилучших результатов, свести к минимуму клеток подсчета времени, а также время между добавлением 2 x замораживания средств массовой информации к клеткам и передачи флаконы-80 ° C.

2. O9-1 клеточная культура

  1. Подготовить базальной СМИ для культуры клеток O9-1, добавив следующее в среде DMEM (окончательный концентрации указаны): 15% FBS, 0,1 мм минимум основных СМИ (MEM) заменимые аминокислоты, пируват натрия 1 мм, 55 мм бета меркаптоэтанол 100 ед/мл пенициллин, 100 ед/мл стрептомицин, 2 мм L-глютамином, 103 единиц/мл лейкемия ингибирующего фактора (LIF; добавил непосредственно перед использованием, не добавляйте в складе бутылку) и 25 нг/мл фибробластический фактор роста основные (bFGF; добавил непосредственно перед использованием, не добавляйте в складе бутылка).
  2. Фильтр стерилизовать базальной СМИ (поры размер 0,22 мкм) и заверните в фольгу для защиты от света.
  3. Соберите с кондиционерами базальной СМИ из инактивированных STO клеток.
    Примечание: Приступить только после получения инактивированных STO клетки. O9-1 базальных СМИ, собранных от STO сотовый плит далее именуемые как кондиционером базальной СМИ.
    1. Оттепель инактивированная STO клетки быстро, как описано выше (один cryovial, содержащих 4 х 106 клеток хорошо для одной 100 мм пластины и дает примерно 100 мл кондиционером базальной СМИ после 10 дней сбора). Семя инактивированная STO клетки к пластине желатин покрытием с помощью сто средств массовой информации. Позволяют клеткам прикрепить на ночь в стандартной увлажненные инкубатора (37 ° C, 5% CO2).
    2. 24 ч после отогрева клетки сто, отказаться от существующих средств массовой информации сто и замените базальной средств массовой информации.
      Примечание: Не добавляйте LIF и bFGF инактивированных STO клетки культуры блюда; только добавьте к блюдам культуры клеток O9-1.
    3. Каждые 24 ч, изменение средств массовой информации с помощью базальной СМИ O9-1 и собирать базальной СМИ от STO сотовый плит в бутылку. Оберните флакон, содержащий кондиционером базальной СМИ в фольгу для защиты от света. Хранить все собранные средства массовой информации при 4 ° C.
      Примечание: Потому что клетки были инактивированная, они могут не выглядеть так здоров, как они это делали после нескольких дней сбора; Это следовало ожидать.
    4. При необходимости проверить на загрязнение, соберите базальной средств массовой информации для каждой коллекции день в разных трубок (вместо одной бутылки), завернутый в фольгу. С помощью 24-ну плита, место 1 мл СМИ от каждый день в каждой скважине и инкубировать на ночь в стандартной инкубатор для проверки бактериального загрязнения под микроскопом.
      Примечание: Средства массовой информации остается красный цвет, если не загрязнение, но изменения в желтый при наличии бактериального загрязнения.
    5. После сбора кондиционером базальной СМИ на 10 дней, отбросить STO клетки. Комбинат (если применимо) все собранные условного базальной СМИ и фильтрации стерилизации (поры размер 0,22 мкм) в стерильных бутылку. Оберните бутылку в фольгу для защиты от света. Держите фильтрующий кондиционером базальной при 4 ° C для максимум один месяц с даты фильтра.

3. поддержание клеток O9-1

Примечание: Работа O9-1 базальных СМИ является фильтр стерилизованное кондиционером базальной СМИ, в которых Лиф (конечная концентрация 103 единиц/мл) и bFGF (конечная концентрация 25 нг/мл) добавляются непосредственно в клетки культуры блюдо перед использованием. Этот носитель должен быть защищен от света и хранить при 4 ° C.

