Visualizzazione di formazione di aderenze in cellule per mezzo di avanzati filatura microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale disco

Riepilogo

Imaging di entrambi, l'isolato della membrana plasmatica e il volume intracellulare circostante, sarà presentato un microscopio avanzato che consentono veloce e ad alta risoluzione. L'integrazione di filatura disco e totale microscopia di fluorescenza di riflessione interna in un'unica configurazione permette esperimenti dal vivo imaging al prezzo di acquisizione alta fino a 3,5 s per serie di immagini.

Abstract

In cellule viventi, processi quali la formazione di aderenze coinvolgono vasti cambiamenti strutturali nella membrana plasmatica e l'interno delle cellule. Per visualizzare questi eventi altamente dinamici, sono stati combinati due tecniche di microscopia chiara complementari che permettono la formazione immagine veloce dei campioni dal vivo: filatura microscopia disco (SD) per la registrazione veloce e ad alta risoluzione volume e riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRF) per localizzazione precisa e la visualizzazione della membrana plasmatica. Verrà mostrato un protocollo di formazione immagine ampio e completo per guidare attraverso la preparazione del campione, taratura del microscopio, formazione dell'immagine e acquisizione, con conseguente serie di formazione immagine multicolore SD-TIRF dal vivo ad alta risoluzione spazio-temporale. Tutti i passaggi di post-elaborazione immagine necessaria per generare dataset multidimensionale in imaging dal vivo, cioè registrazione e combinazione dei singoli canali, sono forniti in una macro auto-scritta per il software open source ImageJ. L'imaging di proteine fluorescenti durante l'inizio e la maturazione dei complessi di adesione, così come la formazione della rete del citoscheletro di actina, è stato utilizzato come una prova di principio per questo nuovo approccio. La combinazione di microscopia 3D ad alta risoluzione e TIRF ha fornito una descrizione dettagliata di questi processi complessi all'interno dell'ambiente cellulare e, allo stesso tempo, precisa localizzazione delle molecole di membrana-collegato rilevato con un alto rapporto di segnale--fondo.

Introduzione

Nostri giorni, tecniche di microscopia chiara fornendo alta/super risoluzione imaging in fissa ed esemplare vivente sono in rapida evoluzione. Tecniche di Super-risoluzione stimolato microscopia di emissione svuotamento (STED), strutturato illuminazione (SIM) e microscopia di localizzazione foto-attivazione (PALM) o microscopia diretta ricostruzione ottica stocastica (tempesta), rispettivamente, sono disponibili in commercio e permettono la formazione immagine di strutture subcellulari mostrano dettagli quasi su scala molecolare^1,2,3,4,5,6. Tuttavia, questi approcci ancora limitata applicabilità per esperimenti di imaging dal vivo in cui grandi volumi devono essere visualizzate con più fotogrammi al secondo velocità di acquisizione. Varietà dei processi altamente dinamici regolamentati tramite la membrana del plasma, ad es. endo- / esocitosi, adesione, migrazione o segnalazione, si verificano con l'alta velocità all'interno di grandi volumi di cellulare. Recentemente, al fine di riempire questa lacuna, una tecnica di microscopia integrato era proposto chiamato filatura disco-TIRF (SD-TIRF)⁷. In dettaglio, la microscopia TIRF consente specificamente isolare e localizzare la membrana plasmatica^8,9, mentre la microscopia SD è uno della più sensibile e veloce live tecniche di imaging per la visualizzazione e il monitoraggio di organelli sottocellulari nel citoplasma^10,11. La combinazione di due tecniche di imaging in un unico setup è stata realizzata già nel passato^12,13, tuttavia, il microscopio presentato qui (Figura 1) infine soddisfa i criteri per eseguire esperimenti di SD-TIRF imaging dal vivo dei suddetti processi a 3 fotogrammi al secondo di velocità. Poiché questo microscopio è commercialmente disponibile, l'obiettivo di questo manoscritto è quello di descrivere in dettaglio e fornire strumenti open source e protocolli per l'acquisizione delle immagini, registrazione e visualizzazione associata con microscopia di SD-TIRF.

