Visualiser la Formation d’adhérences dans les cellules par le biais de pointe tourne disque-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Résumé

Un microscope perfectionné permettant de rapides et de haute résolution d’imagerie de la membrane plasmique isolée et le volume intracellulaire environnant, est présenté. L’intégration de la filature de microscopie de fluorescence de réflexion interne disque et total dans un seul montage permet de vivre des expériences d’imagerie à des vitesses d’acquisition élevée jusqu'à 3,5 s par la pile de l’image.

Résumé

Dans les cellules vivantes, les processus tels que la formation d’adhérences impliquent des changements structurels importants dans la membrane plasmique et l’intérieur de la cellule. Afin de visualiser ces événements très dynamiques, on a combiné les deux techniques de microscopie optique complémentaire permettant l’imagerie rapide des échantillons vivants : filature de la microscopie (SD) de disque pour l’enregistrement de volume rapide et haute résolution et de la réflexion totale interne microscopie de fluorescence (FRBR) pour la localisation précise et visualisation de la membrane plasmique. Un protocole d’imagerie complète et s’affichera pour les guider dans la préparation de l’échantillon, l’étalonnage de microscope, formation d’images et acquisition, résultant en une série d’imagerie live avec haute résolution spatio-temporelle du SD-FRBR multicolore. Toutes les étapes de post-traitement image nécessaire pour générer multidimensionnelle datasets imagerie direct, c'est-à-dire l’enregistrement et la combinaison des canaux individuels, sont fournis dans une macro autonome écrite pour le logiciel open source ImageJ. L’imagerie des protéines fluorescentes au cours de l’initiation et la maturation des complexes de l’adhérence, ainsi que la formation du réseau d’actine du cytosquelette, a été utilisé comme une preuve de principe pour cette approche originale. La combinaison de la microscopie 3D de haute résolution et de la FRBR a fourni une description détaillée de ces processus complexes dans l’environnement cellulaire et, en même temps, une localisation précise des molécules associées aux membranes détecté avec une haute rapport de signal-à-fond.

Introduction

Nos jours, les techniques de microscopie optique fournissant l’imagerie haute/super résolution en fixe et spécimen vivant sont développent rapidement. Techniques de super-résolution telles que stimulent d’émission microscopie d’illumination épuisement (STED), structuré (SIM) et la microscopie de photoactivation localisation (PALM) ou microscopie directes de reconstruction stochastique optique (STORM), respectivement, sont disponible dans le commerce et permettent l’imagerie des structures subcellulaires, montrant des détails presque à l’échelle moléculaire^1,2,3,4,5,6. Cependant, ces approches ont toujours limité applicabilité pour des expériences d’imagerie live dont grands volumes doivent être visualisés avec plusieurs frames par seconde vitesse d’acquisition. Variétés des processus hautement dynamiques régies par l’intermédiaire de la membrane plasmique, par exemple , endo- / exocytose, d’adhérence, de migration ou de signalisation, se déroulent à haute vitesse dans les grands volumes cellulaires. Récemment, afin de combler cette lacune, une technique de microscopie intégrée a été proposée filature appelé disque-FRBR (SD-FRBR)⁷. En détail, microscope TIRF permet spécifiquement isoler et localiser la membrane plasmique^8,9, tandis que la microscopie SD est parmi les plus sensibles et rapide vivent des techniques d’imagerie pour la visualisation et le suivi des organites subcellulaires dans le cytoplasme^10,11. La combinaison des deux techniques d’imagerie en une seule configuration ont déjà été réalisée dans les dernières^12,13, cependant, le microscope présenté ici (Figure 1) enfin répond aux critères pour effectuer des expériences de SD-FRBR imageries live des processus susmentionnés à 3 images par seconde vitesse. Ce microscope étant disponible dans le commerce, l’objectif de ce manuscrit est de décrire dans le détail et offrir des outils open source et des protocoles d’acquisition d’images, enregistrement et visualisation associée à la microscopie SD-FRBR.

