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Zusammenfassung

Wir beschreiben Protokolle für die Verwendung der breiten Sichtfeld Nematoden Tracking-Plattform (WF-NTP) ermöglicht hohen Durchsatz phänotypischen Charakterisierung von großen Populationen von Caenorhabditis Elegans. Diese Protokolle können verwendet werden, um subtile Verhaltensänderungen in mutierte Stämme oder in Reaktion auf die pharmakologische Behandlung in einer hochgradig skalierbare Weise zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Caenorhabditis Elegans ist ein gut etabliertes Tiermodell in der biomedizinischen Forschung, weit verbreitet in funktionelle Genomik und Alterung Studien eingesetzt. Um die Gesundheit und Fitness der Tiere unter Studie zu beurteilen, setzt man in der Regel auf Motilität anzeigen, wie die Messung von der Anzahl der Körper Kurven oder die Geschwindigkeit der Bewegung. Diese Messungen in der Regel beinhalten manuelle Zählung, macht es schwierig zu erhalten gute statistischen Signifikanz, als Zeit und Arbeit Einschränkungen häufig die Anzahl der Tiere in jedem Experiment auf 25 oder weniger. Da hohe statistische Aussagekraft notwendig ist, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen und falsch positive und negative Ergebnisse zu begrenzen, wenn schwache phänotypische Auswirkungen untersucht werden, vor kurzem wurden Anstrengungen unternommen, zu automatisierten Protokolle konzentrierte sich auf die Steigerung der Empfindlichkeit der Motilität-Erkennung und multiparametrischen Verhaltensstörungen profiling. Zur Erweiterung der Nachweisgrenze auf die Ebene benötigt, um die kleinen phänotypischen Veränderungen zu erfassen, die oft für genetische Studien und Wirkstoffforschung entscheidend sind, beschreiben wir hier eine technologische Entwicklung, die es die Untersuchung von bis zu 5.000 einzelne Tiere ermöglicht Gleichzeitig erhöhen die statistische Aussagekraft der Messungen von ca. 1,000-fold im Vergleich zu manuellen Tests und etwa 100fach im Vergleich zu anderen automatisierten Methoden.

Einleitung

Vor etwa einem halben Jahrhundert Sydney Brenner eingeführt Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) als Modellsystem, Entwicklungs- und Neurobiologie, als dieses kleine zu studieren (1 mm in der Länge), transparente Nematoden Wurm ist leicht zu manipulieren genetisch und im Labor1zu erhalten. Heute wird C. Elegans verwendet, um eine Vielzahl von biologischen Prozessen, einschließlich der Apoptose, Zelle, die Art des Zellzyklus, Genregulation, Stoffwechsel und Altern2zu studieren. Darüber hinaus die Mobilfunk- und Gewebe Komplexität, Protein Expressionsmuster und die Erhaltung der Krankheit Wege zwischen C. Elegans und höheren Organismen (80 % der Wurm Gene haben einen menschlichen orthologs), verbunden mit der Einfachheit und Wirtschaftlichkeit des Anbaus, machen es effektiv in Vivo Modellorganismus zugänglich Hochdurchsatz-genetische3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 und Medikament14,15,16 -Screenings. Aus all diesen Gründen ist für die Charakterisierung von normalen und krankheitsbezogenen molekulare Signalwege C. Elegans beschäftigt; im Bereich der Neurodegeneration ermöglichte es zum Beispiel die Erforschung der Auswirkungen des Alterns auf Protein Aggregation3,4,7,15,17, 18, und die Charakterisierung von Promotoren und Inhibitoren Protein Aggregation3,4,5,6,7,14, 18.

Die allgemeine Fitness der Würmer, die ein wichtiger verhaltensbezogene Parameter in dieser Art von Studie definiert werden, kann manuell in eine Vielzahl von Möglichkeiten, wie z. B. gemessen werden durch zählen der Anzahl der Körper Kurven pro Minute (BPM)4,6, 19, oder durch Messung der Geschwindigkeit der Bewegung20,21,22, sowie durch Messung der durchschnittlichen Lebensdauer und Preise der Lähmung. Obwohl manuelle Messungen Körper Kurven und Geschwindigkeit der Bewegung zu viele wichtige Einblicke in eine Vielzahl von molekularen Wege und Mechanismen3,4,14,19geführt haben, 20,23, manuelle Tests bleiben derzeit niedrigen Durchsatz, sehr arbeitsintensiv und zeitaufwendig und anfällig für Fehler und auf menschliche Vorurteile. Diese Fragen Herausforderungen erhebliche in der Sammlung von Daten mit ausreichend statistische Aussagekraft, subtile Verhaltensänderungen zu unterscheiden. Diese Einschränkung gilt insbesondere für Drug screening als Behandlungen mit potenziellen Medikament Moleküle führen oft zu kleinen phänotypischen Veränderungen24, daher erfordert die Untersuchung einer großen Anzahl von Tieren um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Um dies zu verdeutlichen, haben jüngste Studien gezeigt, dass eine hohe Leistung der Erkennung (POD), mit Zuversicht signifikanten Änderungen im Verhalten definieren und falsch positive Ergebnisse25beschränken muss. Dies führte zu einer starken Motivation in der Gemeinschaft von C. Elegans , manuelle Zählung mit reproduzierbaren, automatisiert, Zeit - und Kosten - wirtschaftlicheren Messungen zu ersetzen. Um diese Nachfrage zu befriedigen, haben mehrere Labore vor kurzem entwickelt Methoden zur hochempfindlichen Messungen und genaue Wurm Verfolgung der größeren Zahl der Würmer22,26,27,28 ,29,30,31,32,33.

