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Resumo

Descrevemos os protocolos para a utilização da plataforma de controle de nematoides amplo campo de visão (WF-NTP), que permite alta produtividade Caracterização fenotípica de grandes populações de Caenorhabditis elegans. Estes protocolos podem ser usados para caracterizar mudanças comportamentais sutis em cepas mutantes ou em resposta ao tratamento farmacológico de forma altamente escalável.

Resumo

Caenorhabditis elegans é um modelo animal bem estabelecido na investigação biomédica, amplamente empregada em genômica funcional e estudos de envelhecimento. Para avaliar a saúde e a aptidão dos animais em estudo, um normalmente se baseia em leituras de motilidade, tais como a medição do número de dobras do corpo ou a velocidade de movimento. Estas medidas geralmente envolvem a contagem manual, tornando-se desafiador para obter boa significância estatística, como tempo e restrições de trabalho muitas vezes limitar o número de animais em cada experimento para 25 ou menos. Desde alta potência estatística é necessária para obter resultados reprodutíveis e limitar resultados falsos positivos e negativos quando fracos efeitos fenotípicos são investigados, recentemente foram feitos esforços para desenvolver protocolos automatizados focados em aumentar a sensibilidade de detecção de motilidade e perfis comportamentais multi paramétrico. A fim de ampliar o limite de detecção para o nível necessário para capturar as alterações fenotípicas pequenas que muitas vezes são cruciais em estudos genéticos e descoberta da droga, nós descrevemos aqui um desenvolvimento tecnológico que permite o estudo de até 5.000 animais individuais simultaneamente, aumentando o poder estatístico das medições por cerca 1,000-fold em relação ao manual de ensaios e tal 100-fold em comparação com outros métodos automatizados disponíveis.

Introdução

Cerca de meio século atrás, Sydney Brenner introduzido Caenorhabditis elegans (c. elegans) como um sistema modelo para estudar o desenvolvimento e a neurobiologia, como este pequeno (1 mm em comprimento), verme nematoide transparente é fácil de manipular geneticamente e manter no laboratório1. Hoje, o c. elegans é usado para estudar uma grande variedade de processos biológicos, incluindo apoptose, sinalização celular, a natureza do ciclo celular, regulação gênica, metabolismo e envelhecimento2. Além disso, a complexidade celular e tecidos, testes padrões da expressão da proteína e a conservação dos caminhos de doença entre c. elegans e organismos superiores (80% dos genes de verme tem um orthologue humano), vinculado com a simplicidade e rentabilidade do cultivo, torná-lo um organismo modelo eficaz na vivo passível de alto rendimento genético3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 e drogas14,15,16 seleções. Por todas estas razões, c. elegans tem sido empregado para a caracterização de normais e doença relacionada com vias moleculares; no campo de neurodegeneração, por exemplo, permitiu a exploração dos efeitos do envelhecimento na proteína agregação3,4,7,15,17, 18e a caracterização dos promotores e inibidores de proteína agregação3,4,5,6,7,14, 18.

A adequação global dos vermes, que é um importante parâmetro comportamental para ser definidos nesse tipo de estudo, pode ser medida manualmente em uma variedade de maneiras, tais como pela contagem do número de curvas do corpo por minuto (BPM)4,6, 19, ou medindo a velocidade de movimento20,21,22, bem como medindo-se a esperança média de vida e as taxas de paralisia. Embora medição manual das curvas do corpo e da velocidade de movimento tem levado muitos insights importantes sobre uma variedade de vias moleculares e mecanismos3,4,14,19, 20,23, ensaios manuais permanecem atualmente baixa produtividade, altamente trabalhosa e demorada enquanto ser propensa a erros e preconceitos humanos. Essas questões apresentam desafios consideráveis na recolha de dados com poder estatístico suficiente para distinguir sutis mudanças de comportamento. Essa limitação é particularmente relevante para droga triagem como tratamentos com drogas potenciais moléculas muitas vezes levam a pequenas alterações fenotípicas24, exigindo, portanto, o estudo de um grande número de animais a fim de adquirir resultados reprodutíveis. Para ilustrar este ponto, estudos recentes têm mostrado que um alto poder de deteção (POD) é necessário para definir, com confiança, quaisquer alterações significativas no comportamento e limitar resultados falso-positivos25. Isto resultou em uma forte motivação na Comunidade c. elegans para substituir a contagem manual com medições reproduzíveis, automatizado, tempo - e cost - effective. Para atender esta demanda, vários laboratórios recentemente desenvolveram métodos para medições de alta sensibilidade e monitoramento de verme precisa de maior número de minhocas22,26,27,28 ,29,30,31,32,33.