Il programma di installazione si basa su un microscopio invertito a scansione due unità tramite porte indipendenti - la porta di sinistra è collegata all'unità SD e porta posteriore per unità scanner per TIRF e foto-attivazione /-candeggio esperimenti. Fino a 6 laser (405/445/488/515/561/640 nm) può essere utilizzato per l'eccitazione. Per il rilevamento del segnale di fluorescenza, sia una 100 x ed eccitazione / NA1.45 olio o x 60 / NA1.49 olio obiettivo TIRF, rispettivamente, sono stati impiegati. La luce emessa è divisa da uno specchio dicroico (561 nm long-pass o 514 nm long-pass) e filtrata dai vari filtri passa-banda (55 nm vasta centrata a 525 nm, 54 nm vasta centrata a 609 nm per fluorescenza verde e rosso, rispettivamente) posizionato davanti alla cam EM-CCD due ere. Siete pregati di notare che ulteriori dettagli tecnici sull'installazione sono elencati in Zobiak et al. ⁷. in configurazione TIRF, l'unità SD viene spostato fuori dal percorso della luce all'interno di circa 0,5 s affinché le stesse due telecamere possono essere utilizzate per il rilevamento, consentendo più veloce di commutazione tra le due modalità di imaging, rispetto ai circa 1 s è stato segnalato in passato^{13 < /C2 >. Questa funzionalità consente acquisizione simultanea dual channel, quindi 4 canali SD-TIRF imaging in precedenza Velocità ineguagliata e precisione possa essere eseguite. Inoltre, l'allineamento tra le immagini SD e TIRF è inutile. Allineamento dell'immagine tra le due fotocamere, tuttavia, deve essere controllato prima di iniziare l'esperimento ed eventualmente corretto. Nel seguente protocollo, una routine di correzione di registrazione è stata implementata in una macro di ImageJ auto-scritta. Inoltre, la macro è stata progettata principalmente per consentire una visualizzazione simultanea dei DataSet TIRF nonostante la loro diversa dimensionalità e SD. Il software di acquisizione in sé non ha fornito queste caratteristiche.}

Protocollo

1. preparazione delle celle

1. Due giorni prima dell'esperimento, seme 3 * 10⁵ HeLa o NIH3T3 cellule in 2 mL di terreno di sviluppo completo per pozzetto di una piastra di coltura cellulare 6 pozzetti. Assicurarsi che le celle vengano gestite in una cappa a flusso laminare in tutto questo protocollo.
2. Un giorno prima dell'esperimento, preparare i reagenti di transfezione secondo le raccomandazioni del produttore o un protocollo empiricamente determinato, ad esempio:
   1. Diluire 1 µ g di RFP-Lifeact e 1 µ g di YFP-Vinculin in un totale di 200 µ l ridotto medio del siero. Vortice il reagente di transfezione brevemente, aggiungere 4 µ l a 200 µ l DNA e vortex nuovamente. Incubare il mix di transfezione per 15-20 minuti a temperatura ambiente.
   2. Aggiungere goccia a goccia il mix di transfezione intero direttamente alle cellule. Mescolare agitando la piastra e rimetterla in incubatrice.
3. Il giorno dell'esperimento, è necessario preparare il campione per l'imaging dal vivo:
   1. Preparare una soluzione di 10 µ g/mL di fibronectina in PBS per rivestire la superficie di vetro di un piatto fondo di vetro 35mm. Utilizzare solo lamelle di vetro 0,17 mm di alta qualità per prestazioni ottimali di TIRF ed evitare piatti inferiore in plastica. Lasciare la soluzione sulla superficie del vetro per 30 min a temperatura ambiente, quindi rimuoverlo e lasciate il piatto asciugare all'aria.
   2. Diluire una soluzione multi-fluorescente perline 0,1 µm ad una densità di 1,8 x 10⁹ particelle / mL in acqua distillata ed aggiungere la soluzione per 30-60 s alla superficie di vetro rivestite di fibronectina. Rimuovere immediatamente la soluzione e lasciare il piatto asciugare all'aria.
      Nota: Questo passaggio è necessario solo se l'aereo TIRF dovrebbe essere trovato prima della semina di cellule e/o di acquisire un'immagine di riferimento 2-colore per la registrazione di immagine basata sul tallone.
   3. Preparare una soluzione di acido ascorbico (AA) 0,1 M e diluirla a una concentrazione finale di 0,1 mM a crescita medio (medio-AA). Posto la soluzione in bagnomaria a 37 ° C.
      Nota: Utilizzare fluorescenza-ottimizzato medium della coltura cellulare, se possibile, tali come phenolred-free e medio di flavin-ridotto (ribo-). AA è un agente anti-ossidante che può ridurre effetti fototossici durante live imaging¹⁴. È stato testato con successo in questo test, cioè più cellule sono sembrato sane sotto le condizioni applicate rispetto senza aggiunta di AA. Tuttavia, il pH del terreno è stato abbassato da 0,17 unità di pH.
   4. Lavare le cellule con 2 mL di PBS, aggiungere 250 µ l tripsina-EDTA e attendere fino a quando le cellule sono completamente indipendente (2-3 min in un incubatore a 37 ° C). Risospendere le cellule attentamente in 1 mL pre-riscaldati AA-medio con una pipetta e aggiungerlo a AA-medio da 4 mL in una provetta di cultura cellulare da 15 mL. Posizionare la sospensione cellulare con il coperchio leggermente aperto in un'incubatrice impostata a 37 ° C e 5% di CO₂ in prossimità del microscopio.
   5. Aggiungere 1 mL pre-riscaldati AA-medio per il piatto di fondo di vetro e inserirlo nel supporto del microscopio pre-riscaldato (Vedi paragrafo successivo).

