Anbau von grünen Mikroalgen in Bubble Spalte Photobioreaktoren und ein Test für neutrale Lipide

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Labormaßstab Blase Spalte Photobioreaktoren zu konstruieren und zu Kultur Mikroalgen zu verwenden. Es bietet auch eine Methode zur Bestimmung der Wachstumsrate Kultur und neutrale Lipidgehalt.

Zusammenfassung

Es gibt großes Interesse an der Studie von Mikroalgen für technische Anwendungen wie etwa die Herstellung von Biokraftstoffen, hochwertigen Produkten, und für die Behandlung von Abfällen. Wie die meisten neuen Forschungsanstrengungen im Labormaßstab beginnen, gibt es eine Notwendigkeit für kostengünstige Methoden zur Kultivierung von Mikroalgen reproduzierbar. Hier kommunizieren wir einen effektiven Ansatz zur Kultur Mikroalgen im Labormaßstab Photobioreaktoren, und das Wachstum und die neutralen Lipidgehalt dieser Algen zu messen. Anweisungen sind auch zum Einrichten des Photobioreaktor-Systems enthalten. Obwohl die Beispiel Organismen Arten von Chlorella und Auxenochlorellasind, kann dieses System angepasst werden, um eine Vielzahl von Mikroalgen, einschließlich Ko-Kulturen von Algen mit Algenarten zu kultivieren. Stammkulturen sind zum ersten Mal in Flaschen, Inokulum für das Photobioreaktor-System zu produzieren angebaut. Algen-Inokulum ist konzentriert und in Photobioreaktoren zur Kultivierung im Batch-Modus übertragen. Proben werden täglich für die optische Dichte-Messwerte gesammelt. Am Ende der Batch-Kultur Zellen werden geerntet, indem Zentrifuge gewaschen, und gefriergetrocknet, eine endgültige Trockengewicht Konzentration zu erhalten. Die endgültige Trockengewicht Konzentration wird verwendet, um eine Korrelation zwischen der optischen Dichte und das Trockengewicht Konzentration zu erstellen. Eine modifizierte Folch Methode wird anschließend verwendet, um insgesamt Lipide aus gefriergetrockneten Biomasse zu extrahieren und der Extrakt ist für seine neutrale Fettgehalt mit einer Mikrotestplatte Assay untersucht. Dieser Assay ist bisher erschienen aber Protokoll Schritte wurden hier aufgenommen, um kritische Schritte des Verfahrens zu markieren, wo häufig Fehler auftreten. Die hier beschriebenen Bioreaktorsystem füllt eine Nische zwischen einfachen Flasche Anbau und kommerziellen Bioreaktoren vollständig kontrolliert. Sogar mit nur 3-4 biologische repliziert pro Behandlung, unser Ansatz zur Kultivierung von Algen führt zu engen Standardabweichungen in der Wachstums- und Lipid-Assays.

Einleitung

Die Anwendung von Mikroalgen in Technik und Biotechnologie hat großes Interesse in den letzten Jahren angezogen. Mikroalgen werden für den Einsatz in Abwasser Behandlung^1,2,3,4, Biofuel Produktion^5,6,7,8, untersucht und die Herstellung von Nutraceuticals und andere hochwertige Produkte^9,10. Algen sind auch größere Preisen in dem Bemühen zur Verbesserung der Fitness für spezielle technische Anwendungen^11,12genmanipuliert sein. Infolgedessen gibt es großes Interesse am Experimentieren mit industriell relevante Organismen in kontrollierter Einstellungen. Der Zweck dieser Methode ist, einen effektiven Ansatz zur Kultur Mikroalgen in einer kontrollierten Laborumgebung zu kommunizieren und um das Wachstum und die neutralen Lipidgehalt dieser Algen zu messen. Verbesserung des Wachstums raten und neutrale Lipidgehalt der Mikroalgen als zwei wichtigsten Engpässe in Richtung Kommerzialisierung von Algen Biokraftstoffe¹³eingestuft wurden.

