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요약

O9-1 multipotent 마우스 신경 크레스트 셀 라인입니다. 여기는 O9-1 세포를 배양, O9-1 세포 특정 세포 유형으로 분화 하 고 유전자 O9-1 셀 siRNA 중재 최저 또는 CRISPR Cas9 게놈 편집을 사용 하 여에 대 한 자세한 단계별 프로토콜에 설명 합니다.

초록

신경 크레스트 셀 (NCCs) multipotent 줄기 세포를 다른 세포 유형으로 분화 하 고 여러 조직 및 장기를 야기할 수 있는 마이그레이션 됩니다. O9-1 셀 라인은 내 생에서 파생 된 배아 NCCs 마우스 및 그 multipotency 유지. 그러나, 특정 문화 조건 O9-1 셀 다른 세포 유형으로 분화 할 수 있다 하 고 연구 응용 프로그램의 넓은 범위에서. 최근, 마우스 연구 및 O9-1 셀 연구의 조합, 우리가 나타났습니다 그 Taz 및 Yap 신경 크레스트 파생 craniofacial 개발에 중요 한 역할을 재생할 통로 이펙터를 신호 하는 마. O9-1 셀에 대 한 자란 과정은 더 복잡 한 다른 셀 라인에 사용 하는 것, 비록 O9-1 셀 라인 NCCs 체 외조사에 대 한 강력한 모델입니다. 여기, 선물이 경작 O9-1 셀 라인의 stemness, 뿐만 아니라 프로토콜 O9-1 세포, 평활 근 세포와 osteoblasts 다른 세포 유형으로 차별화를 유지 하기 위한 프로토콜. 또한, 프로토콜 O9-1 셀에 CRISPR Cas9 삭제 및 작은 간섭 RNA 중재 최저 사용 하 여 유전자 손실의 기능 연구를 수행 하는 데 설명 합니다.

서문

신경 크레스트 셀 (NCCs) 놀라운 철새 능력 및 배아 개발 하는 동안 일시적인 존재 multipotent 줄기 모양의 세포 이다. NCCs 표면 ectoderm 신경 관 사이 시작 하며 배아 개발1동안 태아의 다른 부분에 이주. 도메인의 기능에 따라, NCCs 여러 종류, 두개골 등, 트렁크, vagal, 성 례, 그리고 심장 NCCs로 분류할 수 있습니다. 또한, NCCs 여러 세포 계보, 부드러운 근육 세포, 뼈 세포, 신경, 등으로 구분 하 고 다양 한 조직2,3을 야기할 수 있습니다. NCCs의 개발은 끈 다양 한 분자 신호 하 여 전체적 사건의 복잡 한 시리즈에 의해 특징입니다. NCCs의 복잡 한 규제 및 수많은 구조에 그들의 중요 한 기여를 감안할 때, NCC 개발의 dysregulation 이어질 수 있습니다 일반적으로 선 천 성 기형, 모든 인간의 선천적인 출생 결함의 약 30%를 위한 계정. 신경 크레스트 개발 하는 동안 이상 갈라진된 입술 또는 구개, 결함이 발생할 수 있습니다 코 형성, 증후군, 결함 결함 심장 유출 관, 또는 심지어 유아 사망률1,,45, 6 , 7. NCC 개발의 분자 메커니즘을 이해 하는 것이 NCC 개발에 결함으로 인 한 질병에 대 한 치료법 개발을 위한 중요. 다양 한 생체 외에서 그리고 vivo에서 의 사용과 접근8,,910,11,12,13,14 ,15를 상당한 진전이 NCC 연구에서. Vivo에서, 닭, 등 양서류, zebrafish, 마우스, 동물 모델 NCCs1을 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 또한, 인간의 배아 초기 인간 배아 개발16NCC 마이그레이션 과정을 공부 하 사용 되었습니다. 생체 외에서셀 모델에서 NCCs 환자 피하 지방에서 시작 된 인간의 NCCs 등에 대 한 파 킨 슨 병17조사에 사용 되었습니다. O9-1 NCC 선, 원래 생 NCCs E8.5 마우스 배아18에서 고립의 대량 문화에서 파생 된, 공부 NCCs. 중요 한 것은, 비 차별 문화 조건에 대 한 강력한 셀 모델, O9-1 세포는 multipotent 줄기 같은 NCCs. 그러나, 다양 한 문화 조건에서 O9-1 셀 평활 근 세포, osteoblasts, chondrocytes, glial 세포18등 고유 세포 유형으로 분화 될 수 있다. 이러한 속성을 감안할 때, O9-1 셀 NCC 관련 연구, 두개골 얼굴 결함19,20의 분자 메커니즘을 조사 하는 등 광범위 하 게 사용 되어 왔습니다.