Um den Prozess der Automatisierung weiter zu den großen Kohorten von Tieren für statistisch signifikante Messungen benötigt auszubauen, haben wir vor kurzem ein breites Sichtfeld Nematoden tracking-Plattform (WF-NTP)15,34 entwickelt. ,35,36, ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung der mehrere phänotypische anzeigen auf sehr großen Wurm Bevölkerungen, ein Schlüsselfaktor für statistisch relevante phänotypischen Erkennung25. Nicht nur kann der WF-NTP-Server überwachen derzeit bis zu 5.000 Tiere parallel, sondern die phänotypische anzeigen gehören auch mehrere Parameter, einschließlich die Rate und die Amplitude der Körper Kurven, die Geschwindigkeit der Bewegung, der Anteil der Bevölkerung, die gelähmt ist, und die Größe der Tiere. Es ist daher ohne weiteres möglich, Bildschirm Tausende von Würmern parallel und verbinden die verschiedenen Anzeigen in behavioral Karten erstelle ich eine multidimensionale Fingerabdruck-36. Die zugehörige Open-Source-Software ist in Python geschrieben, das ist auch erforderlich, um es zu betreiben und ist vollständig anpassbar. Eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) ist ebenfalls vorhanden, damit Benutzer diese Technologie übernehmen können.

Hier präsentieren wir Ihnen eine Reihe von Protokollen, die einige der möglichen Anwendungen des WF-NTP zu veranschaulichen. Insbesondere wir diskutieren die Verwaltung von Verbindungen, von kleinen Molekülen bis hin zu Proteintherapeutika, und beschreiben Sie, wie ihre Auswirkungen auf den Bildschirm direkt über große Populationen von Würmern, somit effektiv entfernt die Notwendigkeit, kleine Probe Sub-Populationen. Die Verwendung von den WF-NTP-Server für einen solchen Zweck brachte bereits erhebliche Vorteile im Verfahren zur, Drug Discovery-Programme der Alzheimer-Krankheit (AD)15,34,35 und der Parkinson-Krankheit (PD)18 zu entwerfen mit in-vivo-Daten für die Beurteilung der therapeutischen Kandidaten35,37.

Protokoll

1. Vorbereitung der Materialien für C. Elegans Protokolle

  1. Um ein 10 x M9-Pufferlösung vorzubereiten, fügen Sie 30 g monobasic Kalium Phosphat, Diabas-Natriumphosphat 60 g und 50 g Natriumchlorid eine 1 L-Flasche autoklavierbar hinzu.
    1. Fügen Sie 1 L des gereinigten Wassers und Autoklaven am ca. 121 ° C für 15 Minuten.
    2. Verdünnen Sie 10mal in gereinigtem Wasser und Autoklaven ca. 121 ° C für 15 Minuten.
    3. Wenn abgekühlt, fügen Sie 1 mL einer Lösung von 1 M Magnesiumsulfat.
      Hinweis: Nur 1 x M9 (M9) für Wurm Handhabung in den folgenden Schritten verwendet werden soll.
  2. Zur Vorbereitung der Nematoden Wachstumsmedium (Rich-NGM) mischen Sie 2,7 g Natriumchlorid, 15,75 g Agar, 5,75 g Casein, 900 mL gereinigtes Wasser und Autoklaven bei 121 ° C für 15 Minuten.
    1. Rich-NGM Medium zu übertragen, zu einer wärmenden Ofen (ca. 70 ° C) bei Nichtbenutzung sofort; der Rich-NGM kann geschmolzenen bei ca. 70 ° C für bis zu 12 h gehalten werden bevor sie unbrauchbar.
    2. Mischen Sie um die Rich-NGM, fügen Sie 900 µL einer Lösung von 1 M-Kalzium-Chlorid, 900 µL einer Lösung von 1 M Magnesiumsulfat und 900 µL einer Lösung von 5 mg/mL Cholesterin in absoluten Ethanol.
      Hinweis: Cholesterin ist nicht Autoklavieren vor dem Gebrauch erforderlich.
    3. Um die experimentelle Platten vorzubereiten, die eine synchrone Bevölkerung im Alter zu erhalten, fügen Sie 92 µL 5-Fluoro-2'-Deoxyuridine (FUDR) am 812 µM bis 900 mL Rich-NGM.
      Hinweis: FUDR ist giftig und Karzinogen, so dass es unerlässlich ist, Nitril-Handschuhe neben Kittel und Schutzbrille tragen. Nicht zulassen, Abfälle, Restmüll geben streamen und entsorgen durch Verbrennung mit einem Nachbrenner.
    4. Gießen Sie 20 mL autoklaviert Rich-NGM in einer 9 cm sterile Petrischale eine Wachstumsfuge (Rich-NGM-Platte) erzeugen. 15 mL autoklaviert Rich-NGM in einer 9 cm sterile Petrischale Motilität Teller (Mot Platte) zu gießen. Gießen Sie 20 mL Rich-NGM mit FUDR in eine sterile Petrischale 9 cm, eine FUDR-Platte zu generieren.
      Hinweis: Das niedrige Agar Volumen der Mot Platte erleichtert die Kamera fokussieren und Wurm tracking (siehe Schritt 3.2.5).
  3. Bereiten Sie die OP50 Escherichia-coli -Stamm durch Autoklavieren 1 L LB Brühe bei 121 ° C für 15 min und impfen mit Starterkultur wenn abgekühlt.
    1. Lassen Sie die Bakterienkultur zu wachsen über Nacht bei 37 ° C und sterilisieren die Röhre für Zentrifugation verwendet werden.
    2. Übertragen Sie die Bakterien auf sterilen Röhrchen und Zentrifuge bei 4.600 X g für 15 min.
    3. Den Überstand abgießen und mit sterilem Wasser, bei 10 % des ursprünglichen Volumens, 10 X (10 Mal konzentriert) OP50 Lager schaffen aussetzen.
    4. Verdünnen Sie 15 mL der 10 x OP50 bestand bis 150 mL, 1 erzeugen x OP50, mit sterilem Wasser, bevor Sie Rich-NGM Platten Saatgut verwendet wird. Die restlichen 10 X Lösung zu Samen FUDR Platten.
      Hinweis: Die Mot-Platten ungesetzte bleiben und werden nur in der Bild-Erwerb-Schritt verwendet werden.
  4. Saatgut-Platten mit Bakterien, Vermischungen der Rich-NGM und FUDR Platten.
    1. Fügen Sie unter sterilen Bedingungen 350 µL 1 X OP50, Rich-NGM Platten und gleichmäßig verteilt.
      Hinweis: Da Würmer, herauf die Seiten der Platte und sterben kriechen werden nicht an den Rand der Platte verteilt.
    2. Fügen Sie unter sterilen Bedingungen 350 µL 10 X OP50, FUDR Platten und gleichmäßig verteilt.
    3. Lassen Sie die Platten zu trocknen und brüten bei 20 ° C für 2 d vor Gebrauch.

