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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Eine erweiterte Mikroskop, die es ermöglichen schnelle und hochauflösende werden Bildgebung des isolierten Plasmamembran sowohl die umliegenden intrazelluläre Volumen präsentiert. Die Integration von spinning-Disk und Gesamtbetrag interne Reflexion Fluoreszenzmikroskopie in einer Aufspannung ermöglicht live-imaging-Experimente bei hohen Erfassungsraten bis zu 3,5 s pro Bildstapel.

Zusammenfassung

In lebenden Zellen beinhalten Prozesse wie Adhäsion Bildung umfangreiche strukturelle Veränderungen in der Plasmamembran und das Zellinnere. Um diese hoch dynamischen Events sichtbar zu machen, wurden zwei komplementäre lichtmikroskopische Techniken, mit denen schnelle Bildgebung live Proben kombiniert: spinning Disk Mikroskopie (SD) für schnelle und hochauflösende Volumen Aufnahme und Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) für die präzise Lokalisierung und Visualisierung der Plasmamembran. Eine umfassende und vollständige imaging-Protokoll wird für Führung durch Probenvorbereitung, Mikroskop Kalibrierung, Imagebildung und Erwerb, wodurch Multi-Color SD-TIRF live imaging Serie mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung angezeigt. Alle gewünschten Bild Nachbearbeitung Schritte, Multi-dimensionale live imaging Datasets, d.h. Anmeldung und Kombination der einzelnen Kanäle zu generieren sind ein selbst geschriebenes Makro für die open-Source-Software ImageJ zur Verfügung gestellt. Die Darstellung der fluoreszierenden Proteinen während der Initiation und Reifung der Adhäsion-komplexe sowie die Bildung des Aktin-Zytoskeletts Netzwerks, diente als Beweis der Grundsatz dieser neuartige Ansatz. Die Kombination aus hochauflösenden 3D Mikroskopie und TIRF zur Verfügung gestellt, einer detaillierten Beschreibung dieser komplexen Prozesse innerhalb der zellulären Umgebung und gleichzeitig präzise Lokalisierung der membranassoziierten Moleküle erkannt mit hohem Signal-Hintergrund-Verhältnis.

Einleitung

Unsere Tage entwickeln sich rasch lichtmikroskopische Techniken bietet High/Super Resolution Imaging in festen und lebenden Exemplar. Höchstauflösung Techniken wie z. B. stimulierte Emission Depletion (STED), strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM) und Foto-Aktivierung Lokalisierung Mikroskopie (PALM) oder direkte stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm), bzw. sind im Handel erhältlich und ermöglichen die Darstellung der subzellulären Strukturen zeigt Details fast auf molekularer Ebene1,2,3,4,5,6. Allerdings haben diese Ansätze noch Anwendbarkeit für live-imaging-Experimente beschränkt, in denen große Mengen mit mehreren Frames pro Sekunde Erwerb visualisiert werden müssen. Sorten von hochdynamischen Prozessen über die Plasmamembran, z.B. Endo - reguliert / Exozytose, Adhäsion, Migration oder Signalisierung, mit hoher Geschwindigkeit in zellulären Großmengen auftreten. Um diese Lücke zu füllen, war eine integrierte Mikroskopie-Technik vor kurzem vorgeschlagenen genannt Spinning Disk-TIRF (SD-TIRF)7. Im einzelnen ermöglicht TIRF-Mikroskopie speziell isolieren und lokalisieren die Plasmamembran8,9, während SD Mikroskopie eine der sensibelsten und schnellen ist Leben bildgebende Verfahren zur Visualisierung und Verfolgung von subzellularen Organellen im Zytoplasma10,11. Die Kombination der beiden bildgebenden Verfahren in einer einzigen Aufspannung hat bereits in den vergangenen12,13realisiert, jedoch das Mikroskop (Abbildung 1) vorgestellte endlich erfüllt die Kriterien um live imaging SD-TIRF-Experimente durchzuführen die oben genannten Prozesse mit 3 Bildern pro Sekunde. Da dieses Mikroskop im Handel erhältlich ist, ist das Ziel dieser Handschrift zu ausführlich beschreiben und open Source Tools und Protokolle für Bildaufnahme, Registrierung und Visualisierung mit SD-TIRF-Mikroskopie verbunden.