여기, 상세한 프로토콜 제공 O9-1 세포를 유지, O9-1 세포를 다른 세포 유형으로 차별화 하 고 O9-1 세포 게놈 편집과 작은 간섭 RNA (siRNA)을 CRISPR Cas9 유전자 손실의 기능 연구를 수행 하 여- 최저의 기술 중재. 대표적인 예로 야프 와 Taz 손실-의-기능을 공부 O9-1 셀의 사용을 설명 합니다. 야프와 Taz는 신호 전달 경로, 세포 증식, 감 별 법 및 apoptosis에 중요 한 역할을 담당 하는 마의 다운스트림 이펙터. 뚱 땡 통로 또한 보였다 개발 및 여러 다른 조직 및 장기의 항상성 뿐만 아니라 다른 질병20,,2122,23의 병 인에 중요 한 것 ,,2425,26,,2728. Hippo 신호의 핵심 구성 요소는 종양 억제기 살 균 20 같은 kinases Mst1/2, WW 도메인 포함 된 살바도르 비 계 단백질, 및 큰 종양 억제기 상 동 기관 (Lats1/2) kinases 포함 됩니다. Hippo 신호 Taz 및 Yap 활동을 억제 하 고 세포질에 그들의 저하를 촉진 합니다. 하 마에서 억압 하지 않고 얍 Taz 수 핵으로 이동 및 공동 transcriptional 활성 제 기능. 우리 최근 특히cre Wnt1사용 하 여 마우스 NCCs Taz 및 Yap 이펙터를 신호 하는 마를 비활성화 하 고 심한와 E10.5에서 배아 치 귀착되 었 다 Wnt1Cre2SOR 드라이버 craniofacial 결함20. 우리는 또한 야프 NCCs에 Taz의 역할을 조사 하기 위해 O9-1 셀을 사용 하 여 연구를 수행 했습니다. NCC 확산 및 감 별 법, 야프 Taz 최저 Taz 및 Yap 함수를 공부 하려면 세포 siRNA를 사용 하 여 O9-1 셀에 생성 했다 고 얍 녹아웃 셀 CRISPR Cas9 게놈 편집 사용 하 여 생성 된. 다른 경로에 다른 대상 유전자 동일한 유전자 기능 손실 전략을 적용할 수 있습니다. 또한, 이득의 기능 연구와 transfection 분석 또한 적용할 수 있습니다 유전자 기능과 규제 연구 O9-1 셀에. 여기에 설명 된 프로토콜 multipotent stemness 유지 O9-1 세포를 배양, O9-1 셀 조건 하에서 다른 문화, 다른 세포 유형으로 차별화 및 유전자 기능을 공부 가이드로 조사자에 의해 사용 될 것입니다 및 NCCs의 분자 메커니즘입니다.

프로토콜

1. O9-1 세포 배양 전에 준비

참고: 기저 미디어 O9-1 세포 배양에 사용 해야 합니다 단련 되어 근 친 Sandos 쥐 thioguanine/ouabain 방지 (STO) 마우스 fibroblast 세포; 따라서, STO 셀 얻은 O9-1 세포 배양을 시작 하기 전에 다음과 같은 준비를 해야 합니다.