2. Vorbereitung von C. Elegans für die Verwendung mit den WF-NTP-Server

  1. Pflegen Sie C. Elegans auf Rich-NGM Platten oder indem Sie eine kleine Menge des Nährbodens mit Würmern Gesicht nach unten auf eine frische bakterielle Schicht übertragen. C. Elegans Stämme auf diese Weise vor dem Einleiten der experimentelle Protokolle zu erhalten.
  2. Mit der Übertragung von Technik (siehe Punkt 2.1), Samen 20 Platten von jedem Stamm wohlgenährt, gemischte Phase Würmer mit und lassen sie für 2 Tage bei 20 ° c zu wachsen
  3. Waschen Sie ab 5 Platten, die Würmer mit 15 mL der M9 und Pool in einem 15 mL-Tube enthält. Wiederholen Sie für alle 20 Platten von jedem Stamm.
  4. Die Würmer bei 2.000 X g für 2 min Zentrifugieren, überstand zu entfernen und in 2 mL M9 Lösung auszusetzen.
  5. Vorbereitung 10 mL Bleichbad durch Mischen von 13 % Natriumhypochlorit und 4 M Natriumhydroxid in einem Verhältnis von 3:2 Vol/Vol.
    Hinweis: Diese Lösung erfordert keine Autoklavieren. Komponenten und die resultierende Lösung sind ätzend und sollte mit Nitril-Handschuhe mit Vorsicht gehandhabt werden. Natriumhydroxid ist leicht ätzend auf Glas und sollte in Kunststoff-Behältern gelagert werden.
  6. Jede Zentrifugenröhrchen 1 mL Bleichbad hinzu und schütteln Sie kräftig für ca. 3,5 Minuten oder bis die Kutikula vollständig aufgelöst hat.
  7. Verdünnen Sie unter sterilen Bedingungen die Proben 15 mL M9 und Zentrifuge bei 2.000 X g für 2 min. Überstands entfernen und in 15 mL M9 Lösung auszusetzen.
  8. Wiederholen Sie Schritt 2,7 6 Mal, nur Wurm Eier bleiben, bis die Lösung hat nicht mehr einen Geruch von Chlor.
  9. Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.000 X g für 2 min, entfernen Sie den Überstand zu und in 2 mL M9 Lösung auszusetzen.
  10. Verwenden Sie unter sterilen Bedingungen eine sterile Glaspipette 2 mL der M9 mit Eiern in jede Vertiefung einer Gewebekultur 12-Well-Platte übertragen und bei 20 ° C für mindestens 16 h inkubieren.
    Hinweis: Verwenden Sie separate Platten für jede Belastung, um Kreuzkontamination zu vermeiden. Die Übertragung von Schritt die Zentrifuge Rohre bis hilft die Multi-Brunnen, Wurm Erstickungsgefahr zu vermeiden.
  11. Übertragen Sie werden die Würmer über Nacht aus der 12-Well-Platten in 15 mL Zentrifuge Röhren geschlüpft. Nehmen Sie 3 Tropfen von 5 µL Wurm-Lösung und die Anzahl der Würmer im ersten Larvenstadium (L1) vorhanden.
  12. Berechnen Sie die Anzahl der Würmer pro µL Lösung.
  13. Samen L1 Würmer auf Rich-NGM Teller bei 3.000 Würmer pro Platte und lassen sie für 2 Tage bei 20 ° C zu wachsen, bis sie letzten Larvenstadium (L4) Stufe zu erreichen.

3. Allgemeine WF-NTP-Protokoll

  1. Hinzufügen von 2,2 mL jedes Medikament zusammengesetzte bei der entsprechenden Konzentration (so wie 25 oder 10 mM für Medikamente wie wenig18 und Bexaroten15, beziehungsweise), 6 FUDR Platten und unter sterilen Bedingungen trocknen lassen für jede Wurm Belastung gewünschte.
    Hinweis: Dieser Schritt wird für jede Verbindung geprüft, für jede Konzentration und jede verwendete Lösungsmittel wiederholt.
    1. Waschen Sie die Würmer ab 5 Rich-NGM-Platten bei Schritt 2.13 mit 15 mL M9 Puffer vorbereitet und übertragen Sie die Würmer auf ein Zentrifugenröhrchen.
    2. 2.000 x g für 2 min Zentrifugieren, überstand zu entfernen und in 3 mL M9 auszusetzen. Nehmen Sie 3 Tropfen von 5 µL der M9-Lösung mit Würmern und die Anzahl der Würmer, die bei der letzten Larvenstadium L4.
    3. Berechnen Sie die Anzahl der Würmer pro Mikroliter der M9 Puffer.
  2. Samen 700 L4-Larven auf 6 von FUDR Trockenplatten, die mit einer bestimmten Verbindung, wiederholen Sie für jede Konzentration der einzelnen Verbindung und unter sterilen Bedingungen trocknen lassen.
    1. Inkubieren Sie die Würmer bei 24 ° C von L4 für diese Stämme, wo die Wurm Lähmung nur durch erhöhen der Temperatur, wie z. B. AD Stamm38induziert wird. Zählen Sie am Folgetag des Larvenstadium L4 als D0 des Erwachsenenalters.
  3. Schalten Sie die Beleuchtung für den Tracker.
    1. Reinigen Sie die Glas-Bühne mit 70 % Ethanol und sicherzustellen Sie, dass keine Rückstände sichtbar bleibt, dann Objektivdeckel entfernen. Reinigen Sie die bildgebende Linse mit einem Druckluftspray. Stellen Sie sicher, dass die Kamera richtig eingesteckt und installiert und starten Sie die Aufnahme mit der Bild-Capture-Software.
    2. Einstellungen Sie die Kamera-um 20 Bilder/s, mit mono 16 Aufnahme Parameter Setup aufnehmen; Notieren Sie 1.200 Frames speichern im MJPEG-Format auf eine 95 % Kompressionsrate. Verwenden Sie eine leere 9 cm Petrischale um sicherzustellen, dass die Bühne auf die richtige Höhe eingestellt ist und gegebenenfalls einstellen.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Kanten der Platte in der Aufnahme sichtbar sind, da dies ermöglicht es den 'Keep-tot' Algorithmus korrekt funktioniert (Abbildung 1a).
    3. Nehmen Sie unter sterilen Bedingungen 2 Platten, die zuvor im Schritt 3.2 mit den gleichen Bedingungen und 1 Mot screening-Platte in Schritt 1.2.4 vorbereitet vorbereitet. Die Mot-Platte 3 mL der Lösung M9 hinzufügen. Verwendung anderer 2 mL der M9 zu 1/3 der Fläche von 2 Platten vorbereitet bei Schritt 3.2 auf der Mot-Teller waschen.
    4. Platzieren Sie die Mot-Platte mit ca. 5 mL der M9 Lösung und rund 600 Würmer auf die Tracker-Bühne. Fokussieren Sie die Kamera mit einem einzelnen Wurm und starten Sie die Aufnahme.
    5. Wenn die Aufnahme beendet ist, verwerfen Sie die Mot-Platte mit den Würmern; Markieren Sie die FUDR-Platten als einmal verwendet wird und wieder in den Inkubator.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.3 auf 3.3.5 für jede experimentelle Bedingung.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.3, 3.3.6 für jeden Zeitpunkt in die Erwachsenen Lebensdauer.
      Hinweis: Die Screening-Verfahren können an jedem Punkt der Erwachsenen Lebensdauer der Wurm (ca. 3 Wochen) erfolgen. Diese Protokolle ermöglichen bis zu 9 Mal Sicherheitskontrollen; die Autoren empfehlen screening alle 2 Tage ab Tag 1 des Erwachsenenalters.

