회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

요약

신속 하 고 높은 해상도 허용 하는 고급 현미경, 고립 된 플라즈마 멤브레인와 주변 세포내 볼륨의 이미지를 제시 한다. 회전 디스크 및 총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 한 설정의 통합 3.5까지 높은 수집 속도에서 라이브 이미징 실험을 허용 이미지 스택 당 s.

초록

살아있는 세포에 접착 형성 등 프로세스 원형질 막과 세포 내부에 광범위 한 변화를 포함 한다. 이러한 높은 동적 이벤트를 시각화 하기 위해 라이브 샘플의 빠른 이미지를 허용 하는 두 가지 보완 가벼운 현미경 검사 법 기술을 결합 했다: 회전 하는 디스크 현미경 (SD) 및 고해상도 볼륨 녹음 및 총 내부 반사 형광 (TIRF) 정확한 현지화 및 원형질 막의 시각화에 대 한 현미경 검사 법 포괄적이 고 완전 한 이미징 프로토콜 샘플 준비, 현미경 교정, 이미지 형성 및 취득 안내, 다 색 SD TIRF 라이브 이미징 시리즈 높은 spatio 시간적 해상도 결과 대 한 표시 됩니다. 모든 필요한 이미지 후 처리 단계 다차원 라이브 이미징 데이터 집합, 즉 등록 및 개별 채널의 조합 생성 ImageJ의 오픈 소스 소프트웨어에 대 한 자체 서 면된 매크로에 제공 됩니다. 개시 동안 형광 단백질의 이미징 및 접착 단지의 성숙 뿐만 아니라 말라 cytoskeletal 네트워크의 형성이 새로운 접근에 대 한 원리의 증거로 사용 되었다. 셀룰러 환경에서 하 고, 동시에, 높은 감지 막 관련 된 분자의 정확한 지 방화에 이러한 복잡 한 프로세스에 대 한 자세한 설명을 제공 하는 높은 해상도 3D 현미경 및 TIRF의 조합 신호-배경 비율입니다.

서문

우리의 일, 가벼운 현미경 검사 법 기술 고정에 높은/슈퍼 해상도 이미징 및 살아있는 견본을 제공 하는 급속 하 게 개발 하고있다. 와 같은 슈퍼 해상도 기법 자극 방출 소모 (호텔 위치), 구조화 조명 현미경 (SIM) 및 사진 활성화 지역화 현미경 (팜) 또는 직접 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍), 각각, 있다 상업적으로 사용할 수 있는 활성화의 subcellular 구조는 분자 규모^1,2,3,4,,56에 거의 정보를 보여주는 영상. 그러나,이 접근 아직도 있는 대용량 두 번째 수집 속도 여러 프레임 구상 될 필요가 라이브 이미징 실험에 대 한 적용을 제한 했다. 원형질 막, 예를 들어 엔도-를 통해 규제 하는 매우 동적 프로세스의 다양성 / exocytosis, 접착, 마이그레이션 또는 신호, 고속 대용량 세포 내에서 발생. 최근,이 격차를 채우기 위해 통합된 현미경 검사 법 기술이 했다 제안된 라는 회전 디스크-TIRF (SD-TIRF)⁷. 자세하게, TIRF 현미경 특별히 분리와 원형질 막^8,9지역화, SD 현미경 검사 법은 가장 중요 한 중 하나 빠른 라이브 이미징 기술을 시각화 및 추적에 대 한 허용 세포질^10,11subcellular 세포. 그러나 단일 설치에 두 이미징 기술 조합 지난^12,13에서 이미 실현 되어,, (그림 1)을 여기에 제시 된 현미경은 마침내 라이브 이미징 SD TIRF 실험을 수행 하 기준을 충족합니다 두 번째 속도 초당 3 프레임에서 상기 프로세스. 이 현미경 상업적으로 사용할 수 있기 때문에,이 원고의 목표 세부 사항에서 설명 하는 이미지 수집, 등록, 및 시각화 SD TIRF 현미경과 관련 된 오픈 소스 도구와 프로토콜을 제공입니다.