Eine Vielzahl von Ansätzen wurden verwendet, um Kultur-Algen um zu Versuchszwecken. Im Allgemeinen können diese Ansätze großflächigen Anbau im Freien und kleine indoor-Anbau aufgeteilt werden. Freilandkultur in Photobioreaktoren und offene Teiche eignet sich für Experimente zur Aufstockung der Prozesse, die bereits im Labormaßstab (z. B. testen Sie Scale-Up von einen neuen High-Lipid-Stamm von Algen) nachweislich¹⁴. Aber kleine indoor-Anbau eignet sich bei der Entwicklung neuer oder verbesserter Algen Stämme oder Durchführung von Experimenten darauf abzielen, das Verständnis biologischer Mechanismen. In diesen letzteren Fällen ist eine hohe experimentelle Kontrolle erforderlich, um subtile Veränderungen im biologischen Verhalten herauskitzeln. Zu diesem Zweck müssen die axenic Kulturen häufig zur Minimierung der komplexen biotischen Faktoren im Zusammenhang mit anderen Organismen (z. B. Bakterien, andere Algen), die unweigerlich in Großanlagen im Freien wachsen. Auch wenn Wechselwirkungen zwischen Algen und andere Organismen zu studieren, haben wir festgestellt, dass Verwendung von hoch-kontrollierten Versuchsbedingungen hilfreich ist, bei der Untersuchung von molekularen Austausch zwischen Organismen^15,16,17.

Innerhalb der Kategorie der kleinen indoor Algenkultivierung wurden verschiedene Ansätze verwendet. Vielleicht ist der am häufigsten verwendete Ansatz wachsen Algen im Erlenmeyerkolben auf einem Shaker Tisch unter einer leichten Bank^18,19. Austausch von Sauerstoff und CO₂ erfolgt durch passive Diffusion durch ein Schaum Plug-in der Spitze des Kolbens. Einige Forscher haben dieses Set-up durch aktive Lüftung der Kolben²⁰verbessert. Ein anderer Ansatz ist, Algen in Flaschen, gemixt von Stir Bar und aktive Belüftung zu kultivieren. Trotz ihrer Schlichtheit haben wir festgestellt, dass die Verwendung von Flaschen und Flaschen oft zu inkonsistenten Ergebnissen unter biologischen repliziert führt. Dies ist vermutlich auf Positionseffekte - Positionen erhalten unterschiedliche Mengen an Licht, die auch interne Reaktor Temperaturen beeinflussen. Tägliche Rotation der Reaktoren auf neue Positionen können helfen, aber ist nicht das Problem lindern, weil bestimmte Stadien der Algenwachstum (z. B. früh exponentielle) sind empfindlicher gegenüber positionellen Effekte als andere (z. B. Log-Phase).

Auf der gegenüberliegenden Seite des Spektrums der technische Raffinesse sind kommerzielle Photobioreaktoren vollständig kontrolliert. Diese Systeme kontinuierlich überwachen und Anpassen von Bedingungen im Reaktor, Algenwachstum zu optimieren. Sie haben programmierbare Beleuchtung, Echtzeit-Temperaturregelung und die Kontrolle des pH-Werts. Leider, sie sind teuer und Kosten in der Regel mehrere tausend Dollar pro Reaktor. Die meisten wissenschaftliche und technische Zeitschriften erfordern biologische Replikation der Ergebnisse erfordern den Kauf mehrere Bioreaktoren. Wir stellen Ihnen hier eine Blase Spalte Reaktorsystem, Brücken, nähert sich die Kluft zwischen den einfachen (Kolben) und anspruchsvolle (vollständig kontrolliert Bioreaktor) für Labor-Maßstab Algenzucht. Blase Spalten verwenden steigende Gasblasen zu erleichtern Gasaustausch und Mischen des Reaktors. Dieser Ansatz bietet ein gewisses Maß an Kontrolle über die Beleuchtung und die Temperatur aber tut dies in einer Weise, die kostengünstig ist. Darüber hinaus fanden wir dieses System sehr konsistente Ergebnisse unter biologischen Wiederholungen reduziert die erforderliche Anzahl von biologischen Wiederholungen notwendig, um statistisch signifikante Ergebnisse im Vergleich zu der Flasche oder Flasche Ansatz zu erhalten. Wir haben dieses System auch verwendet, um Mischungen aus Algen und Bakterien²¹erfolgreich zu kultivieren. Neben der Algenzucht beschreiben wir ein Verfahren zur Messung der neutralen Fettgehalt in den kultivierten Algen. Die letztere Methode wurde an anderer Stelle veröffentlicht²², aber wir gehören das Verfahren hier um Schritt für Schritt Anleitungen wie man es erfolgreich einsetzen.

