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Riepilogo

O9-1 è una linea di cellule neurali della cresta multipotenti del mouse. Qui descriviamo protocolli dettagliati passo-passo per la coltura delle cellule O9-1, O9-1 cellule differenziate in tipi cellulari specifici e manipolando geneticamente O9-1 cellule utilizzando siRNA-mediata atterramento o CRISPR-Cas9 editing genomico.

Abstract

Cellule della cresta neurale (NCCs) esegue la migrazione di cellule staminali multipotenti che possono differenziarsi in diversi tipi cellulari e dar luogo a più organi e tessuti. La linea cellulare O9-1 è derivata dall'endogeno del mouse NCCs embrionali e mantiene la sua multipotenza. Tuttavia, in condizioni di impostazioni cultura specifiche, O9-1 cellule possono differenziarsi in diversi tipi cellulari ed essere utilizzate in una vasta gamma di applicazioni di ricerca. Recentemente, con la combinazione di studi del topo e gli studi di O9-1 delle cellule, abbiamo dimostrato che l'ippopotamo effettori della via di segnalazione Yap e Taz svolgono i ruoli importanti nello sviluppo craniofacial di derivazione dalla cresta neurale. Anche se il processo coltivante per cellule O9-1 è più complicato rispetto a quella utilizzata per altre linee cellulari, la linea cellulare O9-1 è un potente modello per indagare NCCs in vitro. Qui, presentiamo un protocollo per la coltura la linea cellulare O9-1 per mantenere la sua staminalità, così come protocolli per la differenziazione di cellule O9-1 in tipi differenti delle cellule, quali cellule muscolari lisce e osteoblasti. Inoltre, vengono descritti protocolli per l'esecuzione di studi di perdita di funzione del gene in cellule O9-1 utilizzando CRISPR-Cas9 eliminazione e piccola interferenza RNA-mediata atterramento.

Introduzione

Cellule della cresta neurale (NCCs) sono cellule simil-staminali multipotenti con una notevole capacità migratorie ed esistenza transitoria durante lo sviluppo embrionale. NCCs provengono tra l'ectoderma superficiale e il tubo neurale e migra in altre parti dell'embrione durante lo sviluppo embrionale1. Basato sui loro domini funzionali, CNC possono essere classificati in vari tipi, tra cui cranica, tronco, vagale, sacra e NCCs cardiaco. Inoltre, NCCs possono differenziarsi in stirpi multipli delle cellule, quali cellule muscolari lisce, cellule ossee e neuroni e dar luogo a vari tessuti2,3. Lo sviluppo di CNC è caratterizzato da una serie complessa di eventi morfogenetici che sono messo a punto da vari segnali molecolari. Data la complessa regolazione del CNC e loro importanti contributi di numerose strutture, l'alterazione dello sviluppo di NCC può portare comunemente ai difetti di nascita congeniti, che rappresentano quasi il 30% di tutti i difetti di nascita umani congeniti. Anomalie durante lo sviluppo neurale della cresta possono portare a labio/palatoschisi, imperfetta formazione di naso, sindromi, difetti come un tratto di efflusso cardiaco difettoso, o mortalità infantile anche1,4,5, 6 , 7. la comprensione dei meccanismi molecolari dello sviluppo di NCC è importante per lo sviluppo di trattamenti per malattie causate da difetti nello sviluppo di NCC. Con l'uso di vari in vitro e in vivo si avvicina8,9,10,11,12,13,14 ,15, notevoli progressi compiuti nella ricerca di NCC. In vivo, modelli animali, compresi polli, anfibi, zebrafish e topi, sono stati utilizzati per indagare NCCs1. Inoltre, gli embrioni umani sono stati utilizzati per studiare il processo di migrazione di NCC in iniziali di sviluppo dell'embrione umano16. In vitro, modelli cellulari per CNC, come NCCs umana che ha originato dal paziente grasso sottocutaneo, sono stati utilizzati per studiare la malattia del Parkinson17. La linea NCC O9-1, che originalmente è stata derivata dalle colture di massa di endogeno NCCs isolato dal E8.5 del mouse embrioni18, è un modello di cellulare potente per studiare NCCs. soprattutto, in condizioni di coltura non-differenziante, cellule O9-1 sono NCCs simil-staminali multipotenti. Tuttavia, in diverse condizioni di coltura, le cellule O9-1 possono essere differenziate in tipi distinti delle cellule, quali cellule di muscolo liscio, osteoblasti, condrociti e di cellule gliali18. Date queste caratteristiche, cellule O9-1 sono stati largamente utilizzate per studi di NCC-correlati, quali indagare il meccanismo molecolare di difetti cranio-facciali19,20.