Das Setup basiert auf einem inversen Mikroskop mit zwei Scan-Einheiten über unabhängige Ports verbunden - der linken Anschluss ist verbunden mit der SD-Einheit und den hinteren Port Scanner-Einheit für TIRF und Foto-Aktivierung /-bleichen Experimente. Bis zu 6 Laser (405/445/488/515/561/640 nm) kann zur Anregung verwendet werden. Für die Anregung und Detektion der Fluoreszenzsignal, entweder 100 X / NA1.45 Öl oder 60 X / NA1.49 Öl TIRF Ziel bzw. beschäftigt waren. Das ausgestrahlte Licht durch einen dichroitischen Spiegel (561 nm lang-Pass oder 514 nm lang-Pass) aufgeteilt und durch verschiedene Bandpass-Filter gefiltert (55 nm Breite zentriert auf 525 nm, 54 nm Breite zentriert auf 609 nm für grüne und rote Fluoreszenz, beziehungsweise) vor die beiden EM-CCD-Kamera platziert Epochen. Bitte beachten Sie, dass weitere technische Details über das Setup in Zobiak Et Al. aufgeführt sind 7. in TIRF Konfiguration, bewegt sich die SD-Einheit aus dem Strahlengang innerhalb von ca. 0,5 s, dass die gleichen zwei Kameras für die Erkennung verwendet werden können, so dass schneller Wechsel zwischen den beiden bildgebenden Verfahren im Vergleich zu ca. 1 s, die in der Vergangenheit berichtet wurde13 < /C2 >. Diese Funktion ermöglicht die simultane Erfassung Zweikanal-, 4 Kanäle SD-TIRF imaging bei bisher unerreichte Geschwindigkeit und Genauigkeit durchgeführt werden kann. Darüber hinaus ist Ausrichtung zwischen SD und TIRF Bilder nicht erforderlich. Bildausrichtung zwischen den beiden Kameras muss jedoch vor Beginn des Experiments überprüft und gegebenenfalls korrigiert werden. In das folgende Protokoll wurde eine Registrierung-Korrektur-Routine in einem selbstgeschriebenen ImageJ-Makro umgesetzt. Darüber hinaus wurde das Makro hauptsächlich entwickelt, um eine gleichzeitige Visualisierung von SD und TIRF Datasets trotz ihrer unterschiedlichen Dimensionalität zu ermöglichen. Die Datenerfassungs-Software selbst bieten nicht diese Funktionen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Zellen