La configuration est basée sur un microscope inversé raccordé à balayage deux appareils via les ports indépendants - le port gauche est lié à l’unité de la SD et le port arrière pour unité scanner pour FRBR et photo-activation/blanchiment des expériences. Jusqu'à 6 lasers (405/445/488/515/561/640 nm) peut être utilisée pour l’excitation. Pour l’excitation et la détection du signal de fluorescence, soit un 100 x / NA1.45 huile ou x 60 / NA1.49 huile objectif FRBR, respectivement, ont été employées. La lumière émise est divisée par un miroir dichroïque (561 nm de long-pass ou 514 nm de long-pass) et filtrée par divers filtres passe-bande (55 nm de large centrée à 525 nm, 54 nm de large centrée à 609 nm pour la fluorescence verte et rouge, respectivement) placés devant les deux cam EM-CCD enchères électroniques inversées. Veuillez noter que des détails plus techniques sur le programme d’installation sont répertoriés dans Zobiak et al. ⁷. dans la configuration de la FRBR, l’unité de la SD est déplacée hors du trajet optique dans environ 0,5 s afin que les deux caméras mêmes peuvent être utilisés pour la détection, ce qui permet une commutation plus rapide entre les deux modalités d’imagerie comparées à environ 1 s qui a été rapporté dans le passé^{13 < /C2 >. Cette fonction permet l’acquisition simultanée de deux canaux, donc 4 canaux SD-FRBR imagerie à précédemment vitesse inégalée et exactitude peut être effectuée. Par ailleurs, l’alignement entre les images SD et FRBR est inutile. Alignement de l’image entre les deux caméras, toutefois, doit être vérifié avant de commencer l’expérience et corrigé si nécessaire. Dans le protocole suivant, une routine de correction d’enregistrement a été mis en œuvre dans une macro autonome écrite d’ImageJ. En outre, la macro a été principalement conçue pour permettre une visualisation simultanée de SD - et datasets FRBR malgré leur dimensionnalité différente. Le logiciel d’acquisition elle-même n’a pas fourni ces fonctionnalités.}

Protocole

1. préparation des cellules

1. Deux jours avant l’expérience, les semences 3 * 10⁵ HeLa ou NIH3T3 cellules dans 2 mL de milieu de culture complet / puits d’une plaque de 6 puits culture cellulaire. Veiller à ce que les cellules sont traitées dans une hotte à flux laminaire tout au long de ce protocole.
2. Un jour avant l’expérience, préparer les réactifs de transfection selon les recommandations du fabricant ou un protocole déterminé empiriquement, par exemple:
   1. Diluer 1 µg de DP-Lifeact et 1 µg de YFP-Vinculine dans un total de 200 µL de milieu de sérum réduit. Vortex le réactif de transfection brièvement, ajouter 4 µL à 200 µL ADN et vortex à nouveau. Incuber le mélange de transfection pendant 15-20 min à température ambiante.
   2. Ajouter le mélange de transfection toute goutte directement aux cellules. Mélanger en secouant la plaque et le placer dans l’incubateur.
3. Le jour de l’expérience, préparation des échantillons pour l’imagerie webcam live :
   1. Préparer une solution de 10 µg/mL de la fibronectine dans du PBS pour enduire la surface d’un plat de fond de verre de 35 mm. Utiliser seulement haute qualité 0,17 mm verre couvre-objet pour des performances optimales de la FRBR et éviter les plats en plastique fond. Laissez la solution sur la surface du verre pour 30 min à température ambiante, puis retirez-le et laissez la vaisselle sécher à l’air.
   2. Diluer une solution multi-fluorescent perles de 0,1 µm à une densité de 1,8 x 10⁹ particules / mL dans l’eau distillée et ajouter la solution pendant 30-60 s à la surface de verre enduit de la fibronectine. Retirez immédiatement la solution et laissez la vaisselle sécher à l’air.
      Remarque : Cette étape est nécessaire uniquement si le plan de la FRBR devrait être trouvé avant l’ensemencement de cellules ou d’acquérir une image de référence de 2 couleurs pour l’enregistrement d’images axées sur le talon.
   3. Préparer une solution d’acide ascorbique (AA) 0,1 M et le diluer à une concentration finale de 0,1 mM en milieu de culture (AA-moyen). Placer la solution dans un bain-marie à 37 ° C.
      Remarque : Utilisez optimisé fluorescence milieu de culture cellulaire si possible, tel que phenolred-free et support réduit flavin (ribo-). AA est un agent anti-oxydants qui peut réduire les effets phototoxiques lors d’imagerie live¹⁴. Nous avons testé avec succès il dans ce test, c'est-à-dire plus de cellules est apparus en bonne santé dans les conditions appliquées que sans ajout de AA. Cependant, le pH du milieu a été abaissé de 0,17 unités de pH.
   4. Laver les cellules avec 2 mL de PBS, ajouter 250 µL trypsine-EDTA et attendre jusqu'à ce que les cellules soient totalement détaché (2-3 min dans un incubateur à 37 ° C). Remettre en suspension les cellules soigneusement dans 1 mL préchauffée AA-moyen avec une pipette et ajoutez-le à 4 mL AA-médium dans un tube 15 mL de culture cellulaire. Placez la suspension cellulaire muni d’un couvercle légèrement ouvert dans un incubateur mis à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans les environs du microscope.
   5. Ajouter 1 mL préchauffée AA-support à plat le fond en verre et placez-le dans le support du microscope préchauffé (voir paragraphe suivant).