  1. Восстановление клеток O9-1
    1. Медленно оттепели запасов бутылка базальной мембраны матрицы (например, Matrigel) на ночь при 4 ° C подготовить аликвоты.
    2. Добавьте 5 мл DMEM с 10% FBS до 5 мл запасов базальной мембраны матрицы мембраны. Смешайте хорошо закупорить с холодной наконечники хранятся при температуре-20 ° C. Держите оригинальный флакон и Алиготе трубы на льду. Заморозить аликвоты в разных томах (0,5 мл или 1 мл аликвоты) в зависимости от потребностей эксперимент. Избегайте замораживания оттаивания базальной мембраны матрица несколько раз.
      Примечание: базальной мембраны матрица polymerizes быстро при комнатной температуре; Использование холодной наконечники и держать трубы холодной при работе во избежание непреднамеренного полимеризации.
    3. Оттепель Алиготе базальной мембраны матрицы на 4 ° C или на льду 2 ч до начала эксперимента. Не храните матрица на 4 ° C на длительное время.
    4. Использовать фильтр стерилизации DMEM с 10% FBS разбавлять базальной мембраны матрицы до конечной концентрации 0.5 мг/мл для покрытия плит. Слой пластины с матрицей базальной мембраны (0.5 мг/мл) при комнатной температуре в течение 1 ч. Убедитесь, что она полностью покрывает пластины (как показано на рис. 1).
    5. Наклона пластины, когда аспирационных базальной мембраны матрицы не прикасайтесь к поверхности с покрытием; сухие пластины при 37 ° C за 30 мин. Не чрезмерно сухие пластины с покрытием.
      Примечание: Действовать, только когда все средства массовой информации и реагенты готовы к использованию (кондиционером базальной СМИ, стерильной фильтрации 10% FBS в среде DMEM, LIF и bFGF).
    6. Быстро восстановить клетки O9-1, поставив cryovial в ванну воды 37 ° C; медленно вихрем флакона до решения полностью превращается в жидкость и немедленно приступить к следующему шагу.
    7. Передать все решения клеток от cryovial (примерно 1 мл) 15 мл пластиковых пробирок. Добавить 5 томов DMEM с 10% FBS (фильтр стерилизованное с размером поры фильтра 0.22 мкм) и Ресуспензируйте.
    8. Центрифуги для 3 мин при 180 x g. Аспирационная супернатант не нарушая Пелле ячейки. Ресуспензируйте ячейки Пелле (нажав) в кондиционерами базальной СМИ, дополненная LIF и bFGF. Подсчет ячеек с помощью Горяева.
      Примечание: Кондиционером базальной СМИ, дополненная LIF и bFGF имеет решающее значение для поддержания multipotency клеточной линии O9-1. Использование уход добавить правильные средства массовой информации, чтобы избежать непреднамеренного клеточная дифференцировка.
    9. Семя клетки от 10 000 до 15 000 клеток/см2 пластины 6-хорошо. Позволяют клеткам для присоединения и расти в инкубатор культуры стандартной ячейки (37 ° C, 5% CO2) на ночь, перед изменением СМИ.
    10. Убедитесь, что клетки прикрепляются прежде чем изменить СМИ (прилагаемый здоровые клетки выглядят как те, показано на рисунке 2).
    11. Всегда измените культуру СМИ на следующий день после восстановления клеток O9-1 (использовать кондиционерами базальной СМИ дополнены с LIF и bFGF).
  2. Прохождение клеток O9-1
    1. Когда клетки O9-1 достигают 80% confluency, оттепель матрице базальной мембраны и подготовить матрицы покрытием плиты базальной мембраны, как описано выше. Добавьте кондиционером базальной СМИ, дополненная LIF и bFGF на судно. Кроме того добавьте DMEM без FBS держать базальной мембраны матрица от высыхания и хранить внутри Стандартный увлажненные инкубатор для не более чем 3 дней.