Qui, protocolli dettagliati sono forniti per mantenimento O9-1 delle cellule, differenziazione cellule O9-1 in diversi tipi cellulari e manipolare cellule O9-1 eseguendo studi di perdita di funzione del gene con CRISPR-Cas9 editing genomico e piccolo RNA interferente (siRNA)- mediate tecnologie atterramento. Come un esempio rappresentativo, l'uso delle cellule O9-1 per studiare Yap e Taz perdita di funzione è descritto. Yap e Taz sono gli effettori a valle del Hippo segnalazione via, che svolge un ruolo critico nella proliferazione cellulare, differenziamento e apoptosi. Il pathway di Hippo ha anche dimostrato di essere importante nello sviluppo e nell'omeostasi di parecchi diversi tessuti e organi, così come nella patogenesi di diverse malattie20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. I componenti principali di Hippo segnalazione includono la chinasi 20-like sterile di tumore soppressore Mst1/2, proteina impalcatura WW dominio contenenti Salvador e le chinasi di grande tumore soppressore dell'omologo (Lats1/2). Ippopotamo di segnalazione inibisce l'attività di Yap e Taz e promuove la loro degradazione nel citoplasma. Senza repressione da ippopotamo, Yap Taz traslocano in nuclei e può funzionare come co-attivatori trascrizionali. Recentemente abbiamo dimostrato che in particolare inattivando l'ippopotamo segnalazione effettori Yap e Taz nel topo NCCs utilizzando il Wnt1cre e Wnt1Cre2SOR driver ha provocato la mortalità embrionale alle e 10.5 con grave i difetti craniofacial20. Abbiamo anche effettuato studi usando le cellule O9-1 per studiare il ruolo di Yap e Taz in CNC. Per studiare la funzione Yap e Taz in NCC proliferazione e differenziazione, Yap e Taz atterramento cellule sono state generate in cellule O9-1 utilizzando siRNA e Yap knockout cellule sono state generate utilizzando CRISPR-Cas9 editing genomico. Le stesse strategie di perdita-de-funzione del gene possono essere applicate a geni bersaglio diversi in altre vie. Inoltre, guadagno di funzione studi e saggi di transfezione possono anche applicarsi alle cellule O9-1 per studiare la regolazione e la funzione del gene. I protocolli descritti qui sono destinati ad essere utilizzati dagli investigatori come guide per la coltura di cellule O9-1 per mantenere la staminalità multipotenti, per differenziare le cellule O9-1 in altri tipi cellulari sotto differenti condizioni di coltura e per lo studio della funzione genica e i meccanismi molecolari di CNC.

Protocollo

1. preparazione prima di coltura cellulare O9-1

Nota: Basale media utilizzati per la coltura cellulare O9-1 deve sono stati condizionati da Sandos inbred topi tioguanina/uabaina-resistente (STO) del fibroblasto cellule di topo; di conseguenza, STO celle devono essere ottenuti e preparato come descritto di seguito prima di iniziare la coltura cellulare O9-1.