2. live imaging

1. Avviare il controllo ambientale del microscopio per ottenere una stabile 37 ° C, 5% CO₂ e un'atmosfera umida.
   Nota: Qui, un piccolo palco incubazione superiore è stato utilizzato botola che impostazioni consentite stabile all'interno di circa 15 min più grandi incubatori bisogno di più tempo per raggiungere condizioni stabili.
2. Difficoltà tutte le impostazioni di acquisizione al microscopio prima la sospensione cellulare viene applicata:
   1. Impostare l'intervallo di tempo di 30 s e la durata di 60-90 min. attivare la funzione di messa a fuoco automatica di auto-focus basata su hardware per ogni punto di tempo (valore "1").
   2. Regolare l'esposizione della fotocamera e guadagno, nonché la potenza del laser per ogni canale. Alti livelli di guadagno, tempo di esposizione basso e laser a bassa potenza sono raccomandate per ridurre la foto-tossicità.
      Nota: I dati qui presentati è stati acquisiti con l'esposizione di 200 ms, aumento di potenza del laser di livello 500 e 20% che equivale a intensità di eccitazione di 0,5 W/cm ² per 488 nm e 1 W/cm ² per 561 nm, rispettivamente.
   3. Impostare lo z-stack per i canali del disco rotante a 10 µm con 0,4 µm spaziatura. Disattivare la z-stack per i canali TIRF. Impostare l'offset inferiore a "0", cioè il piano più basso sarà la posizione di messa a fuoco di messa a fuoco automatica dell'hardware.
   4. Attivare la funzione di multi-punto "posizioni di fase".
      Nota: Fino a 3 posizioni possono essere registrate in un intervallo di tempo s 30.
3. Trovare le perline fluorescenti con epi-fluorescente illuminazione all'oculare o sullo schermo del computer, quindi attivare un canale TIRF e impostare l'angolo di illuminazione su un valore che indica l'illuminazione TIRF. Attivare la messa a fuoco automatica premendo il pulsante sul pannello di microscopio e regolare la messa a fuoco con le ruote. Acquisire un dataset di 2 colori, cioè TIRF-488 e TIRF-561, per la registrazione successiva immagine basata su tallone (Vedi punto 3.1).
   1. Facoltativo: Per garantire illuminazione TIRF, aggiungere pochi microlitri della sospensione fluorescente Perle multicolor liberamente fluttuante (vedere punto 1.3.2.). Attivare il live view di un canale TIRF e aumentare l'angolo di illuminazione. Le perline non aderente scomparirà oltre l'angolo critico, garantendo una corretta illuminazione di TIRF⁸.
4. Mescolare la sospensione cellulare ancora capovolgendo la provetta chiusa 2 - 3 volte e applicare 1 mL delle cellule al piatto imaging.
5. Trovare rapidamente doppio-transfettati con basso livello epi-fluorescente illuminazione. Centro le cellule nell'anteprima live della telecamera utilizzando illuminazione in campo chiaro e segnare la posizione. Trovare un altro 1-2 punti di interesse e salvarli all'elenco delle posizioni.
   Nota: All'inizio, le cellule facilmente possono staccare a causa di movimento scenico, quindi impostare 4-5 posizioni e ricontrollare tutto prima di iniziare acquisizione immagine. In seguito, scartare 1-2 posizioni.
6. Avvia acquisizione dati cliccando sul pulsante "Sequenza".