A fim de expandir ainda mais o processo de automação para as grandes coortes de animais necessários para medições estatisticamente significativas, recentemente desenvolvemos um amplo campo de visão de nematódeo rastreamento de plataforma (WF-NTP)15,34 ,35,36, que permite a investigação simultânea de múltiplas leituras fenotípicas em populações de verme muito grande, um fator chave na deteção fenotípica estatisticamente relevantes25. Não só pode o WF-NTP atualmente monitorar até 5.000 animais em paralelo, mas as leituras fenotípicas também incluem vários parâmetros, incluindo a frequência e a amplitude das curvas do corpo, a velocidade de movimento, a fração da população que está paralisada, e o tamanho dos animais. É, portanto, prontamente possível tela milhares de vermes em paralelo e combinar as diferentes leituras em um mapa comportamental para criar uma impressão digital multidimensional36. O software open-source associado é escrito em Python, que também é necessária para operá-lo e é completamente personalizável. Uma interface de usuário gráfica (GUI) também é fornecida para permitir que os usuários a adotar esta tecnologia.

Aqui, apresentamos uma série de protocolos que ilustram algumas das aplicações potenciais do WF-NTP. Em particular, discutimos a administração de compostos, variando de pequenas moléculas a terapêutica de proteínas e descrevem como tela seus efeitos diretamente sobre grandes populações de minhocas, eficazmente eliminando assim a necessidade de amostra pequeno sub-populações. O uso do WF-NTP para tal finalidade já trouxe vantagens significativas nos procedimentos destinados para projetar programas de descoberta de drogas da doença de Alzheimer (AD)15,34,35 e a doença de Parkinson (PD)18 usando dados in vivo para avaliação dos candidatos terapêutico35,37.

Protocolo

1. preparação de materiais para protocolos de c. elegans

  1. Para preparar uma solução de tampão x M9 10, adicione 30 g de fosfato de potássio monobásico, 60 g de fosfato de sódio dibásico e 50 g de cloreto de sódio a uma garrafa de autoclavável 1 L.
    1. Adicione 1 litro de água purificada e autoclave em ca. 121 ° C por 15 min.
    2. Dilua 10 vezes em água purificada e autoclave a ca. 121 ° C por 15 min.
    3. Quando esfriar, adicione 1 mL de uma solução 1m de sulfato de magnésio.
      Nota: Apenas 1 x M9 (M9) deve ser usado para worm manipulação nas etapas a seguir.
  2. Para preparar o meio de crescimento de nematoides (Rich-NGM), misture 2,7 g de cloreto de sódio, 15,75 g de ágar-ágar, 5,75 g de caseína, 900 mL de água purificada e autoclave a 121 ° C por 15 min.
    1. Transferir o meio de Rich-NGM para um forno de aquecimento (ca. 70 ° C), se não usado imediatamente; o Rich-NGM pode ser mantido derretido a ca. 70 ° C durante até 12 h antes de se tornar inutilizável.
    2. Para o Rich-NGM misturar, adicionar 900 µ l de uma solução 1m de cloreto de cálcio, 900 µ l de uma solução 1m de sulfato de magnésio e 900 µ l de uma solução de colesterol de 5 mg/mL em etanol absoluto.
      Nota: Colesterol não necessita de usar antes da autoclavagem.
    3. Para preparar as placas experimentais que mantêm uma população de idade síncrono, adicione 92 µ l de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUDR) em 812 µM a 900 mL de Rich-NGM.
      Nota: FUDR é tóxico e cancerígeno, por isso é essencial usar luvas de nitrilo além de jaleco e óculos de segurança. Não permita que resíduos de entrar resíduos gerais de fluxo e alienar por incineração com um pós-combustor.
    4. 20 mL do Rich-NGM autoclavado despeje um 9cm Petri estéril para gerar uma placa de crescimento (placa de Rich-NGM). 15 mL da Rich-NGM autoclavado despeje um 9cm Petri estéril para preparar um prato de motilidade (placa de Mot). Deite 20 mL de Rich-NGM com FUDR em um prato de Petri estéril de 9cm para gerar uma placa FUDR.
      Nota: O volume baixo ágar da placa Mot facilita a câmera focar e verme (ver passo 3.2.5) de rastreamento.
  3. Preparar a estirpe OP50 Escherichia coli , por autoclave 1 L de caldo LB a 121 ° C por 15 min e inocular com cultura starter quando resfriado.
    1. Permitir que a cultura bacteriana a crescer durante a noite a 37 ° C e esterilize o tubo deve ser usado por centrifugação.
    2. Transferi as bactérias para tubos estéreis e centrifugar 4.600 x g por 15 min.
    3. Decante o sobrenadante e, usando a água estéril, suspender em 10% do volume original para criar 10 x (10 vezes concentrada) OP50 estoque.
    4. Diluem-se 15 mL do estoque x OP50 10 a 150 mL para gerar 1 x OP50, usando água estéril, antes de serem utilizados para propagar as placas Rich-NGM. Uso o restante 10x solução para placas FUDR de semente.
      Nota: As placas Mot permanecerão não-semeadas e serão usadas somente na etapa de aquisição de imagem.
  4. Para placas de sementes com bactérias, segregar o Rich-NGM e placas FUDR.
    1. Sob condições estéreis, adicione 350 µ l de 1 x OP50 para Rich-NGM placas e espalhe uniformemente.
      Nota: Não se espalhou para a borda da placa como vermes rastreará os lados da placa e morrer.
    2. Sob condições estéreis, adicione 350 µ l de 10 x OP50 para FUDR placas e espalhe uniformemente.
    3. Permitir que as placas secar e incubar a 20 ° C para 2 d antes do uso.