  1. Cultura di cella attiva STO
    1. Preparare i supporti per coltura cellule attive STO facendo completa di Dulbecco modificato media dell'Aquila (DMEM) con 7% siero bovino fetale (FBS) (grado di cultura di cellule staminali embrionali), 100 U/mL penicillina, 100 µ g/mL streptomicina e 2 mM L-Glutammina (concentrazioni finali sono indicati).
      Nota: STO mezzo è usato per la coltivazione di cellule di alimentatore STO attive. Penicillina, streptomicina e L-Glutammina possono formare precipitazioni in deposito; sciogliere completamente pipettando prima dell'uso.
    2. Cappotto in una piastra di coltura cellulare standard da 100 mm con 0,1% di gelatina per 30 min a temperatura ambiente. Dopo il periodo di incubazione, aspirare la gelatina extra. Utilizzare la piastra immediatamente dopo la verniciatura.
      Nota: In alternativa, coprire la piastra con media STO e lasciare la piastra in un incubatore per evitare l'essiccazione della piastra (questo è significato solo per l'archiviazione a breve termine e non per la memorizzazione di piastre preverniciati).
    3. Scongelare le cellule STO rapidamente in bagnomaria a 37 ° C; pulire il cryovial con etanolo al 70% prima dell'apertura e trasferire immediatamente la fiala intera di cellule in una provetta per centrifuga.
    4. Aggiungere goccia a goccia i media STO la provetta da centrifuga; il rapporto di volume delle cellule ai media è 01:10.
    5. Centrifugare le cellule a 180 x g per 3 minuti a TA.
    6. Mescolare dolce cellule pipettaggio e trasferimento alla piastra rivestite con gelatina.
    7. Permettono che le cellule STO crescere per 24 h in un incubatore standard (37 ° C, 5% CO2).
    8. Modificare il mezzo (solo dopo che le cellule aderiscono) 24 h dopo la semina e scartare il vecchio mezzo.
    9. Controllare le cellule STO ogni giorno sotto un microscopio e un passaggio al confluency di 80%.
      1. Prima di iniziare STO cellulare passaggio, cappotto piastre con 0,1% di gelatina (gelatina volume equivale a metà del volume di mezzi di crescita per tale nave) per 30 min a temperatura ambiente.
      2. Per passaggio cellule STO, crescita media di aspirare e lavare le cellule con tampone fosfato salino (PBS) due volte (aggiungere PBS in un volume uguale di media di crescita).
      3. Aspirare la PBS e aggiungere 0,25% tripsina-EDTA (regolazione del volume in base alle dimensioni della nave); quindi, incubare a 37 ° C per 5 min.
        Nota: Per un piatto di 100 mm, utilizzare 10 mL di coltura e 3 mL di soluzione di tripsina. Per un piatto di 150 mm, utilizzare 20 mL di coltura e 8 mL di soluzione di tripsina. Il volume di tampone di lavaggio utilizzato è uguale al volume di crescita media.
      4. Inattivare tripsina con un volume uguale di media STO. Cellule STO seme a nuovi piatti con un rapporto da 1:3 a 01:10.
        Nota: Un sistema di espansione comune è quello di espandere da un cryovial in un piatto di 100 mm, poi a una piastra di 150 mm, poi a quattro piastre di 150 mm e infine a 16 piastre di 150 mm.
  2. Inattivazione e congelamento delle cellule STO
    1. Per la preparazione di 2 x media di congelamento, aggiungere quanto segue alla media STO (le concentrazioni finali sono indicate): 20% FBS, 20% di dimetilsolfossido (DMSO).
    2. Dopo la miscelazione, filtro sterilizzare 2x congelamento media (poro dimensioni 0,22 µm) e conservarlo a 4 ° C fino all'utilizzo. Fai 2 x congelamento media nello stesso giorno di usare ed eliminare i supporti non utilizzati di congelamento.
    3. Preparare la soluzione di mitomicina C in PBS ad una concentrazione di 0,5 mg/mL. Per dissolvere la mitomicina C in PBS, nastro la bottiglia su un Vortex e vortex a bassa impostazione per circa 45 min per sciogliere le particelle completamente.
      Nota: Mitomycin C è luce sensibile e difficile da sciogliere.
      Attenzione: Mitomycin C è acutamente tossico e può provocare il cancro. Gestire solo con dispositivi di protezione personale.
    4. Inattivare le cellule STO aggiungendo una concentrazione finale di mitomicina C di 0,01 mg/mL ai media esistenti. Incubare per 2 h all'interno di un incubatore standard (37 ° C, 5% CO2).
    5. Lavare le piastre (150 mm) con 20 mL di PBS due volte dopo inattivazione con mitomicina C.
    6. Aspirare la soluzione di PBS, dissociare le cellule utilizzando 8 mL di tripsina-EDTA 0.25% e incubare per 5 minuti all'interno di un incubatore standard (37 ° C, 5% CO2).
    7. Inattivare tripsina con 8 mL di media STO.
    8. Trasferire la soluzione di cella in una provetta da centrifuga. Combinare più di un piatto in una provetta da centrifuga per risparmiare tempo. Centrifugare per 5 min a 180 x g.
    9. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di PBS.
    10. Utilizzare 10 µ l della soluzione cella per contare le celle utilizzando un emocitometro. Contare le celle in Piazza griglia centrale e moltiplica il numero ottenuto dal 104 per determinare il numero di cellule per mL 1. Contare due volte e la media dei due numeri per ottenere la stima finale del numero di cellule per millilitro.
    11. Centrifugare le cellule per 5 min a 180 x g.
    12. Aspirare la PBS e aggiungere media STO 1:1 (in volume) e 2 x congelamento il pellet cellulare. Regolare il volume per una concentrazione finale di cella di 4 x 106 cellule/mL (questo importo è buono per un piatto di 100 mm).
      Nota: ad esempio, da quattro piatti di 150 mm ottenendo un totale di 60 x 106 celle, congelare 4 x 106 cellule per cryovial, con ogni cryovial contenente 1 mL di soluzione di cella. Quattro piastre resa circa 15 cryovials (60/4 = 15). Aggiungere 7,5 mL di media STO e 7,5 mL di 2 x congelare media per il pellet cellulare e risospendere le aliquota da 1 mL in ogni cryovial.
    13. Risospendere pipettando lentamente congelamento media con pellet cellulare. Trasferire 1 mL di soluzione di cella in ogni cryovial ed etichetta di conseguenza.
    14. Inserire cryovials all'interno di una scatola di polistirolo con coperchio (questo fornisce una velocità di raffreddamento lenta, che migliora la sopravvivenza delle cellule). Trasferire la casella per un congelatore-80 ° C per almeno 24 h prima di trasferire il cryovial in azoto liquido.
      Nota: Per risultati ottimali, ridurre al minimo la cella conteggio tempo, come pure il tempo tra aggiungendo 2 x congelamento media alle cellule e trasferimento fiale a-80 ° C.