설치는 독립 포트를 통해 두 검색 단위에 연결 된 거꾸로 한 현미경 기반-왼쪽된 포트 TIRF와 사진-정품 인증/표백 SD 장치 및 스캐너 장치를 후면 포트에 연결 되어 실험. 최대 6 레이저 (405/445/488/515/561/640 nm) 여기에 사용할 수 있습니다. 여기 및 형광 신호, 어느 100 x의 탐지 / NA1.45 기름이 나 60 x / NA1.49 오일 TIRF 목표, 각각, 고용 되어 있다. 내보낸된 빛 dichroic 거울 (561 nm 긴 통과 또는 514 nm 긴 패스)에 의해 분할과 다양 한 대역 통과 필터에 의해 필터링 (55 nm 넓은 중심으로 525 nm, 54 nm 넓은 가운데 609에 녹색과 적색 형광에 대 한 nm 각각) 두 EM-CCD 카메라 앞 시대입니다. Zobiak 외 에 설치에 대 한 더 많은 기술적인 세부 사항 나열 된 note 하시기 바랍니다 ⁷. TIRF 구성에서 SD 단위 0.5 경 내에서 가벼운 경로에서 이동 s 검색 동일한 두 카메라를 사용할 수 있도록 1 년경에 비해 두 이미징 형식 사이의 빠른 전환 수 있도록 과거에 보고 된 s^{13 < /c2 >. 이 기능을 통해 듀얼-채널 동시 수집, 따라서 4 채널 SD TIRF 이미징 이전에 최고 속도 및 정확성을 수행할 수 있습니다. 또한, SD 및 TIRF 이미지 사이의 정렬 필요 하지 않습니다. 하지만 두 카메라 사이의 이미지 정렬, 실험을 시작 하기 전에 확인 하 고 필요한 경우 수정 있다. 다음 프로토콜에서 등록 수정 루틴 자체 서 면된 ImageJ 매크로에 구현 되었습니다. 또한, 매크로 주로 SD-및 그들의 다른 차원에도 불구 하 고 데이터 집합 TIRF의 동시 시각화 수 있도록 설계 되었습니다. 수집 소프트웨어 자체는 이러한 기능을 제공 하지 않았다.}

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프로토콜

1입니다. 셀의 준비

1. 실험에 앞서 2 일 씨 2 ml 당 6-잘 세포 배양 접시의 가득 차 있는 성장 매체의 3 * 10⁵ 헬러 또는 NIH3T3 세포. 셀이이 프로토콜을 통해 층 류 두건에 처리 됩니다 확인 하십시오.
2. 실험 전에 언젠가 경험적으로 결정된 프로토콜 예:또는 제조업체의 권장 사항을 transfection 시 약 준비:
   1. RFP Lifeact의 1 µ g을 희석 하 고 1 µ g YFP Vinculin의 200 µ L의 총에서 감소 혈 청 매체. 소용돌이 transfection 시 간단히, 추가 4 µ L 200 µ L DNA와 소용돌이를 다시 합니다. 실 온에서 15-20 분 transfection 믹스를 품 어.
   2. 셀에 직접 dropwise 전체 transfection 믹스를 추가 합니다. 접시를 흔들어 혼합 하 고 다시는 인큐베이터에 배치.
3. 실험 당일, 라이브 영상에 대 한 샘플을 준비:
   1. Fibronectin 코트 35 m m 유리 하단 접시의 유리 표면에 PBS에의 10 µ g/mL 솔루션을 준비 합니다. TIRF 성능 최적화를 위해 고품질 0.17 m m 유리 coverslips만을 사용 하 고 플라스틱 하단 요리를 피하십시오. 실 온에서 30 분은 다음 그것을 제거 하 고 하자 접시 건조 솔루션 유리 표면에 둡니다.
   2. 증류수에 mL 당 10⁹ 입자 x 1.8 밀도 0.1 µ m 다중 형광 구슬 솔루션을 희석 하 고 fibronectin 코팅 유리 표면에 30-60 s에 대 한 솔루션을 추가 합니다. 즉시 솔루션을 제거 하 고 건조 하는 게 요리.
      참고:이 단계는 세포를 뿌리기 전에 또는 비드 기반 이미지 등록 2 색 참조 이미지를 얻으려고 TIRF 비행기를 찾을 수 있어야 하는 경우에 필요.
   3. 0.1 m M ascorbic 산 (AA) 솔루션을 준비 하 고 성장 매체 (금주 모임-매체)에 0.1 m m의 최종 농도에 희석. 37 ° C 물 욕조에 솔루션 장소.
      참고: 사용 하 여 형광 최적화 된 세포 배양 가능 하면 같은 phenolred-무료 (ribo-) 플 라빈 감소 매체. AA는 안티 산화 에이전트 라이브 이미징¹⁴동안 phototoxic 효과 줄일 수 있습니다. 우리는이 분석 결과, 즉 더 많은 세포 보다 AA 추가 없이 적용 하는 조건 하에서 건강 한 등장에 그것을 성공적으로 테스트 했습니다. 그러나, 매체의 pH 0.17 pH 단위에 의해 낮아졌다.
   4. 2 mL PBS로 세포 세척, 추가 250 µ L 트립 신-EDTA와 대기 셀 때까지 완전히 분리 (37 ° C 배양 기에서 2-3 분). Resuspend 셀 1 mL에 신중 하 게 미리는 피 펫과 AA-매체를 예 열 하 고 15 mL 셀 문화 관에서 4 mL AA 매체에 추가. 현미경 주변 37 ° C, 5% CO₂ 로 설정 하는 인큐베이터에 약간 열린된 뚜껑으로 세포 현 탁 액을 넣습니다.
   5. 1 mL 중 유리 하단 접시에 AA-매체를 예 열 하 고 미리가 열된 현미경의 소유자에 추가 (다음 단락 참조).