2. preparação de c. elegans para uso com o WF-NTP

  1. Manter o c. elegans em placas de Rich-NGM ou pela transferência de uma pequena quantidade de ágar contendo vermes de face para baixo em uma nova camada bacteriana. Manter as cepas de c. elegans dessa maneira antes de iniciar os protocolos experimentais.
  2. Usando a técnica de transferência (ver passo 2.1), 20 placas de sementes de cada estirpe usa minhocas estágio bem alimentados, misto e permitir-lhes a crescer para 2 d a 20 ° C.
  3. Lave a 5 placas contendo vermes com 15 mL de M9 e piscina em um tubo de 15 mL. Repita para todas as 20 placas de todas as estirpes.
  4. Centrifugue os vermes a 2.000 x g por 2 min, remover o sobrenadante e suspender em 2 mL de solução de M9.
  5. Prepare-se 10 mL da solução de branqueamento através da mistura de 13% de hipoclorito de sódio e hidróxido de sódio 4m em uma proporção de 3:2 vol/Vol.
    Nota: Esta solução não requer esterilização em autoclave. Ambos os componentes e a solução resultante são corrosivos e devem ser manuseados com cuidado, usando luvas de nitrilo. Hidróxido de sódio é levemente corrosivo para vidro e deve ser armazenado em recipientes de plástico.
  6. Adicionar 1 mL de solução de branqueamento para cada tubo de centrifugação e agitar vigorosamente durante aproximadamente 3,5 min ou até a cutícula totalmente dissolvido.
  7. Sob condições estéreis, dilua as amostras para 15 mL M9 e centrifugar a 2.000 x g por 2 min. Retire o sobrenadante e suspender em 15 mL de solução de M9.
  8. Repita a etapa 2,7 6 vezes, até que apenas ovos de verme permanecem, e a solução já não tem um odor de cloro.
  9. Centrifugar as amostras a 2.000 x g por 2 min, remover o sobrenadante e suspender em 2 mL de solução de M9.
  10. Sob condições estéreis, use uma pipeta de vidro estéril para transferir 2ml de M9 contendo ovos em cada poço de uma placa de cultura de tecido 12-bem e incubar a 20 ° C, durante um mínimo de 16 h.
    Nota: Use placas separadas para cada estirpe para evitar contaminação cruzada. A etapa de transferência dos tubos de centrífuga para a ajuda de vários poços para evitar asfixia do worm.
  11. Transferi os vermes que eclodiram durante a noite as chapas 12-poços em tubos de centrífuga de 15 mL. Tomar 3 gotas de 5 µ l de solução de verme e contar o número de vermes presentes na primeira fase larval (L1).
  12. Calcule o número de vermes por µ l de solução.
  13. Semente L1 vermes nas chapas de Rich-NGM em 3.000 worms por placa e permitir-lhes a crescer durante 2 dias a 20 ° C, até atingirem a última etapa de estágio larval (L4).

3. general WF-NTP protocolo

  1. Adicionar 2,2 mL de cada medicamento composto na concentração apropriada (tais como 25 ou 10 mM para drogas como squalamine18 e bexaroteno15, respectivamente) para FUDR 6 placas e deixar para secar em condições estéreis para cada desejado worm estirpe.
    Nota: Essa etapa é repetida para cada composto sob exame, para cada concentração e cada solvente utilizado.
    1. Lave os vermes fora 5 placas de Rich-NGM preparados no passo 2.13 usando 15 mL de tampão de M9 e transfira os vermes para um tubo de centrífuga.
    2. Centrifugar a 2.000 x g por 2 min, remover o sobrenadante e suspender em 3 mL de M9. Tomar 3 gotas de 5 µ l da solução M9 contendo vermes e contar o número de vermes presentes na última fase larval L4.
    3. Calcule o número de vermes por µ l de tampão de M9.
  2. Larvas de L4 semente 700 em 6 das placas FUDR secas contendo um determinado composto, repita para cada concentração de cada composto e deixe-a secar em condições estéreis.
    1. Incube os vermes a 24 ° C de L4 para aquelas tensões onde a paralisia do verme é induzida apenas elevando a temperatura, tais como o de estirpe AD38. Contagem do dia seguinte a fase larval de L4 como D0 da vida adulta.
  3. Acenda as luzes do palco para o tracker.
    1. Limpar o palco de vidro com 70% de etanol e certifique-se de que não há restos de resíduos visíveis, em seguida, retire a tampa da lente. Limpe a lente da imagem latente com um soprador. Certifique-se de que a câmera está conectada corretamente e instalada e começar a gravar com o software de captura de imagem.
    2. Ajustar as configurações da câmera para gravar 20 frames/s, com 16 mono, gravar a configuração de parâmetros; grave 1.200 frames, salvando no formato MJPEG em uma taxa de compressão de 95%. Use um vazio 9cm de Petri para garantir que o estágio é definido como a altura correta e ajuste-o se necessário.
      Nota: Certifique-se de que as bordas da placa são visíveis na gravação, que permitirá o algoritmo 'manter-morto' funcione corretamente (Figura 1a).
    3. Sob condições estéreis, leve 2 pratos preparados anteriormente no passo 3.2 com as mesmas condições e 1 Mot prato preparado no passo 1.2.4 de triagem. Adicione 3 mL de solução a M9 para a placa de Mot. Uso outro 2 mL de M9 para lavar 1/3 da superfície de 2 pratos preparados no passo 3.2 na chapa de Mot.
    4. Coloque a placa de Mot, contendo cerca de 5 mL de solução de M9 e aproximadamente 600 vermes para o palco do rastreador. Foco da câmera usando um verme e começar a gravação.
    5. Quando a gravação estiver concluída, descarte a placa Mot com os vermes; Marque as placas FUDR como sendo usado uma vez e devolvê-lo para a incubadora.
    6. Repita as etapas 3.3.3 para 3.3.5 para cada condição experimental.
    7. Repita as etapas 3.3.3 para 3.3.6 para cada ponto de tempo na expectativa de vida adulta.
      Nota: Os procedimentos de triagem podem ser efectuados em qualquer momento da vida adulta do worm (ca. 3 semanas). Estes protocolos facilitam o rastreio até 9 pontos de tempo; os autores recomendam que a triagem a cada 2 dias, a partir de dia 1 de idade adulta.