2. coltura delle cellule O9-1

  1. Preparare i supporti basali per la coltura cellulare O9-1 aggiungendo quanto segue in DMEM (le concentrazioni finali sono indicate): 15% FBS, 0,1 mM media minimo essenziale (MEM) aminoacidi non essenziali, piruvato di sodio di 1 mM, 55 mM beta-mercaptoetanolo, 100 U/mL di penicillina, 100 U/mL streptomicina, 2 mM L-Glutammina, 10 fattore inibitorio di3 unità/mL leucemia (LIF; aggiunta immediatamente prima dell'uso, non aggiungere alla bottiglia di stock) e 25 ng/mL fibroblasto fattore di crescita-di base (bFGF; aggiunta immediatamente prima dell'uso, non aggiungere alla bottiglia di stock).
  2. Filtro sterilizzare i media basali (poro dimensioni 0,22 µm) e avvolgere in un foglio per proteggere dalla luce.
  3. Raccogliere media basale condizionati dalle cellule STO inattivate.
    Nota: Procedere solo dopo aver ottenuto le cellule STO inattivate. O9-1 basale media raccolto da STO cell piastre è appresso come media basale condizionati.
    1. Disgelo inattivato cellule STO rapidamente come descritto in precedenza (uno cryovial contenente 4 x 106 cellule è buono per un piatto di 100 mm e produce circa media basale 100ml condizionata dopo 10 giorni di raccolta). Seme inattivato cellule STO alla piastra rivestite con gelatina utilizzando supporti di STO. Consentire alle cellule di allegare una notte in un incubatore standard (37 ° C, 5% CO2).
    2. 24 h dopo lo scongelamento cellule STO, scartare il media STO esistenti e sostituirli con i media basali.
      Nota: Non aggiungere LIF e bFGF inattivati piastre di coltura cellulare STO; aggiungere solo a piastre di coltura cellulare O9-1.
    3. Ogni 24 h, cambiare supporto utilizzando media basale O9-1 e raccogliere i media basali da STO cell piastre in una bottiglia. Avvolgere la bottiglia contenente media condizionati basale in carta stagnola per proteggere dalla luce. Conservare tutti i supporti raccolti a 4 ° C.
      Nota: Poiché le cellule sono state inattivate, essi potrebbero non essere sani come hanno fatto dopo alcuni giorni di raccolta; Questo è da aspettarselo.
    4. Facoltativamente, per verificare la contaminazione, raccogliere i media basali per ogni giorno di raccolta in tubi diversi (invece di una bottiglia) avvolti in carta stagnola. Utilizzando una piastra a 24 pozzetti, posizionare 1 mL di media da ogni giorno in ogni pozzetto e incubare per una notte in un incubatore standard per verificare la contaminazione batterica al microscopio.
      Nota: I media rimane un colore rosso se non c'è contaminazione non modifiche al giallo se la contaminazione batterica è presente.
    5. Dopo aver raccolto condizionata media basale per 10 giorni, scartare le cellule STO. Mietitrebbia (se applicabile) tutti raccolti condizionale media basale e filtro sterilizzare (poro dimensioni 0,22 µm) in una bottiglia sterile. Avvolgere la bottiglia in carta stagnola per proteggere dalla luce. Mantenere il media basali condizionati filtrati a 4 ° C per un massimo di un mese dalla data di filtro.