  1. 활성 STO 세포 배양
    1. 7% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) (미 발달 줄기 세포 문화 등급), 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스와 2 mM L-글루타민 (최종 농도와 독수리의 미디어 (DMEM)를 수정 함으로써 완전 한 Dulbecco의 활성 STO 세포 배양에 대 한 미디어를 준비 표시 됩니다).
      참고: STO 매체 활성 STO 피더 세포의 경작을 위해 사용 됩니다. 페니실린, 스, L-글루타민 저장;에 강수량을 형성 수 있습니다. 사용 하기 전에 pipetting에 의해 완전히 분해.
    2. 실 온에서 30 분 동안 0.1% 젤라틴 있는 표준 100 mm 셀 문화 판 코트. 부 화 기간 후 여분의 젤라틴 발음. 접시를 사용 하 여 코팅 후 즉시.
      참고: 또는 STO 미디어와 플레이트를 커버 하 고 (이것은 의미 단기 저장 및 도장된 접시를 저장 하기 위한 아닙니다) 판의 건조를 피하기 위해 습도 인큐베이터에 접시를 두고.
    3. 37 ° C 물 목욕;에 빠르게 STO 세포를 녹여 cryovial 열기, 전에 70% 에탄올으로 닦 고 즉시 원심 분리기 튜브에 셀의 전체 병을 전송.
    4. 원심 분리기 튜브;에 dropwise STO 미디어를 추가 미디어에 세포의 부피에 의해 비율 1시 10분입니다.
    5. 180 x g 실시간에 3 분에 세포를 원심
    6. 젤라틴 코팅 접시에 부드러운 pipetting 및 셀에 의해 혼합.
    7. STO 셀 (37 ° C, 5% CO2) 표준 인큐베이터에서 24 h에 대 한 성장 하는 것을 허용 한다.
    8. (후에 셀 준수) 매체 변경 시드 및 삭제 오래 된 매체 후 24 h.
    9. STO 세포는 현미경 및 80 %confluency 통행에서 매일 확인 합니다.
      1. 시작 하기 전에 STO 셀 뿌리고, 0.1% 젤라틴 접시 코트 (젤라틴 볼륨 같음 그 선박에 대 한 성장 미디어 볼륨의 절반) 실 온에서 30 분.
      2. STO 셀 통로, 성장 매체를 발음 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 포함 된 셀을 두 번 씻어 (PBS 성장 매체의 동일한 볼륨에 추가).
      3. PBS를 발음 하 고 0.25% trypsin EDTA를 추가 (볼륨 선박 크기 조정); 그런 다음 5 분 동안 37 ° C에서 품 어.
        참고: 100 mm 접시에 대 한 성장 매체의 10 mL와 3 mL의 트립 신 솔루션 사용. 150 mm 접시에 성장 매체의 20 mL와 8 mL의 트립 신 솔루션을 사용 합니다. 워시 버퍼 사용의 볼륨은 성장 미디어의 볼륨.
      4. STO 미디어의 동등한 양으로 trypsin 비활성화 1:3 ~ 1시 10분 비율로 새로운 번호판 씨앗 STO 셀.
        참고: 일반적인 확장 계획 하나 100 mm 접시에 한 150 mm 접시에 다음 4 개의 150 mm 접시에 한 cryovial에서 확장 하는 것입니다 그리고 마지막으로 16 150 mm 접시에.
  2. 비활성화 및 STO 셀의
    1. STO 미디어 다음 추가 미디어 동결 x 2를 준비 (최종 농도 표시 됩니다): 20 %FBS, 20% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO).
    2. 혼합 후, 필터 미디어 (기 공 크기 0.22 μ m) 냉동 x 2를 소독 하 고 사용까지 4 ° C에서 그것을 저장. 2 x 냉동 미디어의 같은 날 사용 하 고 사용 하지 않는 동결 미디어를 삭제를 확인 합니다.
    3. 0.5 mg/mL의 농도에서 PBS에 미토마이신 C 솔루션을 준비 합니다. 미토마이신 C PBS에 해산, vortexer 및 낮은 입자를 완전히 분해를 약 45 분에 대 한 설정에서 소용돌이에 병을 테이프.
      참고: 미토마이신 C는 과민 하 고 분해 하기 어려운 빛 이다.
      주의: 미토마이신 C 심하게 독성 이며 암을 일으킬 수 있습니다. 적절 한 개인 보호 장비 만으로 처리 합니다.
    4. 기존 미디어에 0.01 mg/mL 미토마이신 C의 최종 농도 추가 하 여 스토 셀 비활성화. 2 h (37 ° C, 5% CO2) 표준 인큐베이터 안에 품 어.
    5. 미토마이신 c.와 비활성화 후 두 번 20 mL PBS와 접시 (150 ㎜)를 씻어
    6. PBS 솔루션 발음, 0.25 %trypsin-EDTA, 8 mL를 사용 하 여 세포를 분리 하 고 (37 ° C, 5% CO2) 표준 습도 인큐베이터 안에 5 분 동안 품 어.
    7. STO 미디어의 8 mL로 trypsin 비활성화
    8. 원심 분리기 튜브에 셀 솔루션을 전송. 하나 이상의 플레이트를 결합 하 여 시간을 절약 하기 1 개의 원심 분리기 관으로. 180 x g에 5 분 동안 원심 분리기.
    9. 발음은 상쾌한 고 5 mL PBS에에서 셀 펠 릿 resuspend.
    10. hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수를 셀 솔루션의 10 µ L를 사용 합니다. 중앙 gridded 광장에서 셀의 개수와 10 여 수 1 mL 당 셀의 수를 결정 하기 위해4 . 두 번 세 고 밀리 리터 당 셀 수의 최종 평가 얻기 위해 두 개의 숫자를 평균.
    11. 180 x g에 5 분에 대 한 셀 원심
    12. PBS를 발음 하 고 셀 펠 릿을 1:1 (볼륨)에 의해 STO 미디어와 2 x 냉동 미디어를 추가 합니다. 4 x 106 셀/mL (이 금액은 한 100 mm 접시에 대 한 좋은)의 최종 셀 농도 대 한 볼륨을 조정 합니다.
      참고: 예를 들어 4 개의 150 m m 판 60 x 106 세포의 총 항복에서 셀 솔루션의 1 mL를 포함 하는 각각 cryovial와 cryovial, 당 4 x 106 세포 동결. 4 접시 항복 약 15 cryovials (60/4 = 15). 7.5 mL STO 미디어 및 미디어 셀 펠 릿, resuspend, 그리고 약 1 mL 수를 각 cryovial에 어 x 2의 7.5 mL를 추가 합니다.
    13. 천천히 셀 펠 릿으로 동결 미디어를 pipetting으로 resuspend. 각 cryovial에 셀 솔루션의 1 mL를 전송 하 고 적절 하 게 라벨.
    14. Cryovials (이 세포 생존을 향상 느린 냉각 속도 제공 합니다) lidded 폴리스 티 렌 상자 안에 놓습니다. 액체 질소에는 cryovial를 전송 하기 전에 적어도 24 h-80 ° C 냉동 고에 상자를 전송.
      참고: 최상의 결과 얻으려면 시간, 세포를 2 x 냉동 미디어를 추가 하 고-80 ° c 튜브를 전송 시간 계산 셀 최소화