4. otimização de estudos de Dose discreta

  1. Prepare os vermes, repetindo as etapas 3.1.1 a 3.1.3.
    1. Semente ca. 1000 L4 vermes em 5 placas FUDR. Incube as placas a 24 ° C até o D3 da vida adulta, para experimentos envolvendo AD38 vermes.
  2. Utilizando uma pipeta de vidro estéril, transferência os vermes preparados em condições estéreis da placa para um tubo de centrífuga de 15 mL, centrifugar 2.000 x g por 2 min e retirar o sobrenadante.
    1. Suspenda a solução de vermes em 1 mL de tampão de M9. Transfira os vermes para um tubo de microcentrifugadora, centrifugar x g por 2 min e remover o sobrenadante.
  3. Para a transdução da proteína, adicionar 40 µ l de reagente de Transfeccao de entrega e 20 µ l de proteína nativa na concentração desejada (normalmente 40 µM) e incubar a temperatura ambiente por 30 min.
    1. Sob condições estéreis, utilize uma pipeta de vidro estéril para transferir vermes de passo 4.2.1 num tubo microcentrifuga contendo proteína encapsulada para dar um volume total de 1060 µ l. tubos de lugar na horizontal e agitar a 60 rpm em um 24 ° C, agitando a incubadora para 8 h.
  4. Sob condições estéreis, adicionar 4 mL de solução de M9 para um prato de Mot e transferir um tubo microcentrifuga de vermes mais droga na chapa de Mot.
    1. Configurar o rastreador, repetindo os passos de 3.3 a 3.3.2.
    2. Sob condições estéreis, adicionar 4 mL de solução de M9 para um prato de Mot e transferir um tubo microcentrifuga de vermes mais droga na chapa de Mot.
    3. Colocar a placa Mot para o palco do rastreador, foco da câmera em um verme e começar a gravação. Quando completo, rotular a placa Mot e definida para um lado.
    4. Repita as etapas 4.4.1 e 4.4.3 para todas as amostras.
    5. Utilizando uma pipeta de vidro, transferir vermes em condições estéreis da placa Mot para um tubo de centrífuga de 15 mL, centrifugar a 2.000 x g por 2 min. Remover transferência de sobrenadante, o sedimento em uma placa FUDR e deixe-a secar em condições estéreis.
    6. Repita a etapa 4.4.5 para todas as amostras.
  5. Incube os vermes a 24 ° C até D6 da vida adulta.
    Nota: Múltiplos de incubação do anticorpo também é possíveis.
  6. Adicionar 3 mL de tampão de M9 para a placa de Mot e usar 2 mL de solução de M9 para lavar todos os vermes de uma placa FUDR na chapa de Mot.
    1. Configurar o rastreador, repetindo os passos de 3.3 a 3.3.2.
    2. Coloque a placa de Mot para o palco do rastreador, foco da câmera, se necessário e começar a gravação. Quando a gravação estiver concluída, descarte a placa Mot ou recuperá-lo para rastreio suplementar se desejado.
    3. Repita as etapas de 4.6 para 4.6.2 para todas as amostras.