3. mantenimento delle cellule O9-1

Nota: Lavorando O9-1 media basale è filtro sterilizzato condizionata media basale, a quale LIF (concentrazione finale 103 unità/mL) e bFGF (concentrazione finale 25 ng/mL) sono aggiunti immediatamente al piastra di coltura cellulare prima dell'uso. Questo supporto deve essere protetto dalla luce e conservato a 4 ° C.

  1. Recupero delle cellule O9-1
    1. Lentamente di scongelare la bottiglia stock della matrice della membrana dello scantinato (ad es., Matrigel) durante la notte a 4 ° C per preparare aliquote.
    2. Aggiungere 5 mL di DMEM con 10% FBS a 5 mL della membrana matrice stock della membrana dello scantinato. Mescolare bene il pipettaggio con puntali freddo conservati a-20 ° C. Mantenere i tubi originali di bottiglia e aliquota sul ghiaccio. Congelare aliquote in diversi volumi (aliquote di mL 0,5 o 1 mL) a seconda delle esigenze di esperimento. Evitare congelamento-scongelamento matrice della membrana basale più volte.
      Nota: la matrice della membrana basale si polimerizza rapidamente a temperatura ambiente; utilizzare puntali freddo e mantenere freddo tubi quando si lavora per evitare la polimerizzazione non intenzionale.
    3. Scongelare un'aliquota della matrice della membrana basale a 4 ° C o sul ghiaccio 2 h prima di iniziare l'esperimento. Non conservare la matrice a 4 ° C per un tempo prolungato.
    4. Utilizzare il filtro sterilizzato DMEM con 10% FBS per diluire la matrice della membrana basale a una concentrazione finale di 0,5 mg/mL per rivestire le piastre. Piastre di cappotto con la matrice della membrana basale (0,5 mg/mL) a temperatura ambiente per 1 h. Assicurarsi che copre completamente la piastra (come mostrato nella Figura 1).
    5. Inclinare il piatto quando aspirando la matrice della membrana basale per evitare di toccare la superficie rivestita; asciugare le piastre a 37 ° C per 30 min. Non asciugare troppo piastre.
      Nota: Procedere solo quando tutti i media e i reagenti sono pronti per l'uso (condizionata media basale, sterile filtrata 10% FBS in DMEM, LIF e bFGF).
    6. Recuperare rapidamente O9-1 cellule collocando il cryovial in bagnomaria a 37 ° C; lentamente il flaconcino di turbinio finché la soluzione completamente si trasforma in liquido e procedere immediatamente alla fase successiva.
    7. Trasferire tutta la soluzione di cella da cryovial (circa 1 mL) in una provetta da centrifuga da 15 mL. Aggiungere 5 volumi di DMEM con 10% FBS (filtro sterilizzato con un formato del poro di filtro di 0,22 µm) e risospendere.
    8. Centrifugare per 3 min a 180 x g. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare. Risospendere il pellet cellulare (toccando) in media basale condizionati completati con LIF e bFGF. Contare le celle utilizzando un emocitometro.
      Nota: Media basale condizionati completato con LIF e bFGF è fondamentale per mantenere la multipotenza della linea cellulare O9-1. Prestare molta attenzione per aggiungere il supporto corretto per evitare involontarie differenziamento.
    9. Cellule di seme da 10.000 a 15.000 cellule/cm2 per una piastra a 6 pozzetti. Permettono alle cellule di allegare e crescere in un'incubatrice di coltura cellulare standard (37 ° C, 5% CO2) notte prima sostituzione del supporto.
    10. Assicurarsi che le celle siano collegate prima di procedere a cambiare supporto (cellule allegate sano sguardo come quelli mostrati nella Figura 2).
    11. Sempre cambiare mezzi di coltura il giorno successivo dopo il recupero delle cellule O9-1 (utilizzare media basale condizionati completati con LIF e bFGF).
  2. Passaggio delle cellule O9-1