2. O9-1 세포 배양

  1. DMEM에 다음을 추가 하 여 기저 미디어 O9-1 세포 배양에 대 한 준비 (최종 농도 표시 됩니다): 15 %FBS, 0.1 m m 최소 필수 미디어 (MEM) 불필요 한 아미노산, 1mm 나트륨 pyruvate, 55mm 베타-mercaptoethanol, 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL 스, 2 mM L-글루타민, 103 단위/mL 백혈병 금지 요인 (LIF; 사용 직전 추가 재고 병에 추가 하지 마십시오), 및 25 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자-기본 (bFGF; 사용 직전 추가 재고 병에 추가 하지 마십시오).
  2. 필터는 기저 미디어 (기 공 크기 0.22 μ m)을 소독 하 고 빛 으로부터 보호 하기 위해 호 일에 포장.
  3. 사 스토 셀에서 조건을된 기저 미디어를 수집 합니다.
    참고: 비활성된 STO 셀 후만 진행 합니다. O9-1 기초 미디어 STO 셀 격판덮개에서 수집 된이 바른된 기저 미디어 라고 합니다.
    1. 해빙 위에서 설명한 대로 빠르게 STO 셀 비활성화 (4 x 106 세포를 포함 한 cryovial 한 100 mm 접시에 대 한 좋은 고 약 100 mL 단련 기저 미디어 컬렉션의 10 일 후 생성). 씨앗은 STO 미디어를 사용 하 여 젤라틴 코팅 접시에 STO 셀 비활성화. 셀 (37 ° C, 5% CO2) 표준 습도 인큐베이터에서 하룻밤에 연결할 수 있습니다.
    2. STO 셀 녹고 후 24 h 기존 STO 미디어를 삭제 하 고 기저 미디어도 바꿉니다.
      참고: 추가 하지 마십시오 LIF와 bFGF 사 스토 셀 문화 요리; O9-1 셀 문화 요리에 추가할.
    3. 모든 24 h O9-1 기초 미디어를 사용 하 여 미디어를 변경 하 고 병에 STO 셀 격판덮개에서 기저 미디어를 수집 합니다. 랩 빛 으로부터 보호 하기 위해 호 일에 바른된 기저 미디어를 포함 하는 병. 4 ° c.에 모든 수집 된 미디어 저장
      참고: 셀 비활성화 했다 때문에 그들은 나타나지 않을 수 있습니다 그들은 컬렉션의 몇 일 후 처럼 건강 한 이것은 예상 될 것 이다.
    4. 선택적으로 오염에 대 한 확인, 호 일에 싸여 각 컬렉션 하루 (한 병) 대신 다른 튜브에 대 한 기저 미디어를 수집 합니다. 24-잘 접시를 사용 하 여 매일에서 미디어의 1 mL에 각 잘 놓고 현미경 세균 오염에 대 한 확인 표준 인큐베이터에서 밤새 품 어.
      참고: 미디어 아무 오염 되었지만 변경 세균 오염이 있으면 노란 경우 붉은 색을 남아 있다.
    5. 수집 후 기저 미디어 조절 10 일 스토 셀 삭제. 결합 (있는 경우) 모든 조건부 기저 미디어를 수집 하 고 필터 살 균 병으로 (기 공 크기 0.22 μ m)을 소독. 빛 으로부터 보호 하기 위해 호 일에 병을 바꿈. 필터링된 조건된 기저 미디어 필터 날짜 로부터 한 달의 최대 4 ° C에서 유지.