  1. Samen Sie zwei Tage vor dem Experiment, 3 * 105 HeLa oder NIH3T3 Zellen in 2 mL voll Wachstumsmedium pro Bohrloch einer 6-Well-Zellkultur-Platte. Stellen Sie sicher, dass Zellen in einer Laminar-Flow-Haube in diesem Protokoll behandelt werden.
  2. Bereiten Sie einen Tag vor dem Experiment, die Transfektion Reagenzien gemäß den Empfehlungen des Herstellers oder eine empirisch ermittelte Protokoll, z.B.:
    1. Verdünnen Sie 1 µg der RFP-Lifeact und 1 µg der YFP-Vinkulin in insgesamt 200 µL Serum Medium reduziert. Vortex Transfection Reagens kurz, hinzu kommen 4 µL 200 µL DNA und Wirbel wieder. Inkubieren Sie die Transfektion Mischung für 15-20 min bei Raumtemperatur.
    2. Fügen Sie die gesamte Transfektion Mischung tropfenweise direkt auf die Zellen. Mischen Sie durch Schütteln der Plattenrandes und legen Sie sie wieder in den Brutkasten.
  3. Am Tag des Experiments bereiten Sie die Probe für live Imaging vor:
    1. Bereiten Sie eine 10 µg/mL Lösung von Fibronektin in PBS, die Glasoberfläche von einer Glasschale unten 35 mm zu beschichten. Verwenden Sie nur qualitativ hochwertige 0,17 mm Glasdeckgläser für eine optimale Leistung der TIRF und vermeiden Sie Kunststoffboden Speisen. Lassen Sie die Lösung auf der Glasoberfläche, für 30 min bei Raumtemperatur, dann entfernen Sie es und lassen Sie die Schale an der Luft trocknen.
    2. Der Fibronektin-beschichteten Glasoberfläche die Lösung für 30-60 s hinzufügen und eine 0,1 µm Multi-fluoreszierenden Perlen Lösung zu einer Dichte von 1,8 x 109 Partikel pro mL destilliertem Wasser verdünnen. Entfernen Sie sofort die Lösung und lassen Sie die Schale an der Luft trocknen.
      Hinweis: Dieser Schritt ist nur erforderlich, wenn die TIRF Flugzeug vor der Aussaat Zellen und/oder ein 2-farbige Referenzbild für die Wulst-basiertes Abbild Registrierung erwerben gefunden werden sollte.
    3. Bereiten Sie eine Lösung von 0,1 M Ascorbinsäure (AA) und verdünnen Sie es um eine Endkonzentration von 0,1 mM im Wachstumsmedium (AA-Mittel). Legen Sie die Lösung in einem 37 ° C-Wasserbad.
      Hinweis: Verwenden Fluoreszenz-optimierte Zellkulturmedium wenn möglich, solche als Phenolred-frei und (Ribo)-Flavin reduziert Medium. AA ist ein Anti-oxidierende Mittel, das phototoxische Wirkung während der live-imaging-14verringern kann. Wir haben es erfolgreich in diesem Assay, d.h. getestet, die mehr Zellen gesund unter den Bedingungen, die gelten als ohne AA Zusatz erschienen. Jedoch wurde der pH-Wert des Mediums von 0,17 pH-Einheiten gesenkt.
    4. Waschen Sie die Zellen mit 2 mL PBS, fügen Sie 250 µL Trypsin-EDTA und warten Sie, bis die Zellen voll sind getrennt (ca. 2-3 min in einem Inkubator 37 ° C). Aufschwemmen der Zellen vorsichtig in 1 mL vorgewärmt AA-Medium mit einer Pipette und 4 mL AA-Medium in einem 15 mL Zelle Kultur Rohr hinzufügen. Legen Sie die Zellsuspension mit leicht geöffnetem Deckel in einem Inkubator auf 37 ° C und 5 % CO2 in der Nähe von dem Mikroskop gesetzt.
    5. Fügen Sie 1 mL vorgewärmt AA-mittlere bis untere Glasschale und stellen es in die Halterung des vorgewärmten Mikroskops (siehe nächster Abschnitt).