2. live imagerie

1. Démarrer le contrôle de l’environnement du microscope pour obtenir une stable de 37 ° C, 5 % de CO₂ et une atmosphère humide.
   NOTE : Ici, une chambre d’incubation supérieure petite scène a été utilisée qu’autorisées paramètres stables au sein des pépinières d’entreprises plus grandes environ 15 min. faudra plus de temps pour atteindre des conditions stables.
2. Fixer tous les réglages d’acquisition au microscope avant l’application de la suspension cellulaire :
   1. Définissez l’intervalle de temps de 30 s et la durée de 60 à 90 min. activent la fonction autofocus de l’auto-focus basée sur le matériel pour chaque point du temps (valeur « 1 »).
   2. Ajuster l’exposition de l’appareil et gain, ainsi que la puissance du laser pour chaque canal. Gain élevé niveaux, temps d’exposition faible et laser de faible puissance sont recommandables pour réduire la toxicité de la photo.
      NOTE : Les données présentées ici a été acquis avec une exposition de 200 ms, gain de puissance de laser niveau 500 et 20 % qui correspond à des intensités d’excitation de 0,5 W/cm² pour 488 nm et 1 W/cm² pour 561 nm, respectivement.
   3. La valeur du z-pile pour les canaux de la filature-disque 10 µm avec 0,4 µm espacement. Désactiver la fonction z-piles pour les canaux de la FRBR. Définissez le décalage inférieur à « 0 », c'est-à-dire le plan le plus bas sera la position de mise au point du matériel auto-focus.
   4. Activer la fonction multipoint « postes de scène ».
      NOTE : Jusqu'à 3 positions peuvent être enregistrées dans un intervalle de 30 s.
3. Trouver les perles fluorescentes avec éclairage fluorescent epi à l’oculaire, ou sur l’écran de l’ordinateur, puis activer un canal de la FRBR et régler l’angle d’éclairage à une valeur qui identifie l’illumination de la FRBR. Activer l’auto-focus en appuyant sur le bouton sur le panneau de microscope et ajuster le focus avec la jante a DEPORT. Acquérir un dataset 2 couleurs, c'est-à-dire FRBR-488 et FRBR-561, pour enregistrement subséquent image axée sur le talon (voir point 3.1).
   1. Facultatif : Pour assurer l’illumination de la FRBR, ajoutez quelques microlitres de suspension perles multicolore fluorescent flottant librement (voir point 1.3.2.). Activer l’affichage en direct d’un canal de la FRBR et augmenter l’angle d’éclairage. Les perles non adhérents vont disparaître au-delà de l’angle critique, assurant une bonne FRBR éclairage⁸.
4. Mélanger la suspension cellulaire encore une fois en inversant le tube fermé 2 - 3 fois et appliquer 1 mL des cellules sur le plat d’imagerie.
5. Trouver rapidement les cellules transfectées double avec faible niveau d’illumination épi-fluorescence. Centrez les cellules dans l’aperçu direct de la caméra en utilisant l’illumination du champ lumineux et marquer la position. Trouver un autre 1-2 points d’intérêt et les enregistrer dans la liste de positions.
   NOTE : Au début, les cellules facilement peuvent se détacher en raison du mouvement de la scène, donc mettre 4-5 postes et revérifiez tout avant de commencer une acquisition d’images. Ensuite, jeter les positions 1-2.
6. Commencer d’acquisition de données en cliquant sur le bouton « Sequence ».