5. analisar os dados de vídeo

  1. Depois de adquirir os vídeos, selecione os parâmetros apropriados no software GUI (Figura 2) para análise de dados.
    1. Carga simples ou múltiplos vídeos através da função de navegação . Selecione uma pasta de destino de saída. Certifique-se que 600 para 1.200 quadros são usados para uma análise de 30 s.
      Nota: Qualquer intervalo de quadros pode ser analisado.
    2. Inserir um pixel ao fator de conversão de mm, que será 0,029 para pratos de Petri um 9cm em resolução máxima de imagem. Selecione o algoritmo de rastreamento 'continua morto'.
      Nota: O fator de conversão dependerá do campo de visão usado. Algoritmo de transformada Z pode ser usado também como uma alternativa.
    3. Preencha os parâmetros na seção localização (Figura 2): Z usar imagens = 100, estofamento de Z = 3, pixéis Std = 54, limiar = 9, abertura = 1, fechando = 2. Ajustar os parâmetros de filtragem para tamanho mínimo = 20, tamanho máximo = 180, tipo Worm = 0,94.
    4. Ajustar os parâmetros de trajetórias de formação : distância máxima mover = 10; Comprimento mínimo = 150, memória = 10.
    5. Defina parâmetros de curvas e velocidade . Usar o 1.8 para o ponto inicial da curva, 0 para mínimo dobrae 150 para quadros para estimar a velocidade.
    6. Sintonize as Estatísticas de verme morto. Use 5.0 para máximo bate por minuto e 1.0 para velocidade máxima.
    7. Escolha a pasta de saída. Defina o número de quadros de saída para 50. Definir o tamanho da fonte para 10.
      Nota: Opcionalmente, selecione uma ou mais regiões de interesse (ROIs).
  2. Teste os parâmetros usando a função de exemplo . As imagens de exemplo de saída e verifique se os vermes estão visíveis em toda as 8 etapas de limiarização (Figura 1).
  3. Use a função de iniciar o trabalho .
  4. Analise os arquivos de texto resultado combinando os resultados individuais do conjunto de dados inteiro. Use a exportação para a função de tsv no GUI.
    Nota: Opcionalmente, métricas individuais dos vermes também podem ser consideradas para estudos populacionais.
    1. Analise os dados com um pacote de software estatístico.

Resultados

A facilidade de operação, análise Multiparamétrico e alto throughput do protocolo NTP-WF ilustrado (figuras 1 e 2) torna possível determinar muito pequenas alterações no comportamento de worm de forma muito precisa. A plataforma de imagem baseia-se na opto-mecânica sob medida, e ele pode ser montado usando uma câmera monocromática de 6 MP combinado com lente de alta resolução de 16 milímetros comprimento focal para 1 ' sensor, iluminado com um 8 ' de 8 ' branco luminoso (ver Tabela de materiais e também referência36 para obter detalhes adicionais). O software associado do WF-NTP é escrito em Python e foi desenvolvido para rodar em plataformas Windows. Ele é executado em um computador personalizado montado com processador de octa-core 3.00 GHz e 64 GB de memória de acesso aleatório (RAM). O software também foi projetado para paralelizar o trabalho e a análise de vídeo baseado em RAM e CPU do computador; ou seja,, uma máquina com uma baixa potência de cálculo resultará em menos vídeos executar em paralelo. A configuração que estamos usando atualmente é otimizada para correr até ca. 16 vídeos em paralelo e pode completar uma análise de 100 vídeos ca. durante a noite. Além disso, o elevado nível de detalhe da personalização fornecida na GUI do WF-NTP permite grande controle da qualidade da análise de imagem. O GUI pode ser usado para fazer upload diretamente de grandes conjuntos de dados em paralelos ou individuais de vídeos; quadros específicos também podem ser selecionados para análise detalhada do sub, juntamente com um fator de conversão de pixel, que pode ser usado para estimar métricas comportamentais. Um dos dois algoritmos rastreamento diferentes (manter morta e transformada Z) pode ser escolhido dependendo ou não o usuário gostaria de considerar animais paralisados na análise. O parâmetro de limiarização pode ser ajustada em conformidade com o vídeo e experimental de qualidade. A abertura e fechamento de parâmetros permitem que o usuário remover o ruído e ainda implementar a funcionalidade de limiarização. O algoritmo de skeletonizing oferece um método alternativo de análise. Os objeto tamanho cortes (filtragem) fornecem um filtro adicional para o ruído de fundo e o parâmetro de tipo worm permite que o usuário considerar apenas os objetos com uma forma elipsoidal, portanto, distinguir de outros objetos que podem ter o mesmo tamanho de pixel de vermes os vermes. Após estas operações de limiarização, todas as regiões rotuladas resultantes podem ser identificadas como vermes individuais e as posições dessas regiões são então armazenadas para cada quadro, para posterior análise e acompanhamento. A excentricidade de cada verme controlada é usada para estimar as métricas de worm, tais como a extensão do sem-fim de dobra (BPM) em função do tempo. Os usuários também são permitidos para selecionar o número de quadros costumava manter um verme na memória do software após as colisões, e o número de pixels que um worm pode se mover entre os quadros também pode ser ajustado para distinguir os animais do ruído. A opção de comprimento mínimo de pista permite que o usuário elimine worms que foram controladas por apenas alguns quadros. Outros parâmetros-chave, tais como curvas e velocidade, permitem que o usuário selecione o grau de flexão necessária para ser contado como uma curva de corpo e o número de quadros considerado necessário para estimar a velocidade dos animais. Parâmetros de corte podem ser mais sintonizados para a inclusão dos animais paralisados. A saída é automaticamente mostrada nos arquivos de resultado. Esses valores são considerados como limites superiores para a avaliação da fração de animais paralisados. O usuário também pode selecionar uma ou mais regiões de interesse. Esse recurso é particularmente útil para analisar as subpopulações dos vermes e a saída é classificada automaticamente nos arquivos de resultados. A opção de saída permite ao usuário selecionar a pasta de saída e o número de rastreamento de quadros que serão produzidos por ele. Vários conjuntos de ferramentas também podem ser usados para análise de dados adicional, como o trama caminho das ferramentas que mostra individual worm faixas e impressões digitais que permite ao usuário criar impressão digital mapas.