4. Optimierung für diskrete Dosis Studien

  1. Bereiten Sie Würmer durch Wiederholung der Schritte 3.1.1 bis 3.1.3.
    1. Samen ca. 1000 L4 Würmer auf 5 FUDR Platten. Inkubieren Sie die Platten bei 24 ° C bis D3 des Erwachsenenalters, für Experimente mit AD38 Würmer.
  2. Mit einer sterilen Glaspipette, Transfer die Würmer unter sterilen Bedingungen von der Platte auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen, Zentrifuge bei 2.000 X g 2 min. lang vorbereitet und den Überstand zu entfernen.
    1. Die Lösung von Würmern in 1 mL der M9 Puffer auszusetzen. Übertragen Sie die Würmer zu einem Microcentrifuge Schlauch, Zentrifuge bei 300 X g für 2 min, und entfernen Sie den Überstand zu.
  3. Für Protein Transduktion 40 µL Transfektion Lieferung Reagenz und 20 µL des nativen Proteins bei der gewünschten Konzentration (in der Regel 40 µM) und bei Zimmertemperatur 30 min inkubieren.
    1. Unter sterilen Bedingungen mithilfe einer sterilen Glaspipette übertragen Würmer aus Schritt 4.2.1 zu einem Microcentrifuge Schlauch mit verkapselten Protein um ein Gesamtvolumen von 1060 µL. Ort Röhren horizontal und bei 60 u/min in einem 24 ° C Inkubator für 8 h schütteln schütteln.
  4. Unter sterilen Bedingungen eine Mot-Platte 4 mL M9-Lösung hinzu und übertragen Sie ein Microcentrifuge Schlauch Würmer plus Medikament auf die Mot-Platte zu.
    1. Der Tracker durch Wiederholung der Schritte 3.3 zu 3.3.2 eingerichtet.
    2. Unter sterilen Bedingungen eine Mot-Platte 4 mL M9-Lösung hinzu und übertragen Sie ein Microcentrifuge Schlauch Würmer plus Medikament auf die Mot-Platte zu.
    3. Die Mot Platte auf die Tracker-Bühne, fokussieren Sie die Kamera auf einen einzelnen Wurm, und starten Sie die Aufnahme. Wenn Sie fertig sind, kennzeichnen die Mot-Platte und beiseite.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 4.4.1 und 4.4.3 für alle Proben.
    5. Mit einer Glaspipette, übertragen Würmer unter sterilen Bedingungen aus der Mot-Platte auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen, Zentrifugieren bei 2.000 X g für 2 min. entfernen überstand, Transfer das Pellet auf einem Teller FUDR und unter sterilen Bedingungen trocknen lassen.
    6. Wiederholen Sie Schritt 4.4.5 für alle Proben.
  5. Inkubieren Sie die Würmer bei 24 ° C bis D6 des Erwachsenenalters.
    Hinweis: Auch sind mehrere Antikörper Inkubationen möglich.
  6. Die Mot-Platte 3 mL des Puffers M9 hinzu und verwenden Sie 2 mL der M9-Lösung, um die Würmer aus einer FUDR-Platte auf der Mot-Teller waschen.
    1. Der Tracker durch Wiederholung der Schritte 3.3 zu 3.3.2 eingerichtet.
    2. Die Mot Platte auf die Tracker-Bühne, fokussieren Sie die Kamera wie nötig, und starten Sie die Aufnahme. Wenn die Aufnahme beendet ist, verwerfen Sie die Mot-Platte oder für weitere screening bei Bedarf wiederherzustellen.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 4,6 bis 4.6.2 für alle Proben.