    2. Промойте O9-1-содержащих скважин (6-ну Латы) 2 мл Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS) дважды и аккуратно Пипетка, чтобы избежать потери клеток.
    3. Разбить ячейки с 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА при 37 ° C для нейтрализации трипсина 3 мин с равным количеством DMEM с 10% FBS. Неоднократно Пипетка жидкости по всей поверхности хорошо отмежеваться столько клетки от пластины как можно.
      Примечание: Концентрация трипсина составляет 0,05% вместо 0,25%. Используйте DPBS для разбавления от запасов бутылки.
    4. Избегайте генерации пузыри, когда отделения клетки от пластины.
    5. Передача всех клеток решение для пластиковых пробирок и центрифуги для 3 мин при 180 x g. Аспирационная супернатант не нарушая Пелле ячейки. Ресуспензируйте Пелле клеток в пластиковых пробирок, нежный дозирование в кондиционерами базальной СМИ, дополненная LIF и bFGF.
    6. Используйте Горяева для подсчета числа общей ячейки как описано выше. Семя клетки (10000 до 15000 клеток/см2) покрытием плиты, подготовленных как описано в шагах 3.1.4 для 3.1.8. Один хорошо пластины 6-ну потребует 100000 клеток семян.
    7. Позволяют клеткам для присоединения и расти в инкубатор культуры стандартной ячейки (37 ° C, 5% CO2). Всегда измените культуру СМИ на следующий день после пассированый O9-1 клетки.
  3. Замораживание клеток O9-1
    1. Готовить 2 x замораживания средств массовой информации для клеток O9-1, разбавленных в среде DMEM следующее (окончательный концентрации указаны): 40% FBS и 20% ДМСО.
    2. Фильтр стерилизовать 2 x замораживания средств массовой информации и держать его на 4 ° C. 2 x замораживания средств массовой информации должны производиться на тот день, когда он используется. Отменить все неиспользуемые замораживания средств массовой информации.
      Примечание: Заморозить O9-1 клетки на 80% confluency.
    3. Промыть скважин с DPBS дважды; Пипетка осторожно, чтобы не потерять клеток.
    4. Разбить ячейки с 0,05% трипсина ЭДТА при 37 ° C на 3 мин, а затем нейтрализовать трипсина с равным количеством 10% FBS в среде DMEM. Неоднократно Пипетка жидкости по всей поверхности хорошо отмежеваться столько клетки от пластины как можно.
    5. Передать все пластины содержимое трубки центрифуги и центрифуги для 3 мин при 180 x g. Аспирационная супернатант и добавить 2 мл PBS и Ресуспензируйте путем выстукивать.
    6. Использование 10 мкл раствора ячейки для подсчета клеток с помощью Горяева, как описано выше.
    7. Центрифуга клеток решение для 3 мин при 180 x g. Аспирационная супернатант и отрегулировать количество базальной СМИ необходимо; Затем добавьте равное количество 2 x замораживания средств массовой информации.
      Примечание: Клетки замораживаются в концентрации 1 х 106 клеток/мл (1 мл на cryovial).
    8. Передать криопробирки клетки и маркировать соответствующим образом. Место криопробирки внутри крышкой из пенополистирола коробки для медленной скорости охлаждения при температуре-80 ° C для по крайней мере 24 часа до перевода в жидкий азот.
      Примечание: Для достижения наилучших результатов, свести к минимуму клеток, считая и время между добавлением 2 x замораживания средств массовой информации и передачи флаконы-80 ° C.