Esta metodologia permite que novas abordagens a adoptar, não somente para estudos biológicos de c. elegans , mas também para fins de investigação médica e farmacológica, tais como elevado-throughput screening de modificações genéticas e os tratamentos com drogas. Ilustramos este potencial por descrever a caracterização dos fenótipos de estudos de população grande (N > 1000) de vários modelos de worm de doença neurodegenerativa (frontotemporal demência (FTD)39, doença de Parkinson (PD)7 , A doença de Alzheimer (AD)16,40e esclerose lateral amiotrófica (ela)19 (Figura 3a) e caracterizar os efeitos potenciais moléculas terapêuticas usando modelos de worm de PD18 e AD 15,12 (Figura 3b). Duas pequenas moléculas, squalamine18 e bexaroteno15, foram administrados em concentrações até 25 µM para PD (Figura 3b) e 10 µM a AD38 (Figura 3b) vermes, respectivamente. Os dois compostos mostraram claros efeitos dose-dependente na faixa de concentrações testaram. Temos mostrado que esta alta precisão das medições é conseguido pelo aumento do número de vermes que podem ser analisados em comparação com métodos tradicionais (Figura 3C). Ilustramos a importância do tamanho da amostra (Figura 3C) em triagem molecular, bem como na caracterização de cepas mutantes. O aumento na temperatura de 20 ° C leva a aproximadamente metade dos vermes AD ficar paralisados após 3 dias de idade adulta. Verme populações foram projectadas em condições diferentes, por exemplo,, , quando vermes over, expressando a forma 42-resíduo do peptídeo β-amiloide (Aβ1-42) (AD vermes) foram expostos às variações sutis de temperatura (Figura 3 c, esquerda painel), quando Aβ1-42 foi expressa em todos os neurônios (Figura 3 c, painel central), ou quando AD vermes foram expostos ao bexaroteno (Figura 3 c, painel direito). Vermes também foram analisados a partir de pequenas ROIs aleatoriamente selecionados a partir do campo de visão completo dos vídeos adquiridos com o WF-NTP (barras de < 50, amarelo N) destacando a comparação entre a motilidade destes vermes com a motilidade média da população inteira worm (N < 1.000). Em todos os painéis, a diferença medida em toda população worm parece ser estatisticamente significante p ≤ 0,0001 (*).

O protocolo NTP-WF descrito aqui também permite a gravação simultânea de múltiplos parâmetros (Figura 1b) para apoiar, de forma ideal, tanto a validação interna e o desenvolvimento de uma abrangente digital de uma ampla gama de condições em relação a uma amostra de controle, permitindo uma comparação significativa em vários estudos. Esta abordagem multi paramétrica inclui a análise simultânea de múltiplas características comportamentais, incluindo frequência, velocidade, taxa de paralisia, tamanho, amplitude da curva e curva deslocamento36de dobra. Isto permite que milhares de animais a serem monitorados em detalhes e com uma sensibilidade muito alta e a significância estatística e fornece oportunidades para estudos de grandes populações. Este procedimento de rastreamento também tem a vantagem de permitir estudos de paralisia, a ser realizado em paralelo com outras medidas comportamentais, uma característica fundamental em estudos de triagem molecular.

Os resultados até agora alcançados em AD15,34,35 e descoberta de drogas de18 PD demonstram a importância da aquisição de dados de amplo campo de visão para aumentar significativamente o número de animais que podem ser monitorados em uma única experiência, diminuindo significativamente os erros experimentais e melhorando consideravelmente a validade estatística dos estudos. Com base nestes resultados, prevemos que o protocolo NTP-WF, fizemos prontamente disponíveis para a Comunidade36, estenderemos significativamente o uso de c. elegans.