    1. Quando le cellule O9-1 raggiungono 80% confluency, scongelare la matrice della membrana basale e preparare un piatto di rivestite con matrice della membrana dello scantinato come descritto sopra. Aggiungere media basale condizionati completati con LIF e bFGF alla nave. In alternativa, aggiungere DMEM senza FBS per mantenere la matrice della membrana basale da essiccazione e memorizzare all'interno di un incubatore umidificato standard per non più di 3 giorni.
    2. Lavare i pozzetti contenenti O9-1 (6-pozzetti) con 2 mL di soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) due volte e pipettare delicatamente per evitare la perdita di cellule.
    3. Dissociare le cellule con 1 mL di tripsina-EDTA 0,05% a 37 ° C per 3 min. neutralizzare tripsina con una quantità uguale di DMEM con 10% FBS. Pipettare ripetutamente il liquido su tutta la superficie del pozzo per dissociare il numero di celle dalla piastra come possibile.
      Nota: La concentrazione di tripsina è 0.05% invece di 0,25%. Utilizzare DPBS per diluire dalla bottiglia stock.
    4. Evitare di generare bolle quando dissociare le cellule dalla piastra.
    5. Trasferire tutti i cellulare soluzione in una provetta da centrifuga e centrifugare per 3 min a 180 x g. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare. Risospendere il pellet cellulare nella provetta da centrifuga delicata pipettando in media basale condizionati completati con LIF e bFGF.
    6. Utilizzare un emocitometro per contare il numero totale delle cellule come descritto sopra. Cellule di seme (10.000-15.000 cellule/cm2) alla piastra rivestita preparato come descritto ai punti 3.1.4 a 3.1.8. Un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti richiederebbe 100.000 cellule per seme.
    7. Consentire alle cellule di allegare e crescere in un'incubatrice di coltura cellulare standard (37 ° C, 5% CO2). Sempre cambiare mezzi di coltura il giorno successivo dopo il passaggio di cellule O9-1.
  3. Congelamento delle cellule O9-1
    1. Per preparare 2 x supporti per O9-1 celle di congelamento, diluire in DMEM i seguenti (le concentrazioni finali sono indicate): 40% FBS e 20% DMSO.
    2. Filtro sterilizzare 2 x media di congelamento e tenerlo a 4 ° C. 2x supporti di congelamento deve essere effettuato il giorno che è usato. Eliminare tutti i supporti non utilizzati di congelamento.
      Nota: Congelare le cellule O9-1 al 80% confluency.
    3. Lavare i pozzetti con DPBS due volte; Pipettare delicatamente per evitare la perdita di cellule.
    4. Dissociare le cellule con tripsina-EDTA 0,05% a 37 ° C per 3 min, quindi neutralizzare la tripsina con una pari quantità di 10% FBS in DMEM. Pipettare ripetutamente il liquido su tutta la superficie del pozzo per dissociare il numero di celle dalla piastra come possibile.
    5. Trasferire tutti i contenuti di piastra per un tubo da centrifuga e centrifugare per 3 min a 180 x g. Aspirare il supernatante e aggiungere 2 mL di PBS e risospendere toccando.
    6. Utilizzare 10 µ l di soluzione di cella per contare le celle utilizzando un emocitometro, come descritto in precedenza.
    7. Centrifugare la soluzione di cella per 3 min a 180 x g. Aspirare il supernatante e regolare la quantità di supporti basale necessari; quindi, aggiungere una quantità uguale di 2 media di congelamento di x.
      Nota: Le cellule sono congelate ad una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL (1 mL / cryovial).
    8. Trasferire le cellule cryovials ed etichetta di conseguenza. Posto cryovials all'interno di una scatola di polistirolo con coperchio per una lenta velocità di raffreddamento a-80 ° C per almeno 24 h prima del trasferimento all'azoto liquido.
      Nota: Per risultati ottimali, ridurre al minimo la cella contando il tempo e il tempo tra l'aggiunta di 2 x media di congelamento e il trasferimento di fiale a-80 ° C.