2. 라이브 영상

1. 안정적인 37 ° C, 5% CO₂ 와 습 한 분위기를 달성 하기 위해 현미경의 환경 제어를 시작 합니다.
   참고: 여기, 작은 무대 최고의 보육 실 사용 되었습니다 약 15 분 더 큰 부 화기 내의 허용된 안정적인 설정을 안정 조건 달성 하기 위해 더 많은 시간이 필요 합니다.
2. 셀 서 스 펜 션 적용 되기 전에 모든 수집 설정을 현미경에서 수정:
   1. 30 시간 간격 설정 s 및 60-90 분에 기간 하드웨어 기반 자동-초점의 모든 시간 포인트 (값 "1")에 대 한 자동 초점 기능을 활성화.
   2. 카메라 노출 및 이득, 뿐만 아니라 모든 채널에 대 한 레이저 파워를 조정 합니다. 수준 높은 이득, 낮은 노출 시간 및 낮은 레이저 힘은 사진 독성을 줄이기 위해 추천.
      참고: 여기에 제시 된 데이터는 200 ms 노출 인수 되었다, 레벨 500 20% 레이저 전력 0.5 W/² 488 대의 여기 농도 같게 하 이득 및 561 대 1 W/² nm, 각각.
   3. 0.4 µ m 간격을 가진 10 µ m z-스택 회전 디스크 채널에 대 한 설정 합니다. -Z-스택 TIRF 채널에 대 한 활성화 합니다. "0", 즉 낮은 비행기로 맨 아래 오프셋 설정의 하드웨어 자동 초점 초점 위치 될 것입니다.
   4. 멀티 포인트 기능 "무대 위치"를 활성화 합니다.
      참고: 3 순위까지 기록할 수 있습니다 30 s 시간 간격.
3. 눈에서 또는 컴퓨터 화면에 피 형광 조명 형광 구슬 찾기 다음 하나의 TIRF 채널을 활성화 하 고 TIRF 조명을 나타내는 값으로 조명 각도 설정. 현미경 패널에 버튼을 누르면 자동 초점을 활성화 하 고 오프셋 휠 초점을 조정 합니다. 2 색 데이터 집합, 즉 TIRF-488 및 취득 TIRF-561, 후속 구슬 기반 이미지 등록 (참조 3.1 포인트).
   1. 선택 사항: TIRF 조명, 추가 자유롭게 떠 있는 형광 색 구슬 서 스 펜 션의 몇 가지 microliters (참조 포인트 1.3.2.). TIRF 채널의 라이브 뷰를 활성화 하 고 조명 각도 증가. 비 점착 구슬 올바른 TIRF 조명⁸를 보장 하는 중요 한 각도 넘어 사라질 것 이다.
4. 다시 반전 닫힌된 튜브, 2-3 시간 여 세포 현 탁 액을 혼합 하 고 이미징 접시에 셀의 1 mL를 적용.
5. 신속 하 게 낮은 수준의 피 형광 조명 더블 페 셀을 찾을. 밝은 분야 조명을 사용 하 여 라이브 카메라 미리 보기에 있는 셀을 중심 하 고 위치를 표시 합니다. 관심의 또 다른 1 2 포인트를 찾아서 위치 목록에 저장.
   참고: 처음부터, 셀 쉽게 수 분리 단계 운동으로 인해, 따라서 4-5 위치를 설정 하 고 모든 이미지 수집을 시작 하기 전에 다시 확인. 그 후, 1-2 위치를 삭제 합니다.
6. "순서" 단추를 클릭 하 여 데이터 수집을 시작 합니다.