5. Analyse der Videodaten

  1. Nach dem Erwerb der Videos, wählen Sie die entsprechenden Parameter in der GUI (Abbildung 2)-Software für die Datenanalyse.
    1. Laden Sie einzelne oder mehrere Videos über die Browsing -Funktion. Wählen Sie einen Ausgabeordner Ziel. Stellen Sie sicher, dass 600 bis 1.200 Frames für eine 30 s-Analyse verwendet werden.
      Hinweis: Eine Reihe von Frames kann analysiert werden.
    2. Legen Sie einen Pixel mm Umrechnungsfaktor 0.029 für imaging ein 9 cm Petrischalen bei voller Auflösung werden. Wählen Sie den Tracking-Algorithmus 'keep tot'.
      Hinweis: Der Umrechnungsfaktor hängt das Sichtfeld verwendet. Z-Transformation Algorithmus kann auch als Alternative verwendet werden.
    3. Füllen Sie die Parameter im Abschnitt Lokalisierung (Abbildung 2): Z verwenden Sie Bilder = 100, Z padding = 3 Std Pixel = 54, Schwelle = 9, Öffnung = 1, Schließen = 2. Passen Sie die Filter -Parameter auf minimale Größe = 20, maximale Größe = 180, Endlosschraube-wie = 0,94.
    4. Stimmen die Forming Trajektorien -Parameter: maximale Entfernung zu bewegen = 10; Minimale Länge = 150, Speicher = 10.
    5. Kurven und Geschwindigkeit Parameter einstellen. Verwenden Sie 1,8 für Bend Schwelle, 0 für Minimum beugtund 150 für Frames, Geschwindigkeit zu schätzen.
    6. Stimmen Sie die Toten Wurm Statistiken. Verwenden Sie 5.0 für maximale schlagen pro Minute und 1.0 für maximale Geschwindigkeit.
    7. Wählen Sie die Ausgabe-Ordner. Die Anzahl der Ausgabe-Frames auf 50 festgelegt. Setzen Sie die Schriftgröße auf 10.
      Hinweis: Wählen Sie gegebenenfalls eine oder mehrere Regionen von Interesse (ROIs).
  2. Testen Sie die Parameter mithilfe der Beispiel -Funktion. Die Beispielbilder aus und überprüfen Sie, ob die Würmer in die 8 Schritte der Schwellwerte (Abbildung 1) sichtbar sind.
  3. Verwenden Sie die Funktion Auftrag starten .
  4. Analysieren Sie die Textdateien Ergebnis durch die Kombination der einzelnen Ergebnisse für das gesamte Dataset. Verwenden Sie den Export Tsv-Funktion in der GUI.
    Hinweis: Optional können einzelne Kennzahlen der Würmer für Bevölkerungsstudien berücksichtigt werden.
    1. Analysieren von Daten mit einer Statistiksoftware.

Ergebnisse

Die einfache Bedienung, multiparametric Analyse und hohen Durchsatz des illustrierten WF-NTP-Protokolls (Abbildungen 1 und 2) macht es möglich, sehr kleine Veränderungen im Verhalten der Wurm in gewissem Sinne sehr genau zu bestimmen. Die Image-Plattform basiert auf maßgeschneiderte Opto-Mechanik, und mit einer 6 MP Monochrom Kamera kombiniert mit 16 mm Brennweite mit hoher Auflösung Objektiv für 1''-Sensor, beleuchtet mit 8'' 8'' weiße Hintergrundbeleuchtung montiert werden (siehe Tabelle der Materialien und auch36 für weitere Details). Die damit verbundenen WF-NTP-Software ist in Python geschrieben und wurde entwickelt, um auf Windows-Plattformen ausgeführt werden. Es läuft auf eine benutzerdefinierte zusammengebauten Computer mit 3,00 GHz Octa-Core-Prozessor und 64 GB Arbeitsspeicher (RAM). Die Software wurde auch entwickelt, um die Arbeit und video-Analyse auf Basis der RAM und CPU des Computers zu parallelisieren; d. h., eine Maschine mit einer niedrigeren Leistung Berechnung führt zu weniger Videos laufen parallel. Das Setup verwenden wir derzeit ist optimiert, um die Ausführung bis ca. 16 Videos parallel und kann eine Analyse von ca. 100 Videos über Nacht abgeschlossen. Darüber hinaus ermöglicht die hohe Detailgenauigkeit der Anpassung in die GUI von den WF-NTP-Server zur Verfügung gestellt große Kontrolle über die Qualität der bildgebenden Analyse. Die GUI kann verwendet werden, große Datasets in parallel oder einzelnen Videos direkt hochladen; bestimmte Frames können auch für detaillierte Sub-Analyse, zusammen mit einem Umrechnungsfaktor Pixel ausgewählt werden, die verwendet werden können, um Verhaltensstörungen Metriken zu schätzen. Eine der zwei verschiedenen Tracking-Algorithmen (halten Sie tot und Z-Transformation) kann gewählt werden, je nachdem, ob der Benutzer gelähmte Tiere in der Analyse zu betrachten. Die Schwellwerte Parameter kann dran entsprechend mit dem Video und experimentelle Qualität sein. Das Öffnen und schließen-Parameter erlauben dem Benutzer, das Rauschen zu entfernen und die Schwellwerte Funktionalität weiter durchzuführen. Der skeletonizing-Algorithmus bietet eine alternative Methode der Analyse. Die Objekt Größe Cut-Offs (Filterung) bieten einen zusätzlichen Filter für Hintergrundgeräusche und die Wurm-ähnliche Parameter ermöglicht dem Benutzer zu prüfen, Würmer nur Objekte mit einem Ellipsoid Form, daher die Unterscheidung von anderen Objekten, die die gleiche Pixelgröße des möglicherweise die Würmer. Nach diesen Eingriffen Schwellwerte der resultierenden gekennzeichneten Regionen identifiziert werden können, als einzelne Würmer und die Positionen dieser Regionen sind dann für jeden Frame zur späteren Analyse und Verfolgung gespeichert. Die Exzentrizität der jeweils verfolgten Wurm wird verwendet, um den Wurm Metriken wie das Ausmaß der Wurm biegen (BPM) als Funktion der Zeit zu schätzen. Die Benutzer können auch wählen die Anzahl der Frames verwendet, um einen Wurm in die Erinnerung an die Software nach Kollisionen zu halten, und die Anzahl der Pixel, die ein Wurm zwischen Frames bewegen kann kann auch abgestimmt werden, um die Tiere vor dem Lärm zu unterscheiden. Die minimale Track-Länge-Option ermöglicht dem Benutzer, Würmer zu verwerfen, die für nur ein paar Frames verfolgt worden. Andere wichtige Parameter, wie Kurven und Geschwindigkeit, erlauben dem Benutzer, wählen den Grad der Biegung notwendig als ein Körper-Kurve und die Anzahl der Frames, die benötigt werden, um die Geschwindigkeit der Tiere zu schätzen als gezählt werden. Cut-off Parameter können weiter für die Aufnahme der Gelähmte Tiere abgestimmt werden. Die Ausgabe wird automatisch in die Ergebnisdateien dargestellt. Diese Werte gelten als Obergrenzen für die Bewertung des Anteils der Gelähmte Tiere. Der Benutzer kann auch eine oder mehrere Regionen von Interesse auswählen. Diese Funktion ist besonders nützlich, um Subpopulationen der Würmer zu analysieren und die Ausgabe wird automatisch in den Ergebnisdateien sortiert. Die Ausgabeoption ermöglicht dem Benutzer, wählen die Ausgabe-Ordner und die Anzahl von tracking-Frames, die für sie produziert werden. Verschiedene Tool-Sets können auch für weitere Datenanalyse verwendet werden, wie z. B. das Grundstück Werkzeug "Pfade", das einzelnen Wurm Spuren zeigt und das fingerprinting Tool, das dem Benutzer erlaubt, Fingerabdruck erstellen Karten.