3. image post-traitement dans ImageJ

1. Pour générer un hyperstack sans inscription dans Fidji¹⁵, une macro nommée « SD-TIRF_helper » a été écrit qui peut être appliqué à 2-4 canaux SD-FRBR timelapse datasets. Enregistrez le fichier « SD-TIRF_helper_JoVE.ijm » dans le Fidji est un sous-dossier « macros » et exécutez la macro en cliquant sur la commande de menu « Plugins > Macros > exécuter... ».
   1. Si les canaux de couleur besoin de correction de l’enregistrement, sélectionnez l’option et créer une nouvelle référence de perle d’enregistrement (fichier de point de repère) ou utiliser un fichier existant qui a été créé avant.
      Remarque : Le plugin de turboreg¹⁶ s’appliquera à fluorescence perles images de référence. Installer le plugin dans le logiciel de Fidji conformément aux lignes directrices générales pour les installations de plugin.
   2. Importer les données avec l’importateur bio-formats et choisir hyperstack comme une option d’affichage. Charger le dataset de l’image, sélectionnez la série SD dans la première étape et la série FRBR dans la deuxième étape. Fidji affichera les données triées par la position de canal et de la scène, c'est-à-dire normalement tous les canaux SD et tous les FRBR-canaux apparaissent comme un hyperstack pour chaque poste de stade qui a été sélectionné.
      NOTE : Importation des données est possible à partir de divers types de fichiers, par exemple types tels que TIFF-série ou fichier dépendant de la plateforme * e. Le type de fichier ne peut être reconnu que si elle n’était pas exporté par le logiciel d’acquisition comme indépendant, sans compression format TIFF.
   3. Appliquer la correction de l’enregistrement pour les canaux en chargeant le fichier de points de repère préétabli.
   4. Sélectionnez la table de correspondance de la couleur désirée (LUT) pour chaque canal SD - et FRBR et fusionnez-les dans un hyperstack simple, multi-dimensionnel.
      Remarque : Pendant le traitement des canaux FRBR, un certain nombre d’avions-z avec des valeurs nulles intensité est ajouté sur le dessus de l’avion de fond qui correspond au nombre de z-avions dans le dataset de la SD. Cette étape est importante pour la visualisation de la hyperstack final. Cette méthodologie est correcte, depuis la profondeur de l’illumination de la FRBR (moins de 200 milles marins⁷) est plus petite que la taille du z-pas de la pile de la SD (400 nm).

Résultats

Afin de montrer le potentiel de l’imagerie de SD-FRBR, qu'un essai a été développé qui devrait révéler l’organisation spatio-temporelle des complexes d’adhérence cellule-matrice et leur interaction avec le cytosquelette au cours de l’adhésion cellulaire. Par conséquent, adhérent HeLa ou, alternativement, NIH3T3 cellules ont été transfectées avec YFP-Vinculine et DP-Lifeact pendant 18 à 24 heures, trypsinisées et boutonnée sur plats bas de verre enduit de la fibrone...

Discussion

Dans le présent document a été présenté la première mise en œuvre réussie de la SD et TIRF microscopie dans une configuration adaptée pour réaliser des expériences d’imagerie de cellules vivantes, c'est-à-dire taux d’acquisition élevée tels que 2 cheminées d’image SD-FRBR / minute à 3 différents stade postes, correspondant à un total de 168 images (environ 3 images par seconde), ont été acquises. Les microscopes de SD-FRBR quelques qui ont été décrits précédemment^...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope and accessories
SD-TIRF microscope	Visitron Systems
Ti with perfect focus system	Nikon		Inverted microscope stand
CSU-W1 T2	Yokogawa		Spinning disk unit in dual-camera configuration
iLAS2	Roper Scientific		TIRF/FRAP scanner
Evolve	Photometrix		EM-CCD cameras
PiezoZ stage	Ludl Electronic Products		Motorized Z stage
Bioprecision2 XY stage	Ludl Electronic Products		Motorized XY stage
Stage top incubation chamber	Okolab	Bold Line	Temperature, CO2 and humidity supply
Cell culture
HeLa cervical cancer cells	DSMZ	ACC-57
NIH3T3 fibroblasts	DSMZ	ACC-59
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	14190144
Trypsin-EDTA 0.05%	Gibco	25300054
Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM)	Gibco	31966-021
OptiMEM	Gibco	31985070	Reduced serum medium
Fetal calf serum (FCS)	Gibco	10500064
Penicillin/Streptomycin (PenStrep)	Gibco	15140148
Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep)
TurboFect	ThermoFisher Scientific	R0531	Transfection reagent
Ascorbic acid (AA)	Sigma	A544-25G
6-well cell culture plate	Sarstedt	83.392
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-10-C	35mm, 0.17mm glass coverslip
Fibronectin, bovine plasma	ThermoFisher Scientific	33010018
Neubauer improved chamber	VWR	631-0696
TetraSpeck beads	ThermoFisher Scientific	T7279
Plasmids
RFP-Lifeact			Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany
YFP-Vinculin			Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany
Software and plugins
VisiView	Visitron Systems		Version 3
ImageJ			Version 1.52c
Turboreg plugin			http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"	this publication		https://github.com/bzobiak/ImageJ
Volocity	PerkinElmer		Version 6.2.2