3. 유지 O9-1 셀

참고: 작업 O9-1 기초 미디어는 소독 필터는 LIF (최종 농도 103 단위/mL)를 기저 미디어 및 bFGF (최종 농도 25 ng/mL) 사용 하기 전에 셀 문화 접시에 즉시 추가 됩니다. 이 미디어는 빛 으로부터 보호 하 여 4 ° c.에 저장 해야

  1. O9-1 세포의 복구
    1. 천천히 해 동 지하실 멤브레인 매트릭스 (예를 들어, Matrigel)의 주식 병 하룻밤 aliquots 준비 하 4 ° C에서.
    2. 10 %DMEM 5 mL을 추가 재고 지하실 멤브레인 매트릭스 막의 5 ml FBS. -20 ° c.에 저장 된 차가운 피 펫 팁 pipetting으로 잘 혼합 얼음에 원래 병 및 약 수 튜브를 유지. 실험 요구 사항에 따라 다른 볼륨 (0.5 mL 또는 1 mL aliquots)에 aliquots를 고정 합니다. 여러 번 동결 해빙 지하실 멤브레인 매트릭스를 하지 마십시오.
      참고: 지하실 멤브레인 매트릭스 polymerizes 빠르게 실내 온도; 차가운 피 펫 팁을 사용 하 고 의도 하지 않은 중 합을 방지 하기 위해 노력 하는 때 튜브 차가운 유지.
    3. 실험을 시작 하기 전에 지하실 멤브레인 매트릭스 또는 얼음 2 h 4 ° C에서의 약 수를 녹여. 오랜된 시간 동안 4 ° C에서 매트릭스를 저장 하지 마십시오.
    4. DMEM 살 균 하는 필터를 사용 하 여 10 %FBS 지하실 멤브레인 매트릭스 판 코트 0.5 mg/mL의 최종 농도를 희석. 1 헤를 그것 완전히 커버 플레이트 ( 그림 1에서 같이) 확인에 대 한 실 온에서 지하실 멤브레인 매트릭스 (0.5 mg/mL)와 코트 접시.
    5. 발음을 코팅 표면을; 피하기 위해 지하실 멤브레인 매트릭스 때 접시를 기울기 30 분 동안 37 ° C에서 건조 접시. -코팅된 접시를 건조 하지 마십시오.
      참고:만 때 모든 미디어와 시 약 사용할 준비가 진행 (기저 미디어, 살 균 필터링 10% 조절 DMEM, LIF, bFGF FBS).
    6. O9-1 세포를 37 ° C 물 목욕;에 cryovial를 배치 하 여 빠르게 복구 천천히 액체를 완전히 회전 솔루션까지 유리병을 소용돌이 고 즉시 다음 단계를 진행 합니다.
    7. Cryovial (약 1 mL)의 모든 셀 솔루션 15ml 원심 관에 전송. 추가 10 %5 양의 DMEM FBS (0.22 μ m의 기 공 크기의 필터 살 균 필터)와 resuspend.
    8. 180 x g에서 3 분 동안 원심 분리기. 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 발음. LIF와 bFGF 보충 조건 기저 미디어에서 (두 드려서) 셀 펠 릿을 resuspend. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산.
      참고: 조건된 기저 미디어 LIF와 bFGF 보충이 multipotency O9-1 셀 라인을 유지 하기 위해 중요 합니다. 의도 하지 않은 세포 분화를 피하기 위해 정확한 미디어를 추가할 사용 하 여 관리.
    9. 6 잘 플레이트 15000 셀/c m2 에 10, 000에서 시드 셀. 밤새 미디어를 변경 하기 전에 연결 하 고 (37 ° C, 5% CO2) 표준 셀 문화 인큐베이터에서 성장 세포를 허용 합니다.
    10. 세포 미디어 (건강 한 연결 된 셀 처럼 그림 2에 표시 된) 변경 진행 하기 전에 연결 되어 있는지 확인 합니다.
    11. 항상 문화 미디어 O9-1 셀 (LIF와 bFGF 보충 조건된 기저 미디어를 사용) 복구 후 다음날 변경 합니다.
  2. O9-1 셀의 통로