figure-results-9197
Figura 1: as etapas da análise WF-NTP e exemplo de uma impressão digital. (um) 1. Vídeo original. 2. background image. 3. antecedentes subtraída a imagem. 4-6. passos de limiarização. 7-9. rotulagem única de vermes. (b) múltiplos fenótipos são relatados com uma impressão digital para os vermes do selvagem-tipo e verme modelos do AD e PD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: interface gráfica do usuário (GUI) do WF-NTP. Vídeos específicos e quadros selecionados podem ser selecionados no GUI para análise, e um fator de conversão de pixel podem ser inserido, após o qual a análise é realizada com um dos dois algoritmos dado seguimento. É possível seleccionar o grau de flexão necessária para contar como uma curva de corpo, bem como o número de quadros necessários para estimar a velocidade dos animais. Curvas do corpo e os limites de velocidade podem determinar as estatísticas de worm paralisado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: exemplos de aplicativos ativados pelo método WF-NTP. (uma) aplicação de WF-NTP em estudos de população grande (N > 1.000) das medições de BPM para os modelos de uma gama de doenças neurodegenerativas, incluindo FTD, PD, AD, c. elegans e ALS. (b) aplicação do WF-NTP na descoberta da droga. (c) a importância de estudos de população em sensibilidade à temperatura, eficácia de droga e caracterização da estirpe mutante. Fenótipos de subpopulações N < 50 (barras amarelas) são comparados com os da população inteira worm (N < 1.000). As barras de erro indicam o erro padrão da média (SEM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Por causa da rápida expansão das técnicas no âmbito das Ciências ópticas, agora é possível abordar a exigência de métodos automatizados nos estudos de c. elegans em maneiras substancialmente novas. Como resultado, um número de digital plataformas20,41,42,,43,44,,45,46 de rastreamento foram concebidos e disponibilizados ao longo nos últimos anos a fim de substituir a contagem manual dos parâmetros tais como a velocidade de movimento, dobra a frequência, a taxa de paralisia, bem como formas mais complexas de comportamentos tais como ômega voltas e medições de expectativa de vida. Mais recentes plataformas automatizadas melhoraram grandemente a reprodutibilidade e sensibilidade de c. elegans estudos41 e forneceu dados de alta qualidade em pequenos cortes ou mesmo determinados animais. Decidimos estender a automação da análise do comportamento de worm que permitam também avaliar os fenótipos de coortes de milhares de animais em paralelo. A principal vantagem da abordagem de estudando coortes de verme é que ele permite que para a contabilidade para a alta variabilidade intrínseca do worm comportamento24 e para o fato de que estudos de tratamento de drogas frequentemente conduzem a variações fenotípicas sutis, que são difíceis de detectar com significância estatística suficiente quando usando um pequeno grupo de animais. Alto poder de deteção (POD) é efectivamente necessário para detectar, com confiança, qualquer variação significativa no comportamento e limitar resultados falso-positivos25.

Aqui, descrevemos uma série de protocolos baseados em um método de triagem automatizada recentemente relatado por c. elegans, o nematódeo de amplo campo de visão de rastreamento de plataforma (WF-NTP)36. O protocolo descrito aqui é dividido em 5 partes. As partes 1 e 2 descrevem a preparação das populações de verme grande. Passos críticos são a esterilidade das condições de trabalho e preparação dos reagentes e placas necessárias para executar os experimentos. Constatamos que, devido o maior throughput fornecido pelo presente protocolo, em comparação com outras metodologias36de triagem, ele também requer aumento das quantidades de reagentes; Este fator deve ser considerado com cuidado no projeto experimental. Constatamos também que a etapa de branqueamento é crítica e precisa ser testado com antecedência como um grande número de ovos e larvas saudáveis são necessárias para executar estas experiências. Parte 3 do presente protocolo detalha como entregar drogas no verme sólido de mídia e tela populações. Notamos que esta parte do protocolo é fortemente dependente do número de drogas e concentrações de droga a ser testado pelo usuário em paralelo. A automação completa do processo de triagem e aquisição de dados rápida mudar o passo limitante de observação comportamental para preparação dos reagentes e crescimento e sincronização das populações de verme grande. As principais etapas durante a projecção comportamental são os intervalos de gravação e qualquer verme manipulação etapas (por exemplo, a transferência de vermes das placas NGM para a plataforma de rastreamento). O protocolo descrito aqui é um exemplo projetado para a tela os vermes para até 9 dias durante a vida do adulto; no entanto, este protocolo pode ser facilmente adaptado para a tela de tantos pontos de tempo como o usuário deseja, por exemplo, por 18 dias consecutivos36. Parte 4, em seguida, ilustra a aplicação do protocolo para entregar as moléculas de proteína (por exemplo, anticorpos e moleculares chaperones) em c. eleganse mostra como o protocolo ilustrado em partes 1-3 pode ser facilmente personalizado, dependendo o desejado aplicação. Vamos demonstrar como este procedimento pode ser estendido não só para a entrega da droga, como moléculas, mas também para a administração de molecular chaperones ou anticorpos37. As quatro primeiras etapas (peças) são realizadas em condições estéreis, salvo indicação em contrário. Todos os componentes líquidos devem ser esterilizados antes da utilização e as etapas de incubação devem ser realizadas em 70% de humidade relativa. Na parte 5, descrevemos como usar o pacote de software fornecido em combinação com a fase de acompanhamento. Este software tem sido personalizado projetado para a análise dos dados de WF-NTP relacionados ao comportamento das populações de verme grande. Sugerimos que o usuário segue as diretrizes fornecidas na parte 5 para a análise de dados; no entanto, estes parâmetros dependem as características específicas dos vídeos gravados (i.e., fps, campo de visão, resolução de vídeo, número de quadros adquiridos). A função de exemplo fornecida na GUI foi concebida para facilitar a avaliação dos parâmetros corretos antes da análise.