4. manipolazione delle cellule O9-1

  1. Esecuzione di siRNA atterramento in cellule O9-1
    1. Scongelare e ricoprire una piastra a 24 pozzetti con matrice della membrana basale come descritto sopra (punti 3.1.4–3.1.8) prima di iniziare l'esperimento. Recuperare e O9-1 le cellule, permettendo loro di crescere al 60% al 80% confluenza di seme.
    2. Diluire i liposomi in media senza siero secondo il volume ben appropriato. Diluire siRNA in media privo di siero per la finale. Aggiungere diluito siRNA liposomi diluiti in un rapporto consigliato dal produttore. Mescolare bene pipettando e incubare.
      Nota: Seguire la guida del produttore sul volume utilizzato, tempo e temperatura di incubazione.
    3. Aggiungere un volume adeguato di siRNA-lipidico complesso alle celle secondo le raccomandazioni del produttore.
    4. Incubare le cellule per 24 h in un'incubatrice di coltura cellulare standard (37 ° C, 5% CO2). Procedere a valle come appropriato (Estratto RNA, Estratto di proteine, colorazione, ecc.)
      Nota: le concentrazioni e siRNA atterramento volte possono variare a seconda dell'esperimento individuo.
  2. Esecuzione di knockout del gene in cellule O9-1 tramite l'editing genomico CRISPR-Cas9
    Nota: Fare riferimento al protocollo pubblicato in precedenza per l'utilizzo di CRISPR-Cas9 in cellule di mammifero linee29. Fornito qui è una descrizione semplificata del CRISPR-Cas9 editing genomico e passaggi correlati.
    1. Ottenere sgRNA sequenze utilizzando uno strumento di progettazione sgRNA.
    2. Legare il sgRNA a pSpCas9 (bb) - 2a - GFP vector30.
    3. Transfect O9-1 cellule con il vettore utilizzando un protocollo standard lipofezione secondo le raccomandazioni del produttore.
    4. Incubare le cellule in un'incubatrice di coltura standard cellulare a 37 ° C con 5% CO2 per 24 h.
    5. Eseguire fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) basato su GFP/7-AAD. Seme GFP + cellule singole in piastre da 96 pozzetti.
    6. Crescere le cellule in incubatrice per altri 4 giorni. Scarta tutti i pozzi che hanno più di una colonia.
    7. Eseguire PCR con primers disegnati per rilevare l'eliminazione. Dopo la PCR, è necessario eseguire i prodotti di PCR su un gel di agarosio per valutare la dimensione di banda. Convalidare l'efficienza di eliminazione diretta ottenuta utilizzando CRISPR-Cas9 editingby esecuzione di Western blotting (nella Figura 3è riportato un esempio di risultati di Yap knockout).

5. differenziazione delle cellule O9-1

  1. Differenziazione delle cellule O9-1 in osteoblasti
    1. Per preparare i supporti di differenziamento osteogenico, diluire in alfa-MEM i seguenti (le concentrazioni finali sono indicate): desametasone 0,1 mM, 100 proteina morfogenetica dell'osso 2 (BMP2) ng/mL, 50 µ g/mL di acido ascorbico, b-glicerofosfato di 10 mM, 10% FBS, 100 U/mL penicillina e streptomicina 100 mg/mL.
    2. Rilevare l'indicatore degli osteoblasti, osteocalcin, in osteoblasti differenziati immunostaining come mostrato nella Figura 4.
      Nota: La differenziazione osteogenica possa anche essere valutata utilizzando altri indicatori degli osteoblasti o con colore rosso di alizarina colorazione o colorazione della fosfatasi alcalina.
  2. Differenziazione delle cellule O9-1 nei condrociti
    1. Per preparare i supporti di differenziazione dei condrociti, diluire in alfa-MEM i seguenti (le concentrazioni finali sono indicate): 5% siero fetale del vitello (FCS), 1% insulina-transferrina-selenio (ITS), 100 U/mL penicillina, 100 mg/mL di streptomicina, trasformazione di 10 ng/mL fattore di crescita beta (TGF-b3), acido ascorbico 50 mg/mL, 10 ng/mL BMP2, desametasone 0,1 mM e piruvato di sodio di 1 mM.
    2. Prima cultura un monostrato di O9-1 cellule osteogeniche media per 3 giorni e poi tripsinizzano e cultura come un formato di micromass in media di differenziazione dei condrociti per altri 7 giorni.
    3. Differenziazione chondrogenic asini con colorazione Alcian blu o marcatori di condrociti.
  3. Differenziazione delle cellule O9-1 nelle cellule di muscolo liscio
    1. Per preparare la media di differenziazione delle cellule muscolari lisce, diluire in DMEM i seguenti (le concentrazioni finali sono indicate): 100 U/mL penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina e 10% FBS.
    2. Differenziazione delle cellule del muscolo liscio di asini con immunofluorescenza che macchia usando gli anticorpi contro i marcatori delle cellule muscolari lisce, come ad esempio l'actina del muscolo liscio (SMA), indicata come un esempio nella Figura 5.
  4. Differenziazione delle cellule O9-1 nelle cellule gliali
    1. Per preparare la media di differenziazione delle cellule gliali, diluire in DMEM/F12 i seguenti (le concentrazioni finali sono indicate): 1 x supplemento di B-27, 2 mM L-Glutammina, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL di penicillina, 100 mg/mL di streptomicina, 50 ng/mL LIF e 1% FBS inattivati al calore.
    2. Valutare la differenziazione delle cellule glial eseguendo l'immunofluorescenza che macchia con gli anticorpi contro i marcatori delle cellule glial come proteina acido grasso 7 (FABP7).