    1. O9-1 셀 80 %confluency 도달, 지하실 멤브레인 매트릭스를 녹여 하 고 위에서 설명한 대로 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 접시를 준비 합니다. LIF와 선박 bFGF 보충 조건된 기저 미디어를 추가 합니다. 또는, DMEM FBS 건조에서 지하실 멤브레인 매트릭스를 유지 하 고 3 일 동안 표준 습도 인큐베이터 안에 저장을 하지 않고 추가 합니다.
    2. Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)의 2 개 mL와 O9 1 포함 된 웰 스 (6 잘 플레이트)를 두 번 헹 구 고 부드럽게 셀 유실을 방지 플라스틱.
    3. 해리 10 %DMEM 동일한 금액으로 3 분 중화 트립 신에 대 한 37 ° C에서 0.05% 트립 신-EDTA의 1 mL와 함께 셀 FBS. 반복 가능한 접시에서 많은 세포 분열을 잘의 전체 표면에 액체 플라스틱.
      참고: 트립 신 농도 0.25 %0.05%. DPBS를 사용 하 여 재고 병에서 희석.
    4. 해리는 접시에서 셀 때 거품을 생성 하지 마십시오.
    5. 원심 분리기 튜브와 180 x g에서 3 분 동안 원심 분리기를 모든 셀 솔루션을 전송 합니다. 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 발음. 원심 분리기 튜브 부드러운 pipetting LIF와 bFGF 보충 조건된 기저 미디어에 의해 셀 펠 릿을 resuspend.
    6. 위에서 설명한 대로 총 셀 수를 계산 하는 hemocytometer를 사용 합니다. 씨 셀 (10000 15000 셀/cm2) 코팅 접시 준비 단계 3.1.4 3.1.8에에서 설명 된 대로. 6 잘 플레이트의 한 잘 씨 100000 셀 필요 합니다.
    7. 연결 하 고 (37 ° C, 5% CO2) 표준 셀 문화 인큐베이터에서 성장 세포 허용. 항상 문화 미디어 O9-1 셀을 뿌리고 후 다음 날 변경 합니다.
  3. O9-1 셀의
    1. O9-1 셀에 대 한 미디어를 동결 x 2를 준비 하려면 DMEM에서 다음 희석 (최종 농도 표시 됩니다): 40 %FBS 20 %DMSO.
    2. 필터는 미디어를 동결 x 2를 소독 및 4 ° c.에 그것을 유지합니다 미디어를 동결 x 2 사용 하는 날에 제출 되어야 합니다. 모든 사용 하지 않는 동결 미디어를 삭제 합니다.
      참고: 80 %confluency O9-1 세포 동결.
    3. DPBS와 린스 우물 두 번; 세포 손실을 방지 하려면 부드럽게 피 펫입니다.
    4. 3 분 동안 37 ° C에서 0.05% 트립 신-EDTA와 세포 분열 후 10%의 동일한 금액으로 트립 신 중화 DMEM에서 FBS. 반복 가능한 접시에서 많은 세포 분열을 잘의 전체 표면에 액체 플라스틱.
    5. 원심 분리기 튜브를 180 x g에서 3 분 동안 원심 분리기 모든 플레이트 내용을 전송 합니다. 발음은 상쾌한 PBS의 2 개 mL를 추가 하 고 두 드려서 resuspend.
    6. 위에서 설명한 대로 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수를 셀 솔루션의 10 µ L를 사용 합니다.
    7. 180 x g에서 3 분 셀 솔루션 원심 발음은 상쾌한 고 필요; 기저 미디어의 양을 조정합니다 다음, 2 x 냉동 미디어의 동일한 금액을 추가 합니다.
      참고: 셀 1 x 106 셀/mL (1 mL 당 cryovial)의 농도에 동결 됩니다.
    8. Cryovials 셀 전송 하 고 그에 따라 라벨. 액체 질소를 전송 하기 전에 적어도 24 h-80 ° C에서 느린 냉각 속도 대 한 폴리스 티 렌 lidded 상자 안에 cryovials를 배치 합니다.
      참고: 최상의 결과 얻으려면 최소화 시간과 추가 2 x 고정 미디어와 튜브-80 ° c 전송 사이의 시간을 계산 하는 셀