Protokoll

1. Aufbau der Blase Spalte Photobioreaktoren

1. Konstruieren Sie eine Reihe von belüfteten Deckeln aus Kunststoff-Deckel, die kam mit 1 L Glasflaschen und Hybridisierung Rohre (siehe Abbildung 1 für Schaltplan und Fotos). Deckel für Luftbefeuchter, mischen, Trap, jede Luft-Lift-Photobioreaktor und jede Flasche-Reaktor zu bauen.
   1. ¼" Löcher in den Deckel Bohren: 2 Löcher sind erforderlich für Bioreaktor und Luftbefeuchter Deckel; 3 Löcher sind für die Rührschüssel Falle erforderlich.
   2. Stecke eine ¼" o-Ring über die Fäden eines 1/8"-Panel-Mount Luer Fittings und schieben Sie diese in die ¼" Bohrung im Deckel (Abbildung 1A).
   3. Rutschen Sie, eine zweite ¼" o-Ring über die Fäden so dass der Deckel zwischen die beiden O-Ringe eingeklemmt ist. Schieben Sie eine Kontermutter auf das Gewinde und ziehen Sie zur Befestigung der Panel Mount Luer.
   4. Sprengringe Sperre auf die exponierten männlichen Luer Projektion aus dem Deckel. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.2-1.1.4 für jedes Loch im Deckel.
   5. Für Deckel, die auf Blase Spalte und Flasche Reaktoren verwendet werden, fügen Sie 1/8" weiblichen Luer mit Widerhaken Fittings bis 1.5" Stücke von 1/8" ID PVC-Schläuche. Fügen Sie diese zu jedem freigelegten männlichen Luer Fittings auf dem Deckel.
   6. Schließen Sie ein Rückschlagventil (den Deckel wegzeigt) an das freie Ende eines 1/8" Stücke.
      Hinweis: Dies wird als der Auslass für den Bioreaktor dienen.
   7. Verbinden Sie einen männlichen Luer mit Widerhaken passend zu dem zweiten Stück von 1/8" Schlauch, aus dem Deckel zu projizieren. Rasten Sie rotierende Sicherungsring ein und befestigen Sie einen 0,2 mm Luftfilter dazu.
      Hinweis: Dies wird als die Einlassöffnung für den Reaktor dienen.

Abbildung 1: Schaltplan und Fotos für den Bau von Bioreaktoren. (A) Schaltplan für den Bau des Bioreaktors Deckel (B) Foto der montierten Bioreaktor-Deckel und (C) Foto der montierten Deckel für den Luftbefeuchter verwendet. Beachten Sie, dass die Luftbefeuchter Beschläge in wasserdichten Silikon luftdicht mit dem Deckel darauf beschichtet werden sollte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