Estas séries de protocolos que permitam analisar os fenótipos de grandes populações de c. elegans (atualmente até 5.000 vermes individuais em paralelo), efetivamente, reduzir artefactos devido à variabilidade intrínseca do comportamento dos animais , de acordo com estudos preliminares sobre o poder da deteção necessário para a obtenção de significância estatística de estudos de c. elegans25. A plataforma usa um sistema de câmeras de alta resolução, capazes de gravar imagens de um grande número de animais em alta velocidade, enquanto gravava simultaneamente vários grandes coortes. O alto desempenho e alta taxa de transferência do protocolo NTP-WF torna possível determinar muito pequenas alterações no comportamento de worm de forma muito precisa. Portanto, esta metodologia permite que novas abordagens a considerar não só para o estudo da biologia da c. elegans, mas adicionalmente para pesquisas médicas e farmacológicas, tais como o rastreio com throughput alto de modificações genéticas e drogas tratamentos. Este procedimento também tem a vantagem de permitir estudos de paralisia, a ser realizado em paralelo com outras medidas comportamentais, uma característica fundamental em estudos de triagem molecular.

Os resultados até agora alcançados nos programas de descoberta de drogas de AD15,34,35 e PD18 demonstram a importância da aquisição de dados de amplo campo de visão em aumentar substancialmente a números de animais que podem ser monitorados em uma única experiência, diminuindo assim significativamente os erros experimentais e melhorando consideravelmente a validade estatística dos estudos. Enquanto a abordagem atual descrita neste protocolo centrou-se em enfrentar os desafios no campo da descoberta da droga, esperamos que a metodologia seja amplamente adoptada na Comunidade, e que sua aplicação seja alargada ao complexo genético e estudos comportamentais e expandir o número de fenótipos que são detectáveis no momento.

Divulgações

Os autores declaram que não há nenhum conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo centro para doenças enrolamento (CMD). FAA é suportada por um prêmio bolsa de pesquisa sênior de Alzheimer Society, UK (Grant número 317, AS-SF-16-003). As cepas de c. elegans foram obtidas a partir do Caenorhabditis elegans centro genético (CGC).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Consumable reagents
monobasic potassium phosphateSigma AldrichP0662
dibasic sodium phosphateSigma AldrichS3264
sodium chlorideSigma Aldrich13422
magnesium sulphateSigma AldrichM7506
AgarSigma AldrichA1296
Difco casein digestScientific Laboratory Supplies211610
calcium chloride dihydrateSigma AldrichC3881
cholesterolAcros110190250
absolute ethanolVwr20821.33
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98%Alfa AesarL16497.ME
LB medium capsulesMP biomedicals3002-031
13% sodium hypochloriteAcros OrganicsAC219255000
Sodium hydroxideFisher ChemicalS/4880/53
NameCompanyCatalog NumberComments
Strains
E. coli strain OP50Supplied by CGCOp50E coli strain
C. elegans strain wild typeSupplied by CGCN2C. elegans strain
C. elegans strain ADSupplied by CGCGMC101C. elegans strain
C. elegans strain PDSupplied by CGCNL5901C. elegans strain
C. elegans strain ALSSupplied by CGCAM725C. elegans strain
C. elegans strain TauSupplied by CGCBR5485C. elegans strain
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Tactrol 2 AutoclavePriorclave
9 cm sterile Petri dishesFisher Scientific11309283
2 L erlenmeyer flasksScientific Laboratory SuppliesFLA4036
Nalgene 1 L Centrifuge potsFisher Scientific3120-1000
RC5C plus floor mounted centrifugeSorvall9900884
15 mL centrifuge tubesFisher Scientific05-539-12
Heraeus Multifuge X3RThermofisher scientific75004515
Inoculating SpreadersFisher Scientific11821741
M4 multipetteEppendorf4982000012
P1000 pipetteEppendorf Research Plus
P200 pipetteEppendorf Research Plus3123000055
P10 pipetteEppendorf Research Plus3123000020
1,000 μL low retention tipsSarstedt
300 μL low retention tipsSarstedt70.765.105
10 μL low retention tipsSarstedt70.1130.105
pipeteboy 2VWR612-0927
50 mL serological pipetteAppleton WoodsCC117
25 mL serological pipetteAppleton WoodsCC216
10 mL serological pipetteAppleton WoodsCC214
glass pipette 270 mmFisherbrandFB50255Camera for videos recording
pulsinPolyplus Transfection501-04Transduction reagent
Multitron Standard shaking incubatorInfors HTINFO28573
air dusterOffice Depot1511631
NameCompanyCatalog NumberComments
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software
8'' by 8'' BacklightEdmond Optics88-508Tracker component
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensorEdmond Optics86-571Tracker component
6 Mpx cameraEdmond Optics33540Tracker component
FlyCapture SoftwarePointGreySDK v2.12Image capture software
WF-NTP SoftwareCambridge Enterprisev1.0Image analysis software
Office PackageMicrosoftOffice 365Statistical analysis software

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