4입니다. O9-1 셀의 조작

  1. O9-1 셀에 siRNA 분해를 수행
    1. 해 동와 실험을 시작 하기 전에 (단계 3.1.4–3.1.8) 위에서 설명한 대로 지하실 멤브레인 매트릭스와 24-잘 접시를 코트. 복구 하 고 O9-1 셀, confluency 60% ~ 80%로 성장할 수 있도록 씨앗.
    2. 적절 한 잘 볼륨에 따라 혈 청 자유로운 매체에 리를 희석. 마지막에 혈 청 자유로운 매체에 siRNA를 희석. 제조업체에서 권장 하는 비율로 희석된 리를 희석된 siRNA를 추가 합니다. Pipetting으로 잘 혼합 하 고 품 어.
      주: 사용 하는 볼륨, 시간 및 외피의 온도에 제조업체의 안내를 따릅니다.
    3. 제조업체의 권장 사항에 따라 셀에 siRNA 지질 단지 적절 한 볼륨을 추가 합니다.
    4. (37 ° C, 5% CO2) 표준 셀 문화 인큐베이터에서 24 h에 대 한 셀을 품 어. 적절 한 (추출 물 RNA, 단백질 추출 물, 얼룩, 등.)으로 다운스트림 단계
      참고: siRNA 최저의 시간과 농도 개별 실험에 따라 달라질 수 있습니다.
  2. O9-1 셀에 CRISPR Cas9 게놈 편집 사용 하 여 유전자 녹아웃을 수행
    참고: 포유류 세포 라인29에 CRISPR-Cas9를 사용 하 여 이전에 게시 프로토콜을 참조 하십시오. 제공 여기 게놈 편집과 관련된 단계를 CRISPR-Cas9의 단순화 된 설명입니다.
    1. SgRNA 디자인 도구를 사용 하 여 sgRNA 시퀀스를 얻을.
    2. PSpCas9에 sgRNA 선 (bb)-2a-GFP 벡터30.
    3. 제조업체의 권장 사항에 따라 표준 lipofection 프로토콜을 사용 하 여 벡터와 O9-1 셀 transfect.
    4. 셀 24 h에 대 한 5% CO2 와 37 ° C에서 표준 셀 문화 인큐베이터에 품 어.
    5. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) GFP/7-AAD에 따라 수행 합니다. 시드 GFP + 96 잘 접시로 단일 셀입니다.
    6. 추가 4 일간 인큐베이터에 셀을 성장. 하나 이상의 식민지에 있는 모든 우물을 삭제 합니다.
    7. 삭제 탐지를 위한 뇌관으로 PCR을 수행 합니다. PCR, 후 밴드 크기를 평가 하는 agarose 젤에 PCR 제품을 실행 합니다. 부 럽 ( 얍 녹아웃 결과의 예를 그림 3참조)을 수행 하는 CRISPR-Cas9 editingby를 사용 하 여 녹아웃 효율성을 확인 합니다.

5. O9-1 세포 분화

  1. O9-1 셀 osteoblasts로 차별화
    1. 알파-MEM에 다음 희석 osteogenic 차별화 미디어를 준비 하려면 (최종 농도 표시 됩니다): 0.1 m m dexamethasone, 100 ng/mL 뼈 morphogenetic 단백질 2 (BMP2), 의약품 50 µ g/mL, 10 m m b-glycerophosphate, 10 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 그리고 100mg/mL 스입니다.
    2. 그림 4와 같이 immunostaining에 의해 차별화 된 osteoblasts osteoblast 마커, osteocalcin, 검색.
      참고: Osteogenic 차별화 또한 알리자린 레드 얼룩 또는 알칼리 성 인산 가수분해 효소 얼룩 osteoblasts의 또는 다른 마커를 사용 하 여 평가할 수 있습니다.
  2. O9-1 셀 chondrocytes로 차별화
    1. 알파-MEM에 다음 희석 chondrocyte 차별화 미디어를 준비 하려면 (최종 농도 표시 됩니다): 5% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 1% 인슐린-처리가-셀레늄 (ITS), 100 U/mL 페니실린, 100 mg/mL 스 10 ng/mL 변형 베타 성장 인자 (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic 산, 10 ng/mL BMP2, 0.1 m m dexamethasone 및 1mm 나트륨 pyruvate.
    2. O9-1의 단층을 첫 번째 문화 osteogenic 미디어와 함께 3 일 동안 세포와 trypsinize 그리고 추가 7 일 chondrocyte 차별화 미디어에서 micromass 형식으로 문화.
    3. Alcian 블루 얼룩 또는 chondrocytes의 마커 엉덩이 chondrogenic 차별화.
  3. O9-1 셀의 부드러운 근육 세포로 분화
    1. 부드러운 근육 세포 감 별 법 미디어를 준비 하려면 DMEM에서 다음 희석 (최종 농도 표시 됩니다): 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 그리고 10 %FBS.
    2. 엉덩이 부드러운 근육 세포 감 별 법 면역 형광 검사 예를 들어 그림 5에 표시 된 부드러운 근육 걸 (SMA) 같은 부드러운 근육 세포의 표식에 대 한 항 체를 사용 하 여 얼룩.
  4. Glial 세포로 O9-1 셀의 차별화
    1. Glial 세포 감 별 법 미디어를 준비 하려면 희석 DMEM/f12 키에서 다음 (최종 농도 표시 됩니다): B-27 보충, 2 mM L-글루타민, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL 페니실린, 100 mg/mL 스, 50 ng/mL LIF, 및 1% x 1 열 비활성화 FBS.
    2. Glial 세포 분화 얼룩 지방산 의무적인 단백질 7 (FABP7) 등 폐해 셀 표식에 대 한 항 체와 면역 형광 검사를 수행 하 여 평가 합니다.