2. Montieren Sie die Luft-Delivery-System (siehe Abb. 2A und 2 b für einen Schaltplan und Foto).
   1. Befestigen Sie 1/8" NPT-Gewinde an Barb Armaturen, die ein- und Ausgänge auf der Rückseite der einzelnen Rotameter.
      Hinweis: 200-2.500 cm3/min Rotametern sind für Luft Druck Modulation stromaufwärts des Luftbefeuchters, 100-1.000 cm3/min Rotametern Flasche Reaktoren, 50-500 cm3/min Rotametern sind für Luft-Lift-Bioreaktoren und 5-50 cm³/ min Rotemeters sind zur CO₂ Durchflussregulierung. Es wird empfohlen, Mount Rotametern an einer festen Oberfläche (z.B. Plastikfolie) so dass sie nicht während des Betriebs über fallen.
   2. Die Druckluftquelle abgeschaltet, dann ¼" ID PVC Schlauch mit einer Schlauchschelle an der Druckluftquelle zu verbinden. Der Schlauchdurchmesser bis 1/8" ID PVC Schlauch mit einem ¼" weibliche Widerhaken Montage und ein 1/8" männlichen Barb Fitting zurücktreten.
   3. Verbinden Sie das freie Ende der ID Schlauch 1/8" mit dem Einlass ein 200-2.500 cm3/min Rotameter.
      Hinweis: Das Outlet von diesem Rotameter fließen Befeuchterflasche über ID Schlauch 1/8".
   4. Schließen Sie die 1/8" Schlauch zu einer Bucht eine belüftete Deckel (verwenden Sie einen weiblichen Luer, barb, passend zum herstellen die Verbindung). Schließen Sie ein zweites Stück 1/8" Schlauch an der Innenseite der Panel-Montage angebracht.
      Hinweis: Dieses Stück wird in den Luftbefeuchter und Blase Luft durch das Wasser nach unten hängen.
   5. Fügen Sie 1/8" weiblichen Luer barb Beschläge an jedem Ende eines Stückes ID Schlauch 1/8" und nutzen dieses Stück zum Einlass der mischenden Falle die Steckdose des Befeuchters herstellen.
   6. In der gleichen Weise wie 1.2.5 verbinden der Auslass des CO₂ Regler an einen zweiten Anschluss an die Rührschüssel Falle.
   7. Konstruieren Sie einen Verteiler mit 1/8" Schlauch und 1/8" multiport Widerhaken (siehe Abbildung 2 C) die Rotameter Banken Luft zugeführt.
      Hinweis: Diese Rotametern werden zur Bioreaktoren liefern. Mehr als 6 Rotametern in Serie bauen zu vermeiden. Verwenden Sie stattdessen parallele Banken Rotametern, um das System zu erweitern. Sicherzustellen, dass die Gesamtdurchsatz Nachfrage für alle Reaktoren weniger als 2.500 cm3/min ist (oder sonst eine größere Rotameter benötigt werden oberhalb des Befeuchters).
   8. Schließen Sie Steckdose (3^rd Port) der mischenden Falle an der neu errichteten Rotameter Banken mit 1/8" Schlauch und ein 1/8" weiblich zu Widerhaken Luer-Anschluss an.
   9. Verbinden Sie ausreichend lange 1/8" Schlauch zu den Outlets der einzelnen Rotameter in der Rotameter Bank zu Bioreaktoren Luftversorgung. Beschriften Sie die Enden der Schläuche sowie die Rotametern in der Bank.
   10. Tragen Sie wasserdicht Silikon rund um alle Ports auf den Luftbefeuchter und Mischung Falle Deckel um sicherzustellen, dass sie luftdicht sind.