3. post-elaborazione in ImageJ

1. Al fine di generare un hyperstack senza registrazione in FIJI¹⁵, una macro denominata "SD-TIRF_helper" è stato scritto che può essere applicato ai set di dati di 2-4 canali SD-TIRF timelapse. Salvare il file "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" in il FIJI sotto-cartella "macro" ed eseguire la macro facendo clic sul comando di menu "Plugins > macro > Esegui...".
   1. Se i canali di colore bisogno di correzione di registrazione, selezionare l'opzione e creare un nuovo riferimento di registrazione basato su tallone (file di punto di riferimento) o utilizzare un file esistente che è stato creato prima.
      Nota: Il turboreg plugin¹⁶ si applicherà a fluorescenza perline immagini di riferimento. Installare il plugin nel software di FIJI secondo linee guida generali per le installazioni di plugin.
   2. Importare i dati con l'importatore di bio-formati e scegliere hyperstack come un'opzione di visualizzazione. Caricare il set di dati di immagine, selezionare la serie di SD nel primo passo e la serie TIRF nel secondo passaggio. FIJI visualizzerà i dati ordinati per posizione canale e fase, cioè normalmente tutti i canali SD e tutti i canali di TIRF presentarsi come un hyperstack per ogni posizione di fase che è stato selezionato.
      Nota: Importazione di dati è possibile da vari tipi di file, ad esempio i file dipendenti dalla piattaforma o TIFF-serie tipi come *. ND. Il tipo di file non può essere riconosciuto solo se non è stato esportato dal software di acquisizione come indipendente, senza compressione formato TIFF.
   3. Applicare la correzione di registrazione ai rispettivi canali caricando il file pre-determinati punti di riferimento.
   4. Selezionare la tabella di look-up di colore desiderato (LUT) per ogni canale SD - e TIRF e unirli in un hyperstack singolo, multi-dimensionale.
      Nota: Durante l'elaborazione dei canali TIRF, un numero di aerei-z con zero valori di intensità vengono aggiunti in cima il piano di fondo che corrisponde con il numero di aerei-z nel dataset SD. Questo passaggio è importante per la visualizzazione della hyperstack finale. Questa metodologia è corretta, poiché la profondità dell'illuminazione TIRF (meno di 200nm⁷) è minore della dimensione z-passo dello stack SD (400 nm).

Risultati

Al fine di mostrare il potenziale di formazione immagine SD-TIRF, che un'analisi è stata sviluppata che dovrebbe rivelare l'organizzazione spazio-temporale dei complessi di adesione cellula-matrice e loro interazione con il citoscheletro durante l'adesione cellulare. Di conseguenza, aderente HeLa o, in alternativa, NIH3T3 cellule transfected con YFP-vinculina e RFP-Lifeact per 18-24 h, tripsinizzate e seminate su piatti di fondo di vetro rivestite di fibronectina. Queste linee cellulari ...

Discussione

In questa carta è stata presentata la prima implementazione di successo di SD e TIRF microscopia in una configurazione adatta per l'esecuzione di esperimenti imaging di cellule vive, cioè i tassi di acquisizione alta quali 2 serie di SD-TIRF immagini al minuto a 3 diversi stadi posizioni, corrispondenti a un totale di 168 fotogrammi (circa 3 fotogrammi al secondo), sono state acquisite. I microscopi di SD-TIRF pochi che erano precedentemente descritto^12,13

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope and accessories
SD-TIRF microscope	Visitron Systems
Ti with perfect focus system	Nikon		Inverted microscope stand
CSU-W1 T2	Yokogawa		Spinning disk unit in dual-camera configuration
iLAS2	Roper Scientific		TIRF/FRAP scanner
Evolve	Photometrix		EM-CCD cameras
PiezoZ stage	Ludl Electronic Products		Motorized Z stage
Bioprecision2 XY stage	Ludl Electronic Products		Motorized XY stage
Stage top incubation chamber	Okolab	Bold Line	Temperature, CO2 and humidity supply
Cell culture
HeLa cervical cancer cells	DSMZ	ACC-57
NIH3T3 fibroblasts	DSMZ	ACC-59
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	14190144
Trypsin-EDTA 0.05%	Gibco	25300054
Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM)	Gibco	31966-021
OptiMEM	Gibco	31985070	Reduced serum medium
Fetal calf serum (FCS)	Gibco	10500064
Penicillin/Streptomycin (PenStrep)	Gibco	15140148
Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep)
TurboFect	ThermoFisher Scientific	R0531	Transfection reagent
Ascorbic acid (AA)	Sigma	A544-25G
6-well cell culture plate	Sarstedt	83.392
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-10-C	35mm, 0.17mm glass coverslip
Fibronectin, bovine plasma	ThermoFisher Scientific	33010018
Neubauer improved chamber	VWR	631-0696
TetraSpeck beads	ThermoFisher Scientific	T7279
Plasmids
RFP-Lifeact			Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany
YFP-Vinculin			Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany
Software and plugins
VisiView	Visitron Systems		Version 3
ImageJ			Version 1.52c
Turboreg plugin			http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"	this publication		https://github.com/bzobiak/ImageJ
Volocity	PerkinElmer		Version 6.2.2