결과

우리의 최저 및 녹아웃 실험의 목표 Taz 및 Yap 손실-의-기능 O9-1 셀에의 효과 연구 했다. 최저의 및 녹아웃 실험 하기 전에 우리는 되도록 기저 미디어와 문화 O9-1 셀 (예: 그림 1및 복구 O9-1 셀에 표시 된 전체 접시를 충당 하기 위해 지하실 멤브레인 매트릭스 요구 위에서 설명한 대로 준비 하는 액체 질소 그림 2에서 ...

토론

NCC 배아 morphogenesis 동안 다른 조직 및 장기에 다양 하 고 핵심 기여자 이다. O9-1 셀 라인 많은 다른 세포 유형으로 차별화 하는 잠재력을 유지 하 고 모방 NCCs, 유전자 기능을 연구 하 고 NCCs 분자 규제에 대 한 유용한 체 외에 도구를 만드는의 비보에 특성. O9-1 세포의 다른 상태는 다른 신경 크레스트 자손에서 vivo에서, O9-1 셀의 문화 조건에 따라에 해당할 수 있습니다. O9-1 셀 mult...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

니콜 Stancel, 박사, ELS, 텍사스 심장 연구소 과학적인 간행물의 논설 지원을 제공 했습니다. 우리는 또한 다음과 같은 자금 출처 감사: 미국 심장 협회의 국가 센터 과학자 개발 그랜트 제이 왕 (14SDG19840000), (하 제이 왕 2014 로렌스 연구 수상 Rolanette Berdon 로렌스 뼈 질병 텍사스의 프로그램에서 ), 그리고 (DE026561 및 DE025873 제이 왕, DE016320 및 DE019650 R. Maxson를) 건강의 국가 학회.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Active STO feeder cellsATCCATCC CRL-1503Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X
O9-1 mouse cranial neural crest cell lineMillipore SigmaSCC049
DMEM, high glucose, no glutamineGibco11960-044
DMEM, high glucoseHycloneSH30243.01
FBS (fetal bovine serum)Millipore SigmaES-009-B
Penicillin - streptomycinGibco15140-122
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
Gelatin from porcine skinSigmaG1890
Trypsin-EDTA 0.25% in HBSSGenesee Scientific25-510
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesiumLonza17-512F
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100XxGibco11140-050
Sodium pyruvate (100 mM)Gibco11360-070
2-MercaptoethanolSigmaM-7522
ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/mLMillipore SigmaESG1106
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)R&D Systems233-FB-025
Mitomycin CRoche10107409001
Matrigel matrixCorning356234
DMSO (dimethylsulfoxide)Millipore SigmaMX1458-6
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778-075
Opti-MEM I (1x)Gibco31985-070
Minimum essential medium, alpha 1x with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamineCorning10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNADharmaconL-041057
ON-TARGETplus Non-targeting PoolDharmaconD-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNADharmaconL-046247
FCS (fetal calf serum)
ITS (insulin-transferrin-selenium)
TGF-b3
Ascorbic acid
BMP2 (bone morphogenetic protein 2)
Dexamethasone
B-27 supplement

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.

Step 2.1 was updated from:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

to:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

Step 5.1.1 was updated from:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.

to:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.

Step 5.2.1 was updated from:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

to:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

Step 5.4.1 was updated from:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

to:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

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