2. Live imaging

  1. Starten Sie die Umwelt Kontrolle des Mikroskops eine stabile 37 ° C, 5 % CO2 und feuchter Atmosphäre zu erreichen.
    Hinweis: Hier wurde eine kleine Bühne Top Inkubation Kammer verwendet, dass zulässige stabile Einstellungen innerhalb von ca. 15 min. größere Inkubatoren mehr Zeit benötigen, um stabile Verhältnisse zu erreichen.
  2. Alle Einstellungen der Übernahme am Mikroskop zu beheben, bevor die Zellsuspension angewendet wird:
    1. Legen Sie das Zeitintervall auf 30 s und einer Dauer von 60-90 min. aktivieren die Autofokus-Funktion des Hardware-basierte Auto-Focus für jeden Zeitpunkt (Wert "1").
    2. Passen Sie die Belichtung der Kamera sowie Gewinn und die Laserleistung für jeden Kanal. Hohe Ebenen gewinnen, geringe Belichtungszeit und niedrige Laserleistung sind empfehlenswert, Phototoxizität zu reduzieren.
      Hinweis: Die hier vorgestellten Daten wurde mit 200 ms Exposition erworben, gain Level 500 und 20 % Laserleistung, die Anregung Intensität von 0.5 W/cm ² für 488 entspricht nm und 1 W/cm ² für 561 nm, beziehungsweise.
    3. Festlegen des Z-Stacks für die Spinning-Disk-Kanäle bis 10 µm mit 0,4 µm-Abstand. De-aktivieren Sie Z-Stacks für die TIRF-Kanäle. Satz der unteren-Offset auf "0", d.h. der niedrigsten Ebene werden die Fokuslage des Hardware-Autofokus.
    4. Aktivieren Sie die Multi-Punkt-Funktion "Bühne Positionen".
      Hinweis: Bis zu 3 Positionen können in 30 s Zeit aufgezeichnet werden.
  3. Die fluoreszierenden Perlen mit Epi-fluoreszierende Beleuchtung zu finden, an das Okular oder auf dem Computerbildschirm dann ein TIRF Kanal zu aktivieren und den Beleuchtungswinkel auf einen Wert eingestellt, der TIRF Beleuchtung bezeichnet. Aktivieren Sie den Autofokus durch Drücken des Knopfes auf dem Mikroskop-Panel und stellen Sie den Fokus mit dem Offset-Rad. Eine 2-Farben-Dataset, d.h. TIRF-488 und TIRF-561, für nachfolgende Wulst-basiertes Abbild Registrierung erwerben (siehe Punkt 3.1).
    1. Optional: Um TIRF Beleuchtung sicherzustellen, fügen ein paar Mikroliter der frei schwebenden fluoreszierende multicolor Perlen Suspension (siehe Punkt 1.3.2.). Aktivieren Sie die live-Ansicht eines TIRF-Kanals und erhöhen Sie den Beleuchtungswinkel. Die nicht-Anhänger Perlen verschwinden jenseits der Grenzwinkel, gewährleisten eine korrekte TIRF Beleuchtung8.
  4. Die Zellsuspension wieder durch Umdrehen der geschlossenen Rohr 2 - 3 Mal mischen und 1 mL der Zellen für die bildgebende Gericht gelten.
  5. Doppel-transfizierten Zellen mit niedrigem Niveau Epi-fluoreszierende Beleuchtung schnell zu finden. Zentrieren Sie die Zellen in der live-Kamera-Vorschau mit Hellfeld-Beleuchtung und markieren Sie die Position. Finden Sie eine weitere 1 bis 2 Punkte von Interesse zu und speichern Sie sie in der Liste der Positionen.
    Hinweis: Am Anfang, die Zellen leicht können abnehmen durch Bewegung, daher 4-5 Positionen eingestellt und überprüfen Sie alle vor dem Start der Bildaufnahme. Danach entsorgen Sie 1-2 Positionen.
  6. Starten Sie die Datenerfassung durch Anklicken des Buttons "Sequence".

3. Bild-Nachbearbeitung in ImageJ

  1. Um eine Anmeldung kostenlos Hyperstack in Fidschi15generieren, wurde ein Makro namens "SD-TIRF_helper" geschrieben, die auf 2 bis 4 Kanal SD-TIRF Timelapse Datasets angewendet werden kann. Speichern Sie die Datei "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" in der Fidschi-Inseln Unterordner "Makros" und führen Sie das Makro, indem Sie auf den Menübefehl "Plugins > Makros > laufen...".
    1. Wenn die Farbkanäle Anmeldung Korrektur benötigen, wählen Sie die Option und erstellen Sie eine neue Perle-basierte Anmeldung Referenz (Wahrzeichen Datei) oder verwenden Sie eine vorhandene Datei, die zuvor erstellt wurde.
      Hinweis: Das Turboreg-Plugin-16 wird auf Fluoreszenz Perlen Referenzbilder angewendet werden. Installieren Sie das Plugin in Fidschi-Software nach den allgemeinen Richtlinien für Plugin-Installationen.
    2. Importieren Sie die Daten mit dem Bio-Formate-Importeur und wählen Sie Hyperstack als eine Anzeigeoption aus. Laden Sie das Bild-Dataset zu, wählen Sie die SD-Serie in den ersten Schritt und der TIRF-Serie im zweiten Schritt. Fidschi wird zeigen die Daten sortiert nach Kanal und Bühne Position, d. h. , die normalerweise alle SD-Kanäle und alle TIRF-Kanäle als ein Hyperstack für jede Stufe Stelle auftauchen, die ausgewählt wurde.
      Hinweis: Daten-Import ist möglich aus verschiedenen Dateitypen, z. B.-Typen wie z. B. TIFF-Serie oder Plattform-abhängige Datei * Endekennug. Der Dateityp werden nicht erkannt, nur dann, wenn es nicht durch die Software zur Datenerfassung als unabhängige, Kompression-Less TIFF-Format exportiert wurde.
    3. Wenden Sie die Registrierung-Korrektur auf die jeweiligen Kanäle durch Laden der vorbestimmten Wahrzeichen Datei an
    4. Wählen Sie die Wunschfarbe Look-up-Tabelle (LUT) für jeden Kanal SD und TIRF und verschmelzen sie zu einer einzigen, Multi-dimensionale Hyperstack.
      Hinweis: Bei der Verarbeitung der TIRF Kanäle sind eine Reihe von Z-Ebenen mit Nullwerten Intensität auf der unteren Ebene hinzugefügt, die mit der Anzahl der Z-Flugzeuge in das SD-Dataset entspricht. Dieser Schritt ist wichtig für die Visualisierung von der endgültigen Hyperstack. Diese Methode ist korrekt, da die Tiefe der TIRF Beleuchtung (weniger als 200nm7) ist kleiner als die Z-Schrittweite des Stapels SD (400 nm).