3. 이미지 후 처리 ImageJ에

1. 피지¹⁵등록 무료 hyperstack를 생성 하려면 "SD-TIRF_helper" 라는 매크로 2-4 채널 SD TIRF timelapse 데이터 집합에 적용할 수 있는 작성 되었습니다. 하위 폴더 "매크로"는 피지에서 "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" 파일을 저장 하 고 메뉴 명령을 클릭 하 여 매크로 실행 "플러그인 > 매크로 > 실행...".
   1. 색상 채널 등록 수정 필요, 옵션을 선택 하 고 새로운 비드 기반 등록 기준 (랜드마크 파일) 만들거나 하기 전에 만든 기존 파일을 사용 하 여.
      참고: turboreg 플러그인¹⁶ 형광 구슬 참조 이미지에 적용 됩니다. 플러그인 설치에 대 한 일반적인 지침에 따르면 피지 소프트웨어에 플러그인을 설치 합니다.
   2. 바이오-형식 가져오기 도구를 사용 하 여 데이터를 가져올 하 고 보기 옵션으로 hyperstack를 선택 합니다. 이미지 데이터 집합 로드, 첫 번째 단계와 두 번째 단계에서 TIRF 시리즈에서 SD 시리즈를 선택 합니다. 피지는 채널 및 무대 위치, 즉, 일반적으로 모든 SD 채널 및 모든 TIRF-채널 선정 되었습니다 모든 단계 위치에 대 한 hyperstack로 표시 하 여 정렬 하는 데이터를 표시 합니다.
      참고: 데이터 가져오기는 다양 한 파일 형식에서 가능한 예를 들어 TIFF-시리즈 또는 플랫폼 종속 파일과 같은 형식이 *.nd. 파일 형식은 하지 수집 소프트웨어 독립, 압축 없는 TIFF 형식으로 내보낼 경우에 인정 될 수 없습니다.
   3. 미리 정해진된 랜드마크 파일을 로드 하 여 해당 채널을 등록 수정을 적용 됩니다.
   4. SD-그리고 TIRF 모든 채널에 대 한 원하는 색상 룩 업 테이블 (LUT)을 선택 하 고 단일, 다차원 hyperstack에 그들을 병합.
      참고: TIRF 채널의 처리, 중 수 0 강도 값과 z-비행기 z-비행기 SD 데이터 집합의 수와 일치 하는 플레인 위에 추가 됩니다. 이 단계는 최종 hyperstack의 시각화에 대 한 중요 한. 이 방법론은 TIRF 조명의 깊이부터 올바른, (200nm⁷미만) SD 스택 z 단계 크기 보다 작습니다 (400 nm).

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결과

분석 결과 개발 되었다 SD TIRF 이미징의 잠재력을 보여 spatio 시간적 조직 세포 접착 동안 골격와의 상호 작용 및 세포-매트릭스 접착 단지 계시 해야 한다. 따라서, 점착 헬러 또는, 양자 택일로, NIH3T3 세포 YFP Vinculin와 RFP Lifeact 18-24 h에 대 한 페 했다 trypsinized 그리고 fibronectin 코팅 유리 하단 요리에 시드. 이러한 셀 라인 선정 됐다 그들의 발음된 골격 및 높은 견고성에 대 한...

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토론

이 문서에서 라이브 셀 이미징 실험, 즉 높은 수집 속도 3 다른 단계에 분당 2 SD TIRF 이미지 스택 등을 수행 하기 위한 적절 한 구성에서 SD 및 TIRF 현미경의 첫번째 성공적인 구현을 제시 했다 위치, 해당 총 168 프레임 (약 3 프레임 / 초), 하 인수 했다. 했다 몇 SD TIRF 현미경^12,13, 주로는 3D에서 세포 프로세스에 따라 충분히 높은 이미징 속도의 부족을...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope and accessories
SD-TIRF microscope	Visitron Systems
Ti with perfect focus system	Nikon		Inverted microscope stand
CSU-W1 T2	Yokogawa		Spinning disk unit in dual-camera configuration
iLAS2	Roper Scientific		TIRF/FRAP scanner
Evolve	Photometrix		EM-CCD cameras
PiezoZ stage	Ludl Electronic Products		Motorized Z stage
Bioprecision2 XY stage	Ludl Electronic Products		Motorized XY stage
Stage top incubation chamber	Okolab	Bold Line	Temperature, CO2 and humidity supply
Cell culture
HeLa cervical cancer cells	DSMZ	ACC-57
NIH3T3 fibroblasts	DSMZ	ACC-59
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	14190144
Trypsin-EDTA 0.05%	Gibco	25300054
Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM)	Gibco	31966-021
OptiMEM	Gibco	31985070	Reduced serum medium
Fetal calf serum (FCS)	Gibco	10500064
Penicillin/Streptomycin (PenStrep)	Gibco	15140148
Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep)
TurboFect	ThermoFisher Scientific	R0531	Transfection reagent
Ascorbic acid (AA)	Sigma	A544-25G
6-well cell culture plate	Sarstedt	83.392
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-10-C	35mm, 0.17mm glass coverslip
Fibronectin, bovine plasma	ThermoFisher Scientific	33010018
Neubauer improved chamber	VWR	631-0696
TetraSpeck beads	ThermoFisher Scientific	T7279
Plasmids
RFP-Lifeact			Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany
YFP-Vinculin			Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany
Software and plugins
VisiView	Visitron Systems		Version 3
ImageJ			Version 1.52c
Turboreg plugin			http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"	this publication		https://github.com/bzobiak/ImageJ
Volocity	PerkinElmer		Version 6.2.2