4. манипуляция клеток O9-1

  1. Выполнение нокдаун малых интерферирующих РНК в клетках O9-1
    1. Оттепель и пальто 24-ну плита с базальной мембраны матрицы, как описано выше (шаги 3.1.4–3.1.8) до начала эксперимента. Восстановить и семян O9-1 клетки, что позволяет им расти до 60% до 80% confluency.
    2. Разбавьте липосомы в сыворотке свободных СМИ согласно соответствующим хорошо тома. Разбавьте малых интерферирующих РНК в сыворотке свободных СМИ в финал. Добавьте разбавленные siRNA разреженных липосомы в соотношении, рекомендованные производителем. Смешайте хорошо закупорить и инкубировать.
      Примечание: Следуйте руководство изготовителя на тома, время и температуры инкубации.
    3. Добавьте соответствующий объем малых интерферирующих РНК липидного комплекса в ячейки в соответствии с рекомендациями изготовителя.
    4. Инкубируйте клетки для 24 h в инкубатор культуры стандартной ячейки (37 ° C, 5% CO2). Вниз по течению выполните как соответствующие (экстракт РНК, белков экстракта, окрашивание, и т.д.)
      Примечание: нокдаун раз siRNA и концентрации могут варьироваться в зависимости от индивидуальных эксперимент.
  2. Выполнение Нокаут гена в клетках O9-1 с помощью изменения генома ТРИФОСФАТЫ-Cas9
    Примечание: Обратитесь к ранее опубликованным протокол для использования ТРИФОСФАТЫ-Cas9 в mammalian клетки линии29. Условии вот Упрощённое описание изменения генома ТРИФОСФАТЫ-Cas9 и соответствующие шаги.
    1. Получите sgRNA последовательностей с помощью средства разработки sgRNA.
    2. Перевязать sgRNA к pSpCas9 (bb) - 2а - GFP вектор30.
    3. Transfect клетки O9-1 с вектором с использованием стандартного липофекция протокола согласно рекомендациям изготовителя.
    4. Инкубируйте клетки в инкубатор культуры стандартной ячейки при 37 ° C с 5% CO2 на 24 часа.
    5. Выполните, активируемых флуоресценции клеток сортируя (FACS) на основании GFP/7-AAD. Семя GFP + отдельные ячейки в 96-луночных пластины.
    6. Рост клеток в инкубаторе для дополнительного 4 дней. Отменить все скважины, которые имеют более одной колонии.
    7. Выполните ПЦР с праймерами, предназначенных для обнаружения удаления. После ПЦР Запуск продуктов ПЦР на геле агарозы для оценки размера группы. Проверка нокаут эффективность достигнута с помощью ТРИФОСФАТЫ-Cas9 editingby, выполняя Западный blotting (на рисунке 3приведен пример результатов Yap нокаут).

5. O9-1 клеточная дифференцировка

  1. Дифференцировка клеток O9-1 в остеобласты
    1. Подготовить Остеогенные дифференциация СМИ, разбавленных в альфа MEM следующее (окончательный концентрации указаны): дексаметазона 0,1 мм, 100 нг/мл костный морфогенетический белок 2 (БМП2), аскорбиновая кислота 50 мкг/мл, 10 мм b метронидазол, 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мг/мл.
    2. Обнаружить маркер остеобластов, остеокальцин, дифференцированной остеобластов, иммуноокрашивания, как показано на рисунке 4.
      Примечание: Остеогенные дифференциация также могут оцениваться с помощью других маркеров остеобластов или с ализарин красный пятнать или щелочной фосфатазы пятнать.
  2. Дифференцировка клеток O9-1 в хрящевые клетки
    1. Подготовить СМИ дифференциацию хондроцитов, разбавленных в альфа MEM следующее (окончательный концентрации указаны): 5% плода телячьей сыворотки (FCS), 1% инсулина трансферрина селен (СТС), 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 мг/мл, 10 нг/мл преобразования фактор роста бета (TGF-b3), аскорбиновая кислота 50 мг/мл, 10 нг/мл БМП2, дексаметазона 0,1 мм и пируват натрия 1 мм.
    2. Первые культуры в монослое O9-1 клетки с Остеогенные СМИ для 3 дней и затем trypsinize и культура в формате micromass в СМИ дифференциацию хондроцитов еще 7 дней.
    3. Дифференциация хондрогенном ослов с Альциановый синий пятнать или маркеры хондроцитов.
  3. Дифференцировка клеток O9-1 в гладкомышечные клетки
    1. Подготовить СМИ дифференцировки клеток гладких мышц, разбавленных в среде DMEM следующее (окончательный концентрации указаны): 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 мкг/мл и 10% FBS.
    2. Дифференцировки клеток гладких мышц ослов с иммунофлюоресценции, окрашивание с помощью антител против маркеры гладких мышечных клеток, таких как актин гладких мышц (SMA), показано в качестве примера на рисунке 5.
  4. Дифференцировка клеток O9-1 в глиальных клеток
    1. Подготовить глиальных клеток дифференциация СМИ, разбавленных в среде DMEM/F12 следующее (окончательный концентрации указаны): 1 x B-27 дополнение, 2 мм L-глютамином, 50 нг/мл БМП2, 100 ед/мл пенициллин, 100 мг/мл стрептомицина, LIF 50 нг/мл и 1% тепло инактивированная FBS.
    2. Оцените глиальных клеток, выполняя иммунофлюоресценции, окрашивание с антителами против глиальных клеток маркеры, такие как белок, связывающий жирные кислоты 7 (FABP7).