Abbildung 2: Schaltplan und Fotos zur Montage von Blase Trennsystem. (A) schematische Darstellung der Belüftung System (B) Foto des Luftbefeuchters, mischen, Trap, und Rotameter Bank und (C) Foto von der Verteilerrohre verwendet, um die Rotameter Banken miteinander zu verbinden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

3. Einrichten von Aquarien, rühren, Platten und Lichter (Abbildung 3).
   Achtung: Dieses System erfordert eine große Anzahl von Outlets und ausreichende Kapazitäten, Schaltung um alle Komponenten zu unterstützen. Vermeiden Sie Aneinanderreihung mehrere Steckdosenleisten und Verlängerungskabel in einer Daisy-Chain-Mode, denn dies ist eine elektrische Gefahr. Einsatz von GFI Typ Steckdosen und Steckdosenleisten ist dringend empfohlen, wegen des Vorhandenseins des Wassers im System.
   1. Ordnen Sie die flache magnetischen Rührer auf einer ebenen Fläche, die stark genug ist um das Gewicht des wassergefüllten Aquarien zu halten.
   2. Platzieren Sie kleine Holz- oder Blöcke (das sind etwas größer als die Aufregung-Platten) im Umkreis der rühren Platten, das Gewicht der Aquarien zu unterstützen.
      Achtung: Vermeiden Sie die Aquarien direkt auf den Platten Aufsehen, da das Gewicht zerschlagen wird.
   3. Legen Sie die Aquarien über die Aufregung Platten und unterstützen Sie Blöcke zu und füllen Sie die Tanks mit Wasser.
   4. Schneiden Sie ein Stück von einer steifen Plastikfolie zu passen auf das Aquarium als Deckel. Schneiden Sie Löcher in diese Abdeckung die Hybridisierung Rohre rein und raus schieben. Außerdem schneiden Sie ein Loch für den Fisch Tankheizung.
   5. Ordnen Sie die fluoreszierenden Licht Banken neben das Aquarium, horizontale Beleuchtung von Bioreaktoren bereitzustellen. Stecken Sie die leichte Bank in einen leichten Timer, legen Sie einen Tag/Nacht-Zyklus.

Abbildung 3. Anlagenschema für die Flasche Bioreaktoren (links) und die Blase Spalte Photobioreaktoren (rechts). Diese Zahl wurde von Higgins Et Al. modifiziert ¹⁷. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