Diese Methodik ermöglicht neue Ansätze verabschiedet werden, nicht nur für biologische Studien von C. Elegans , sondern auch für pharmakologische und medizinische Forschungszwecke wie Hochdurchsatz-Screening von Genveränderungen und medikamentöse Behandlungen. Wir haben dieses Potenzial gezeigt, indem Sie beschreiben die Charakterisierung der Phänotypen für große Bevölkerungsstudien (N > 1000) von Wurm-Modelle Neurodegenerative Erkrankung (frontotemporale Demenz (FTD)39, Parkinson-Krankheit (PD)7 , Alzheimer-Krankheit (AD)16,40, und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS)19 (Abb. 3a) und die Auswirkungen von potenziellen therapeutischen Molekülen mit Wurm-Modellen von PD18 und AD Charakterisierung 15,12 (Abb. 3 b). Zwei kleine Moleküle, wenig18 und Bexaroten15, wurden in Konzentrationen bis zu 25 µM verabreicht, PD (Abb. 3 b) und 10 µM bis AD38 (Abb. 3 b) Würmer, beziehungsweise. Beide Verbindungen zeigten klare Dosis-abhängige Effekte über den Bereich der Konzentrationen getestet. Wir haben gezeigt, dass diese hohe Genauigkeit der Messungen erfolgt durch Erhöhung der Anzahl der Würmer, die analysiert werden können, im Vergleich zu herkömmlichen Methoden (Abb. 3 c). Wir haben die Wichtigkeit des Stichprobenumfangs (Abb. 3 c) molekulare Screening-ebenso wie in Charakterisierung der mutierte Stämme illustriert. Der Anstieg der Temperatur von 20 ° C führt zu etwa der Hälfte der AD Würmer gelähmt nach 3 Tagen des Erwachsenenalters. Wurm-Populationen liefen unter verschiedenen Bedingungen, z. B., , wenn Würmer über 42-Rückstände aus der β-Amyloid-Peptid (Aβ1-42) zum Ausdruck (AD Würmer), dezente Temperaturschwankungen (Abbildung 3 c, Links ausgesetzt waren (Panel), Aβ1-42 ausgedrückt wurde, in den Neuronen (Abbildung 3 c, Mitteltafel), oder wenn AD Würmer Bexaroten (Abbildung 3 c, rechts) ausgesetzt waren. Würmer wurden auch aus kleinen ROIs zufällig aus der volles Sehfeld der Videos mit den WF-NTP-Server (N < 50, gelbe Balken) Hervorhebung des Vergleichs der Motilität dieser Würmer mit der durchschnittlichen Motilität der ganze Wurm Bevölkerung (N erworben analysiert. < 1.000). In den Panels scheint der Unterschied gemessen im großen und ganzen Wurm Bevölkerung statistisch signifikant mit p ≤ 0,0001 (*).

Die hier beschriebenen WF-NTP-Protokoll ermöglicht auch die gleichzeitige Aufnahme von mehreren Parametern (Abbildung 1 b) zu unterstützen, auf eine optimale Weise interne Validierung und die Entwicklung eines umfassenden Fingerabdrucks eine Vielzahl von Bedingungen im Vergleich zu einer Kontrollprobe, damit sinnvolle Vergleiche über mehrere Studien. Dieser Multi-parametrischer Ansatz beinhaltet die gleichzeitige Analyse mehrere Verhaltens Funktionen, einschließlich biegen, Frequenz, Geschwindigkeit, Lähmung Preis, Größe, Biegung Amplitude und Biegung Verschiebung36. Dies ermöglicht Tausende von Tieren im Detail und auf eine sehr hohe Empfindlichkeit und statistische Signifikanz überwacht werden und bietet Möglichkeiten für große Populationen Studien. Diese Tracking-Verfahren hat auch den Vorteil, dass Lähmung Studien Parallel mit anderen Verhaltensstörungen Messungen, ein wesentliches Merkmal in molekulare Screening-Untersuchungen durchgeführt werden.

Die Ergebnisse, die bislang in AD15,34,35 und PD18 Wirkstoffforschung erreicht haben zeigen die Bedeutung der breiten Sichtfeld Datenerfassung beträchtlich erhöhen die Anzahl der Tiere, die sein können überwacht in einem einzigen Experiment, erheblich verringern die experimentellen Fehler und die statistische Validität der Studien erheblich verbessert. Basierend auf diesen Ergebnissen, erwarten wir, dass das WF-NTP-Protokoll, das wir für die Gemeinschaft36verfügbar gemacht, die Verwendung von C. Eleganserheblich erweitert werden.