Risultati

L'obiettivo dei nostri esperimenti di atterramento e knockout era di studiare gli effetti di Yap e Taz perdita di funzione in cellule O9-1. Prima degli esperimenti di atterramento e knockoui, dobbiamo verificare che preparano per media basale e le cellule di cultura O9-1 come descritto sopra (ad esempio, alle esigenze di matrice della membrana dello scantinato per coprire tutta la piastra come mostrato nella Figura 1e O9-1 cellule recuperate...

Discussione

Il servizio NCC è un versatile e chiave collaboratore di diversi tessuti e organi durante la morfogenesi embrionale. La linea cellulare O9-1 mantiene la sua capacità di differenziarsi in molti tipi differenti delle cellule e imita le caratteristiche in vivo di CNC, rendendolo uno strumento utile in vitro per lo studio della funzione del gene e regolazione molecolare in CNC. La condizione differente delle cellule O9-1 può corrispondere a diversi dalla cresta neurale progenie in vivo, a second...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Nicole Stancel, pH.d., ELS, di pubblicazioni scientifiche presso il Texas Heart Institute, ha fornito supporto editoriale. Ringraziamo anche le seguenti fonti di finanziamento: National Center scienziato Development Grant dell'American Heart Association (14SDG19840000 a J. Wang), il premio di ricerca di Lawrence 2014 dal Rolanette e Berdon Lawrence osso malattia programma del Texas (a Wang J. ) e il National Institutes of Health (DE026561 e DE025873 J. Wang, DE016320 e DE019650 di Maxson R.).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Active STO feeder cellsATCCATCC CRL-1503Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X
O9-1 mouse cranial neural crest cell lineMillipore SigmaSCC049
DMEM, high glucose, no glutamineGibco11960-044
DMEM, high glucoseHycloneSH30243.01
FBS (fetal bovine serum)Millipore SigmaES-009-B
Penicillin - streptomycinGibco15140-122
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
Gelatin from porcine skinSigmaG1890
Trypsin-EDTA 0.25% in HBSSGenesee Scientific25-510
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesiumLonza17-512F
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100XxGibco11140-050
Sodium pyruvate (100 mM)Gibco11360-070
2-MercaptoethanolSigmaM-7522
ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/mLMillipore SigmaESG1106
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)R&D Systems233-FB-025
Mitomycin CRoche10107409001
Matrigel matrixCorning356234
DMSO (dimethylsulfoxide)Millipore SigmaMX1458-6
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778-075
Opti-MEM I (1x)Gibco31985-070
Minimum essential medium, alpha 1x with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamineCorning10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNADharmaconL-041057
ON-TARGETplus Non-targeting PoolDharmaconD-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNADharmaconL-046247
FCS (fetal calf serum)
ITS (insulin-transferrin-selenium)
TGF-b3
Ascorbic acid
BMP2 (bone morphogenetic protein 2)
Dexamethasone
B-27 supplement

Riferimenti

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.

Step 2.1 was updated from:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

to:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

Step 5.1.1 was updated from:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.

to:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.

Step 5.2.1 was updated from:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

to:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

Step 5.4.1 was updated from:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

to:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

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