Ergebnisse

Um dem Potenzial des SD-TIRF Imaging, zeigen ein Assay entwickelt wurde zeigen sollte, die räumlich-zeitliche Organisation der Zelle-Matrix-Haftung-komplexe und deren Wechselwirkung mit dem Zytoskelett während zellulare Adhäsion. Daher Anhänger HeLa oder alternativ NIH3T3, die Zellen mit YFP-Vinkulin und RFP-Lifeact für 18-24 h, transfiziert wurden trypsiniert und auf Fibronektin-beschichtete Unterseite Glasschalen ausgesät. Diese Zell-Linien wurden für ihre starke Zellskelett und ...

Diskussion

In diesem Papier wurde die erste erfolgreiche Implementierung von SD und TIRF-Mikroskopie in einer Konfiguration für experimentieren live Cell imaging, d.h. hohe Erfassungsraten wie 2 SD-TIRF Bild Stapel pro Minute bei 3 verschiedenen Bühne vorgestellt. Positionen, entsprechend insgesamt 168 Rahmen (ca. 3 Bilder pro Sekunde), erworben wurden. Die paar SD-TIRF-Mikroskope, die zuvor beschriebenen12,13, vor allem fehlende ausreichend Highspeed imaging, ze...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken sehr die wissenschaftliche Gemeinschaft von des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf unterstützt uns mit Proben zur Auswertung. Nämlich, wir danken Sabine Windhorst für NIH3T3 Zellen, Andrea Mordhorst für YFP-Vinkulin und Maren Rudolph für RFP-Lifeact.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Microscope and accessories
SD-TIRF microscopeVisitron Systems
Ti with perfect focus systemNikonInverted microscope stand
CSU-W1 T2YokogawaSpinning disk unit in dual-camera configuration
iLAS2 Roper ScientificTIRF/FRAP scanner
Evolve PhotometrixEM-CCD cameras
PiezoZ stageLudl Electronic ProductsMotorized Z stage
Bioprecision2 XY stageLudl Electronic ProductsMotorized XY stage
Stage top incubation chamberOkolabBold LineTemperature, CO2 and humidity supply
Cell culture
HeLa cervical cancer cellsDSMZACC-57
NIH3T3 fibroblastsDSMZACC-59
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS)Gibco14190144
Trypsin-EDTA 0.05%Gibco25300054
Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM)Gibco31966-021
OptiMEMGibco31985070Reduced serum medium
Fetal calf serum (FCS)Gibco10500064
Penicillin/Streptomycin (PenStrep)Gibco15140148
Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep)
TurboFectThermoFisher ScientificR0531Transfection reagent
Ascorbic acid (AA)SigmaA544-25G
6-well cell culture plateSarstedt83.392
Glass bottom dishesMatTekP35G-1.5-10-C35mm, 0.17mm glass coverslip
Fibronectin, bovine plasmaThermoFisher Scientific33010018
Neubauer improved chamberVWR631-0696
TetraSpeck beadsThermoFisher ScientificT7279
Plasmids
RFP-LifeactMaren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany
YFP-VinculinAndrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany
Software and plugins
VisiViewVisitron SystemsVersion 3
ImageJVersion 1.52c
Turboreg pluginhttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"this publicationhttps://github.com/bzobiak/ImageJ
VolocityPerkinElmerVersion 6.2.2

Referenzen

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