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Bild 1: WF-NTP Analyseschritte und Beispiel eines Fingerabdrucks. (ein) 1. Original-Video. (2) Hintergrundbild. 3. Hintergrund subtrahiert Bild. 4-6. Schnittstellenüberwachung Schritte. 7-9. einheitliche Kennzeichnung von Würmern. (b) mehrere Phänotypen werden mit einem Fingerabdruck für Wildtyp Würmer und Wurm Modelle der PD und AD. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 2: grafische Benutzeroberfläche (GUI) des WF-NTP. Bestimmte Videos und ausgewählte Frames in der GUI für die Analyse ausgewählt werden können, und ein Umrechnungsfaktor Pixel können eingefügt werden, wonach die Analyse wird mit einer der zwei gegebenen Tracking-Algorithmen durchgeführt. Es ist möglich, den Grad der Biegung muß als ein Körper-Kurve sowie die Anzahl der Frames benötigt, um die Geschwindigkeit der Tiere schätzen zählen auswählen. Körper Kurven und Geschwindigkeit Schwellen bestimmen die gelähmten Wurm-Statistiken. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 3: Beispiele für Anwendungen von der WF-NTP-Methode. (ein) Anwendung von WF-NTP in großen Bevölkerungsstudien (N > 1.000) BPM Messungen bei C. Elegans Modelle verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen einschließlich FTD, PD, AD, und ALS. (b) Anwendung der WF-NTP in der Wirkstoffforschung. (c) Bedeutung der Bevölkerungsstudien in Mutante Charakterisierung Temperaturempfindlichkeit und Wirksamkeit von Arzneimitteln. Phänotypen von Subpopulationen N < 50 (gelber Balken) sind verglichen mit denen der ganze Wurm Bevölkerung (N < 1.000). Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Durch die zügige Expansion von Techniken im Bereich der optischen Wissenschaften ist es nun möglich, die Voraussetzung für die automatisierte Methoden in C. Elegans Studien wesentlich neue Wege anzusprechen. Infolgedessen haben eine Reihe von digitalen Plattformen20,41,42,43,44,45,46 tracking entworfen und hergestellt zur Verfügung über den letzten Jahren um manuelle Zählung der Parameter wie Geschwindigkeit der Bewegung, biegen, Frequenz, Lähmung Rate sowie komplexere Formen von Verhaltensweisen wie Omega Wendungen und Lebensdauer Messungen zu ersetzen. Jüngsten automatisierte Plattformen haben sich deutlich verbessert die Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit von C. Elegans 41 und hohe Datenqualität auf kleinen Kohorten oder auch einzelne Tiere zur Verfügung gestellt. Wir beschlossen, die Automatisierung der Analyse der Wurm Verhalten machen es auch möglich, die Phänotypen der Kohorten von Tausenden von Tieren parallel zu bewerten zu verlängern. Der wesentliche Vorteil des Ansatzes der Wurm Kohorten zu studieren ist, dass es für die Buchhaltung für die hohe intrinsische Variabilität der Wurm Verhalten24 und die Tatsache, die dass Medikament Behandlungsstudien oft subtilen phänotypische Variationen, führen die schwierig, mit ausreichend statistische Signifikanz zu erkennen, wenn eine kleine Gruppe von Tieren verwenden. Eine hohe Leistung der Erkennung (POD) ist in der Tat notwendig, um mit Zuversicht signifikante Abweichungen im Verhalten erkennen und falsch positive Ergebnisse25begrenzen.

Hier haben wir eine Reihe von Protokollen basierend auf eine kürzlich berichtet automatisierte Screening-Methode für C. Elegans, das breite Sichtfeld Nematoden tracking-Plattform (WF-NTP)36beschrieben. Das hier beschriebene Protokoll gliedert sich in 5 Teile. Teile 1 und 2 beschreiben die Vorbereitung der großen Wurm Populationen. Wichtige Schritte sind die Sterilität der Arbeitsbedingungen und Vorbereitung der Reagenzien und Platten erforderlich, die Experimente auszuführen. Wir stellen fest, dass aufgrund der erhöhten Durchsatz durch dieses Protokoll im Vergleich zu anderen screening-Methoden36zur Verfügung gestellt, es auch erhöhte Mengen an Reagenzien erfordert; dieser Faktor muss sorgfältig in das experimentelle Design berücksichtigt werden. Wir beachten auch, dass die bleichende Schritt ist entscheidend und muss im Voraus als eine große Anzahl von Eiern getestet werden und gesunde Larven notwendig sind, um diese Experimente laufen. Teil 3 dieses Protokoll beschreibt, wie Sie Drogen in festen Medien und Bildschirm Wurm Bevölkerung liefern. Wir stellen fest, dass dieser Teil des Protokolls ist stark abhängig von der Anzahl der Medikamente und Drogen-Konzentrationen durch den Benutzer parallel getestet werden. Die vollständige Automatisierung der Screening-Verfahren und schnelle Datenerfassung den limitierenden Schritt vom Verhaltensbeobachtung Reagenz Vorbereitung und Wachstum und Synchronisation von großen Wurm Populationen verlagern. Die wichtigsten Schritte während der behavioral Vorführung sind die Timings der Aufnahme und jeder Wurm Umgang mit Schritte (z.B. die Übertragung von Würmern aus der NGM-Platten, die Tracking-Plattform). Das hier beschriebene Protokoll ist ein Beispiel, entworfen, um die Würmer Bildschirm für bis zu 9 Tage während der Erwachsenen Lebensdauer; jedoch kann dieses Protokoll auf dem Bildschirm so viele Zeitpunkte wie der Benutzer, z. B. 18 aufeinander folgenden Tagen36 wünschtleicht angepasst werden. Teil 4 zeigt dann die Anwendung des Protokolls zu Eiweiß-Molekülen (z. B. Antikörper und molekulare Chaperone) liefern in C. Elegansund zeigt, wie das Protokoll in Teile 1 bis 3 dargestellten leicht, je nach gewünschter angepasst werden kann Anwendung. Wir zeigen, wie dieses Verfahren nicht nur auf die Lieferung von Drogen wie Moleküle, sondern auch für die Verwaltung der molekularen Chaperone oder Antikörper37verlängert werden kann. Die ersten vier Schritte (Teile) werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Alle flüssigen Bestandteile sollte vor Gebrauch autoklaviert und die Inkubationsschritte sollten durchgeführt werden, bei 70 % relativer Luftfeuchtigkeit. In Teil 5 beschreiben wir gewusst wie: verwenden Sie das Software-Paket in Kombination mit der Tracking-Bühne zur Verfügung gestellt. Diese Software wurde entwickelt für die Analyse von WF-NTP Daten in Bezug auf das Verhalten der großen Wurm Populationen. Wir empfehlen, dass der Benutzer die Richtlinien für die Datenanalyse in Teil 5 folgt; Diese Parameter sind jedoch abhängig von den Besonderheiten der aufgenommenen Videos (fps, Blickfeld, video-Auflösung, Anzahl der erworbenen Bilder). Die Beispiel-Funktion zur Verfügung gestellt in der GUI wurde entwickelt, um die Auswertung der richtigen Parameter vor der Analyse zu erleichtern.

Diese Reihe von Protokollen machen es möglich, die Phänotypen der große Populationen von C. Elegans (derzeit bis zu 5.000 einzelne Würmer parallel) agierende reduziert Artefakte aufgrund der inhärenten Variabilität des Verhaltens der Tiere , im Einvernehmen mit Vorstudien auf die Macht der Erkennung notwendig, statistischen Signifikanz für Studien von C. Elegans25zu erreichen. Die Plattform nutzt ein System von hochauflösenden Kameras, die in der Lage, Aufnahmen einer großen Anzahl von Tieren mit hoher Geschwindigkeit, während gleichzeitig aufzeichnen mehrerer große Kohorten. Die hohe Leistung und hohen Durchsatz von WF-NTP-Protokoll macht es möglich, sehr kleine Veränderungen im Verhalten der Wurm in gewissem Sinne sehr genau zu bestimmen. Diese Methode ermöglicht somit, neue Ansätze gelten nicht nur für das Studium der Biologie von C. Elegans, sondern zusätzlich pharmakologische und medizinische Forschung, wie die Hochdurchsatz-Screening von Genveränderungen und Droge Behandlungen. Dieses Verfahren hat auch den Vorteil, dass Lähmung Studien Parallel mit anderen Verhaltensstörungen Messungen, ein wesentliches Merkmal in molekulare Screening-Untersuchungen durchgeführt werden.

Die Ergebnisse, die bislang in Drug Discovery-Programme AD15,34,35 und PD18 erreicht haben zeigen die Bedeutung der breiten Sichtfeld Datenerfassung erheblich steigern die Anzahl der Tiere, die in einem einzigen Experiment, dadurch erheblich verringern die experimentellen Fehler und erheblich verbessert die statistische Validität Studien überwacht werden können. Während der aktuelle Ansatz in diesem Protokoll beschriebenen konzentriert hat, um Herausforderungen im Bereich der Arzneimittelforschung, wir hoffen, dass die Methodik in der Gemeinschaft allgemein angenommen wird und seine Anwendung auf genetische Anlage erweitert werden soll und Verhaltensstudien und erweitern die Anzahl der Phänotypen, die derzeit nachweisbar sind.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte gibt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Zentrum für Fehlfaltung Krankheiten (CMD) unterstützt. FAA wird unterstützt durch einen Senior Research Fellowship Award von der Alzheimers Gesellschaft, UK (Grant Nummer 317, AS-SF-16-003). C. Elegans Stämme wurden von den Caenorhabditis Elegans genetischen Zentrum (CGC) erhalten.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Consumable reagents
monobasic potassium phosphateSigma AldrichP0662
dibasic sodium phosphateSigma AldrichS3264
sodium chlorideSigma Aldrich13422
magnesium sulphateSigma AldrichM7506
AgarSigma AldrichA1296
Difco casein digestScientific Laboratory Supplies211610
calcium chloride dihydrateSigma AldrichC3881
cholesterolAcros110190250
absolute ethanolVwr20821.33
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98%Alfa AesarL16497.ME
LB medium capsulesMP biomedicals3002-031
13% sodium hypochloriteAcros OrganicsAC219255000
Sodium hydroxideFisher ChemicalS/4880/53
NameCompanyCatalog NumberComments
Strains
E. coli strain OP50Supplied by CGCOp50E coli strain
C. elegans strain wild typeSupplied by CGCN2C. elegans strain
C. elegans strain ADSupplied by CGCGMC101C. elegans strain
C. elegans strain PDSupplied by CGCNL5901C. elegans strain
C. elegans strain ALSSupplied by CGCAM725C. elegans strain
C. elegans strain TauSupplied by CGCBR5485C. elegans strain
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Tactrol 2 AutoclavePriorclave
9 cm sterile Petri dishesFisher Scientific11309283
2 L erlenmeyer flasksScientific Laboratory SuppliesFLA4036
Nalgene 1 L Centrifuge potsFisher Scientific3120-1000
RC5C plus floor mounted centrifugeSorvall9900884
15 mL centrifuge tubesFisher Scientific05-539-12
Heraeus Multifuge X3RThermofisher scientific75004515
Inoculating SpreadersFisher Scientific11821741
M4 multipetteEppendorf4982000012
P1000 pipetteEppendorf Research Plus
P200 pipetteEppendorf Research Plus3123000055
P10 pipetteEppendorf Research Plus3123000020
1,000 μL low retention tipsSarstedt
300 μL low retention tipsSarstedt70.765.105
10 μL low retention tipsSarstedt70.1130.105
pipeteboy 2VWR612-0927
50 mL serological pipetteAppleton WoodsCC117
25 mL serological pipetteAppleton WoodsCC216
10 mL serological pipetteAppleton WoodsCC214
glass pipette 270 mmFisherbrandFB50255Camera for videos recording
pulsinPolyplus Transfection501-04Transduction reagent
Multitron Standard shaking incubatorInfors HTINFO28573
air dusterOffice Depot1511631
NameCompanyCatalog NumberComments
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software
8'' by 8'' BacklightEdmond Optics88-508Tracker component
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensorEdmond Optics86-571Tracker component
6 Mpx cameraEdmond Optics33540Tracker component
FlyCapture SoftwarePointGreySDK v2.12Image capture software
WF-NTP SoftwareCambridge Enterprisev1.0Image analysis software
Office PackageMicrosoftOffice 365Statistical analysis software

Referenzen

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