Результаты

Цель наших нокдаун и нокаут экспериментов было изучение последствий яп и таз -из функция потерь в клетках O9-1. До бросовым и нокаут эксперименты мы должны убедиться, что подготовиться к базальной СМИ и культуры O9-1 клетки как описано выше (например, базальной ме...

Обсуждение

НКК является универсальным и ключевой вклад различных тканей и органов во время эмбрионального морфогенеза. O9-1 клеточная линия ведет свой потенциал, чтобы дифференцироваться в много различных типов клеток и имитирует в vivo характеристики СЧД, что делает его полезным в vitro инс?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Николь ШТАНСЕЛЬ, Ph.D., ELS, научных публикаций в институте сердца Texas, условии редакционной поддержки. Мы также благодарим следующие источники финансирования: Американской ассоциации сердца Национальный центр ученый развития Грант (14SDG19840000 J. Wang), 2014 Лоуренс исследования награда от Rolanette и Berdon Лоуренс кости болезни программа Техас (J. Wang ) и национальных институтов здравоохранения (DE026561 и DE025873 J. Wang, DE016320 и DE019650 на р. Maxson).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Active STO feeder cellsATCCATCC CRL-1503Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X
O9-1 mouse cranial neural crest cell lineMillipore SigmaSCC049
DMEM, high glucose, no glutamineGibco11960-044
DMEM, high glucoseHycloneSH30243.01
FBS (fetal bovine serum)Millipore SigmaES-009-B
Penicillin - streptomycinGibco15140-122
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
Gelatin from porcine skinSigmaG1890
Trypsin-EDTA 0.25% in HBSSGenesee Scientific25-510
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesiumLonza17-512F
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100XxGibco11140-050
Sodium pyruvate (100 mM)Gibco11360-070
2-MercaptoethanolSigmaM-7522
ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/mLMillipore SigmaESG1106
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)R&D Systems233-FB-025
Mitomycin CRoche10107409001
Matrigel matrixCorning356234
DMSO (dimethylsulfoxide)Millipore SigmaMX1458-6
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778-075
Opti-MEM I (1x)Gibco31985-070
Minimum essential medium, alpha 1x with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamineCorning10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNADharmaconL-041057
ON-TARGETplus Non-targeting PoolDharmaconD-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNADharmaconL-046247
FCS (fetal calf serum)
ITS (insulin-transferrin-selenium)
TGF-b3
Ascorbic acid
BMP2 (bone morphogenetic protein 2)
Dexamethasone
B-27 supplement

Ссылки

  1. Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
  2. Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
  3. Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
  4. Cordero, D. R., et al. Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development. American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).
  5. Trainor, P. A. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).
  6. Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. The neural crest migrating into the twenty-first century. Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).
  7. Zurkirchen, L., Sommer, L. Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells. Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).
  8. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).
  9. Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. Induction of the neural crest: a multigene process. Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).
  10. Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).
  11. Raible, D. W. Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways. Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).
  12. Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).
  13. Henion, P. D., Weston, J. A. Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage. Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).
  14. Harris, M. L., Erickson, C. A. Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).
  15. Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages. Development. 130 (2), 321-330 (2003).
  16. Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. Analysis of early human neural crest development. Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).
  17. Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers. Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).
  18. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  19. Yumoto, K., et al. TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells. Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).
  20. Wang, J., et al. Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development. Development. 143 (3), 504-515 (2016).
  21. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
  22. Wang, J., Martin, J. F. Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).
  23. Pan, D. The hippo signaling pathway in development and cancer. Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).
  24. Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).
  25. Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues. Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).
  26. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  27. Moya, I. M., Halder, G. The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs. Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).
  28. Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
  29. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).
  30. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  31. Manderfield, L. J., et al. Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest. Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).
  32. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6, 23208 (2016).
  33. Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development. International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).
  34. Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).
  35. Kang, B. J., et al. Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).
  36. Uemura, M., et al. Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.

Step 2.1 was updated from:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

to:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

Step 5.1.1 was updated from:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.

to:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.

Step 5.2.1 was updated from:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

to:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

Step 5.4.1 was updated from:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

to:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

140Cas9O9 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены