Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

Resumo

Um microscópio avançado que permitem rápida e de alta resolução de imagem de ambos, a membrana plasmática isolada e o volume intracelular circundante, será apresentado. A integração de giro do disco e total microscopia de fluorescência de reflexão interna em uma configuração permite experiências de imagens ao vivo em taxas de aquisição elevado até 3.5 s por pilha de imagem.

Resumo

Em células vivas, processos tais como a formação de aderência envolvem grandes mudanças estruturais na membrana plasmática e o interior da célula. Para visualizar estes eventos altamente dinâmicos, duas técnicas de microscopia de luz complementares que permitem rápida imagem latente de amostras ao vivo foram combinadas: girando microscopia de disco (SD) para a gravação do volume rápido e de alta resolução e reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRF) para visualização da membrana plasmática e localização exacta. Um protocolo de imagem abrangente e completo será mostrado para guiar a aquisição, calibração de microscópio, formação de imagem e preparação da amostra, resultando em uma série de imagens ao vivo de cor multi SD-TIRF com alta resolução espaço-temporal. Todas as etapas de pós-processamento de imagem necessária para gerar multidimensional datasets de imagens ao vivo, ou seja, o registro e a combinação dos canais individuais, são fornecidas em uma macro auto escrita para o open source software ImageJ. A imagem latente de proteínas fluorescentes durante a iniciação e a maturação dos complexos de adesão, bem como a formação da rede do citoesqueleto de actina, foi utilizado como prova de princípio para esta nova abordagem. A combinação de microscopia 3D de alta resolução e TIRF forneceu uma descrição detalhada destes processos complexos dentro do ambiente celular e, ao mesmo tempo, localização exacta das moléculas da membrana-associado detectado com um alto relação de sinal-para-plano de fundo.

Introdução

Nossos dias, técnicas de microscopia de luz, fornecendo imagens de resolução alta/super no fixo e espécime vivo estão se desenvolvendo rapidamente. Técnicas de super-resolução como estimularam emissão depleção (STED), estruturada iluminação microscopia (SIM) e microscopia de localização de foto-ativação (PALM) ou microscopia direta reconstrução óptica estocástico (Tempestade), respectivamente, são comercialmente disponíveis e permitir a geração de imagens de estruturas subcelulares, mostrando detalhes quase na escala molecular^1,2,3,4,5,6. No entanto, essas abordagens ainda limitados aplicabilidade para experiências de imagens ao vivo, em que grandes volumes precisam ser visualizado com múltiplos frames por segunda velocidade de aquisição. Variedades de processos altamente dinâmicos, regulamentados através da membrana plasmática, por exemplo, endo- / exocitose, adesão, migração ou sinalização, ocorrem com alta velocidade dentro de grandes volumes de celulares. Recentemente, a fim de preencher esta lacuna, uma técnica de microscopia integrado foi proposto girando chamado disco-TIRF (SD-TIRF)⁷. No detalhe, microscopia TIRF permite especificamente isolar e localizar a membrana plasmática^8,9, enquanto SD microscopia é um dos mais sensíveis e rápido viver técnicas de imagem para a visualização e acompanhamento das organelas subcelulares na citoplasma^10,11. A combinação de ambas as técnicas de imagem em uma única instalação já foi realizada no últimos^12,13, no entanto, o microscópio aqui apresentado (Figura 1) finalmente cumpre os critérios para realizar experimentos de SD-TIRF de imagens ao vivo os processos acima mencionados em 3 frames por segunda velocidade. Desde que este microscópio é comercialmente disponível, o objetivo deste manuscrito é descrever em detalhes e fornecer ferramentas open source e protocolos para aquisição de imagens, registro e visualização associada a microscopia SD-TIRF.

A instalação é baseada em um microscópio invertido ligado a varredura duas unidades através de portas independentes - porta esquerda está ligada à unidade SD e porta traseira para a unidade do scanner para TIRF e foto-ativação/branqueamento experimentos. Lasers de até 6 (405/445/488/515/561/640 nm) pode ser usado para a excitação. Excitação e detecção do sinal de fluorescência, ou um 100 x / óleo NA1.45 ou 60 x / óleo NA1.49 objetivo TIRF, respectivamente, têm sido empregadas. A luz emitida é dividida por um espelho dicroico (561 nm-passe longo ou 514 nm long-pass) e filtrado por vários filtros passa-banda (55 nm de largura centrada em 525 nm, 54 nm de largura centrada em 609 nm para fluorescência verde e vermelha, respectivamente) colocado na frente da cam CCD EM dois épocas. Por favor, note que os detalhes mais técnicos sobre a instalação estão listados na Zobiak et al ⁷. na configuração TIRF, a unidade de SD é movido para fora o trajeto da luz dentro de cerca de 0,5 s para que as mesmas duas câmeras podem ser usadas para a deteção, permitindo a comutação rápida entre as duas modalidades de imagem em comparação com cerca de 1 s, o que foi relatado no passado^{13 < /C2 >. Este recurso permite a aquisição simultânea de canal duplo, assim, 4 canais SD-TIRF imagem no anteriormente velocidade incomparável e precisão pode ser executada. Além disso, o alinhamento entre imagens SD e TIRF é desnecessário. Alinhamento de imagem entre as duas câmaras, no entanto, deve ser verificada antes de iniciar o experimento e corrigidos, se necessário. No seguinte protocolo, uma rotina de correção de registro foi implementada em uma macro auto escrita do ImageJ. Além disso, a macro foi principalmente projetada para permitir uma visualização simultânea do SD - e datasets TIRF apesar de sua dimensionalidade diferente. O software de aquisição não fornecer esses recursos.}

Protocolo

1. preparação das células

1. Dois dias antes do experimento, as sementes de 3 * 10⁵ HeLa ou NIH3T3 células em 2 mL do meio de crescimento cheio por alvéolo de uma placa de cultura de pilha 6-poços. Certifique-se de que as células são tratadas em uma capa de fluxo laminar em todo este protocolo.
2. Um dia antes do experimento, prepare os reagentes de transfecção de acordo com as recomendações do fabricante ou um protocolo empiricamente determinado, por exemplo:
   1. Diluir 1 µ g de RFP-Lifeact e 1 µ g/ml de YFP-vinculina um total de 200 µ l reduzida média de soro. Vórtice o reagente de transfeccao brevemente, adicionar 4 µ l a 200 µ l DNA e vórtice novamente. Incube a mistura de Transfeccao para 15-20 min à temperatura ambiente.
   2. Adicione a mistura de transfeccao toda gota a gota diretamente para as células. Misture agitando a placa e colocá-lo de volta para a incubadora.
3. No dia do experimento, prepare a amostra para a geração de imagens ao vivo:
   1. Prepare uma 10 µ g/mL solução de fibronectina em PBS para revestir a superfície de vidro de um prato de fundo de vidro de 35 mm. Use somente alta qualidade 0,17 mm as lamelas de vidro para um desempenho ideal TIRF e evite pratos de plástico inferior. Deixe a solução na superfície do vidro por 30 min à temperatura ambiente, então remova-o e deixe o prato deixe secar naturalmente.
   2. Diluir uma solução de grânulos multi fluorescente 0.1 µm com uma densidade de 1,8 x 10⁹ partículas por mL de água destilada e adicionar a solução para 30-60 s para a superfície de vidro revestido de fibronectina. Imediatamente remover a solução e deixe o prato deixe secar naturalmente.
      Nota: Este passo é necessário somente se o avião TIRF deve ser encontrado antes da semeadura de células e/ou adquirir uma imagem de referência de 2 cores para registro de imagem baseada em talão.
   3. Preparar uma solução de 0,1 M de ácido ascórbico (AA) e diluir para uma concentração final de 0,1 mM em um meio (AA-médio). Coloque a solução em banho maria a 37 ° C.
      Nota: Use otimizado fluorescência meio de cultura celular se possível, tais como phenolred-livre e (ribo) flavin-reduzida e médias. AA é um agente antioxidante que pode reduzir efeitos fototóxicos durante a geração de imagens ao vivo¹⁴. Nós temos testado com sucesso neste ensaio, ou seja, mais células apareceram saudáveis sob as condições aplicadas do que sem adição de AA. No entanto, o pH do meio foi reduzido por 0,17 unidades de pH.
   4. Lavar as células com 2 mL de PBS, adicionar 250 µ l do Trypsin-EDTA e espere até que as células são totalmente separada (2-3 min em uma incubadora de 37 ° C). Ressuspender as células cuidadosamente 1ml pré aquecido AA-médio com uma pipeta e adicioná-lo ao mL 4 AA-médio em um tubo de cultura de células de 15 mL. Coloque a suspensão de células com uma tampa um pouco aberta na incubadora conjunto para 37 ° C e 5% CO₂ nos arredores do microscópio.
   5. Adicionar 1 mL pré-aquecido AA-médio para o prato fundo de vidro e coloque-o no suporte do microscópio pré-aquecido (ver parágrafo seguinte).

2. ao vivo imagens

1. Inicie o controle ambiental do microscópio para alcançar uma estável a 37 ° C, 5% de CO₂ e atmosfera úmida.
   Nota: Aqui, uma câmara de incubação superior pequeno palco tem sido usada que permitido configurações estáveis dentro de cerca de 15 min. de incubadoras maiores precisará de mais tempo para alcançar condições estáveis.
2. Corrigi todas as configurações de aquisição no microscópio antes de aplicar a suspensão de células:
   1. Definir o intervalo de tempo de 30 s e a duração de 60-90 min. activar a função de focagem automática do autofoco baseado em hardware para cada ponto do tempo (valor "1").
   2. Ajuste a exposição da câmera e ganho, bem como a potência do laser para cada canal. Alto ganho de níveis, tempo de exposição baixo e do laser de baixa potência são recomendáveis para reduzir a toxicidade de foto.
      Nota: Os dados aqui apresentados foi adquiridos com exposição de 200 ms, ganho de nível 500 e 20% do laser de potência igual a intensidades de excitação de 0.5 W/cm ² para 488 nm e 1 W/cm ² para 561 nm, respectivamente.
   3. Defina a z-pilha para os canais de disco giratório para 10 µm com espaçamento de 0,4 µm. Desactivação da z-pilhas para os canais TIRF. Defina o deslocamento inferior para "0", ou seja, o avião mais baixo será a posição do foco da ferragem autofoco.
   4. Active a função de multi-ponto "posições de estágio".
      Nota: Até 3 posições podem ser gravadas em um intervalo de tempo de 30 s.
3. Encontrar os grânulos fluorescentes com iluminação epi-fluorescente para a ocular ou na tela do computador, em seguida, ativar um canal TIRF e definir o ângulo de iluminação para um valor que indica a iluminação TIRF. Ativar o foco automático pressionando o botão no painel do microscópio e ajustar o foco com a roda de deslocamento. Adquirir um conjunto de dados 2-cor, ou seja, TIRF-488 e TIRF-561, para registro de imagem baseada em grânulo subsequentes (ver ponto 3.1).
   1. Opcional: Para garantir iluminação TIRF, adicione alguns microlitros de suspensão de grânulos multicolor fluorescente livremente flutuante (ver ponto 1.3.2.). Ativar a exibição ao vivo de um canal de TIRF e aumentar o ângulo de iluminação. Os grânulos não-aderente desaparecerá para além do ângulo crítico, garantindo uma correta TIRF iluminação⁸.
4. Misturar a suspensão celular novamente invertendo o tubo fechado-2 - 3 vezes e aplicar 1 mL das células para o prato de imagem.
5. Rapidamente encontre células transfectadas-duplo com baixa iluminação nível de epi-fluorescente. Centralize as células na visualização de câmera ao vivo usando a iluminação de campo claro e marque a posição. Encontrar mais 1-2 pontos de interesse e salvá-los para a lista de posições.
   Nota: No início, as células facilmente podem desanexar devido ao movimento de palco, portanto, definir posições de 4-5 e re-Verifique tudo antes de iniciar a aquisição de imagens. Em seguida, descarte o 1-2 posições.
6. Inicie a aquisição de dados, clicando no botão "Sequência".

3. pós-processamento de a imagem no ImageJ

1. A fim de gerar uma hyperstack sem registro em FIJI¹⁵, uma macro denominada "SD-TIRF_helper" foi escrita que pode ser aplicado a conjuntos de dados o timelapse de SD-TIRF canal 2-4. Salve o arquivo "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" em a FIJI sub-pasta "macros" e execute a macro clicando no comando de menu "Plugins > Macros > executar...".
   1. Se os canais de cor precisam de correção de registro, selecione a opção e criar uma nova referência de registro baseado em grânulo (arquivo de ponto de referência) ou usar um arquivo existente que foi criado antes.
      Nota: O plugin de turboreg¹⁶ será aplicada às imagens de referência de grânulos de fluorescência. Instale o plugin no software de FIJI, de acordo com as orientações gerais para as instalações do plugin.
   2. Importar os dados com o importador de bio-formatos e escolher hyperstack como uma opção de visualização. Carregar o conjunto de dados de imagem, selecione a série SD na primeira etapa e a série TIRF na segunda etapa. FIJI exibirá os dados classificados por canal e fase de posição, ou seja, normalmente todos os SD-canais e todos os canais-TIRF mostram-se como um hyperstack para todas as posições de estágio que foi seleccionada.
      Nota: Importação de dados é possível a partir de vários tipos de arquivo, por exemplo, TIFF-série ou plataforma-dependente arquivo tipos tais como * nd. O tipo de arquivo não pode ser reconhecido apenas se ele não foi exportado pelo software de aquisição como independente, menos compressão formato TIFF.
   3. Aplica a correção de registo para os respectivos canais carregando o arquivo Marcos pré-determinado.
   4. Selecione a tabela do Look-up de cor desejada (LUT) para todos os canais SD - e TIRF e mesclá-las em um hyperstack único, multi-dimensional.
      Nota: Durante o processamento dos canais TIRF, um número de aviões-z com zero valores de intensidade é adicionado no topo o plano de fundo que corresponde com o número de aviões-z no dataset SD. Este passo é importante para a visualização de hyperstack o final. Esta metodologia está correta, desde a profundidade da iluminação TIRF (menos de 200nm⁷) é menor que o tamanho de z-passo da pilha SD (400 nm).

Resultados

Para mostrar o potencial da imagem SD-TIRF, que desenvolveu um ensaio que deveria revelar a organização espaço-temporal de complexos de adesão célula-matriz e sua interação com o citoesqueleto durante a adesão celular. Portanto, aderente HeLa ou, alternativamente, NIH3T3 células foram transfectadas com YFP-vinculina e RFP-Lifeact para 18-24 h, trypsinized e semeado em pratos de fundo de vidro revestido de fibronectina. Estas linhas de célula foram escolhidas para seus pronunciad...

Discussão

Neste trabalho foi apresentado a primeira implementação bem sucedida da microscopia SD e TIRF em uma configuração adequada para a realização de experiências imagem de célula viva, ou seja, taxas de aquisição elevado, tais como 2 pilhas de imagem SD-TIRF por minuto 3 fase diferente posições, correspondentes a um total de 168 quadros (cerca de 3 quadros por segundo), foram adquiridas. Os microscópios de SD-TIRF alguns que eram anteriormente descrito^12,

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope and accessories
SD-TIRF microscope	Visitron Systems
Ti with perfect focus system	Nikon		Inverted microscope stand
CSU-W1 T2	Yokogawa		Spinning disk unit in dual-camera configuration
iLAS2	Roper Scientific		TIRF/FRAP scanner
Evolve	Photometrix		EM-CCD cameras
PiezoZ stage	Ludl Electronic Products		Motorized Z stage
Bioprecision2 XY stage	Ludl Electronic Products		Motorized XY stage
Stage top incubation chamber	Okolab	Bold Line	Temperature, CO2 and humidity supply
Cell culture
HeLa cervical cancer cells	DSMZ	ACC-57
NIH3T3 fibroblasts	DSMZ	ACC-59
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	14190144
Trypsin-EDTA 0.05%	Gibco	25300054
Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM)	Gibco	31966-021
OptiMEM	Gibco	31985070	Reduced serum medium
Fetal calf serum (FCS)	Gibco	10500064
Penicillin/Streptomycin (PenStrep)	Gibco	15140148
Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep)
TurboFect	ThermoFisher Scientific	R0531	Transfection reagent
Ascorbic acid (AA)	Sigma	A544-25G
6-well cell culture plate	Sarstedt	83.392
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-10-C	35mm, 0.17mm glass coverslip
Fibronectin, bovine plasma	ThermoFisher Scientific	33010018
Neubauer improved chamber	VWR	631-0696
TetraSpeck beads	ThermoFisher Scientific	T7279
Plasmids
RFP-Lifeact			Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany
YFP-Vinculin			Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany
Software and plugins
VisiView	Visitron Systems		Version 3
ImageJ			Version 1.52c
Turboreg plugin			http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/
Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"	this publication		https://github.com/bzobiak/ImageJ
Volocity	PerkinElmer		Version 6.2.2