2. Vorbereitung der Mikroalgen Inokulum

1. Cryo-konserviert, versilbert oder flüssigen Kultur Mikroalgen Inokulum einzuholen.
   Hinweis: Es wird empfohlen, dass kryokonservierte Organismen beschichtet werden, vor der Verwendung als Inokulum zu gewährleisten, dass Zellen lebensfähig sind und die sich daraus ergebenden Kultur axenic ist. Agar-Medium (zB., ATCC #5 Sporen Agar)²¹ ist eine reiche Medium, das funktioniert gut für die Wiederbelebung der Arten von Chlorella und Auxenochlorella aus dem Cryo-Speicher.
2. Bereiten Sie 2,4 L Mineralwasser Medium, das für bestimmte Mikroalgen Arten geeignet ist.
   Hinweis: Beispiele sind N8 mittlere²³ Arten von Chlorella, N8-NH₄ mittlere²¹ Arten von Auxenochlorella. Verwendung eines Mediums für die Algen Belastung geeignet ist einer der wichtigsten Schritte in Richtung robuste Algenwachstum zu gewährleisten.
3. Für jede Flasche hinzufügen aliquoten 2,4 L Mineralwasser Medium gleich in drei 1 L Glasflaschen, rühren Bars zu jeder Flasche und montieren die belüftete Deckel (Abbildung 1). Überprüfen, die die Belüftung-Röhre auf der Einlassseite und jede Flasche hat eine Stir Bar drin.
4. Autoklaven die Vorratsflaschen mit einem flüssigen Sterilisation Zyklus (121 ° C) für 30 min. Autoklaven 100 mL entionisiertem Wasser (dH₂O) und einige 1,5 mL Röhrchen zur gleichen Zeit, die später zur Beschichtung verwendet werden. Lassen Sie das Medium cool über Nacht. Alternativ den Reaktor auf Raumtemperatur abkühlen lassen und dann für 2 h vor der Inokulation belüften.
5. Impfen Sie in eine biologische Kabinett (BSC) Mikroalgen aus einer Platte oder axenic Flüssigkultur in den Vorratsflaschen. Verwenden Sie sterilen Technik zur Wartung axenic Kulturen in den folgenden Schritten.
   1. Ein steril 50 mL Zentrifugenröhrchen 20 mL autoklaviert dH₂O hinzufügen. Benutzen Sie eine sterile 10 µL Einweg Schleife um mehrere einzelne Kolonien von der Platte aus Schritt 2.1 holen. Tauchen Sie die Schleife in der 50 mL Tube und waschen Sie die Algenzellen in der 20 mL autoklaviert dH₂O. Shake die 50 mL-Tube, eine homogene Mikroalgen-Lösung zu machen.
   2. 6 mL Mikroalgen-Lösung in jedem Lager Flasche mit einer sterilen serologische Pipette 10 mL Pipette. Schwenken Sie die Flasche, um die Mikroalgen in das Medium gleichmäßig zu mischen.
6. Verwenden Sie eine 2 mL sterile serologische Pipette 1 mL Proben aus jedem Lager Flasche und Transfer in sterilen 1,5 mL Röhrchen zu zeichnen.
   Hinweis: Mikropipetten sind für diesen Schritt aufgrund des Risikos einer Kontamination nicht empfohlen. Ziehen Sie die belüftete Deckel auf Vorratsflaschen.
7. Legen Sie die Vorratsflaschen auf rühren Platten (~ 150 u/min) und passen Sie Luftdurchsatz, CO₂und Beleuchtung Ebenen je nach Bedarf für die Arten an. Drehen Sie die Position der Lager Flasche jeden Tag.
8. Verdünnen Sie 1 mL-Proben während Schritt 2.6 (100-fold Verdünnung in sterilem Wasser in der Regel gut funktioniert) und Platte auf eine reiche Agar-Medium zu verbreiten.
   Hinweis: Diese Platten können verwendet werden, auf Fälle von Kontamination sowie dienen als Quelle für zukünftige Algen Inokulum für weitere Experimente zu prüfen.
9. Nehmen Sie Proben aus den Flaschen (in der BSC) alle zwei Tage, um die Mikroalgen Wachstum zu überprüfen.
   Proben in einer 96-Well-Mikrotestplatte in dreifacher Ausfertigung (200 µL) und Messen optische Dichte (OD) bei 550 nm und 680 nm alle zwei Tage bis OD erreicht 0,2-0,3 (das erfordert in der Regel 5-7 Tage).
10. Stoppen Sie die Inkubation zu und die Vorratsflaschen auf eine Sitzbank für 24-48 h um die Algenzellen sich durch die Schwerkraft zu ermöglichen.
    Hinweis: Die sesshaften Zellen werden als nächstes die Blase Spalte Photobioreaktoren impfen verwendet werden. Wenn eine schnellere Zellentnahme gewünscht wird, können Zellen bei nicht mehr als 1.000 x g Zellen gesammelt zentrifugiert.

(3) die Kultivierung von Mikroalgen in Bubble Spalte Photobioreaktoren

1. Am Vortag Bioreaktor Inokulation vorzubereiten geeignete Medien und Transfer 200 mL (oder gewünschte Lautstärke) auf die Blase Spalte Photobioreaktor Röhren (Hybridisierung Röhren). Autoklaven Rohre mit Medien und belüftete Deckel einkleben.
   Hinweis: Bei Verwendung von Abwasser als ein Wachstumsmedium, Autoklaven die leeren Bioreaktoren und abschmecken steril filtriert Abwasser (axenic Kultur ist).
2. Den sesshaften Mikroalgen bestand durch Entfernen des Überstands mit Hilfe einer Vakuumpumpe zu konzentrieren. Lassen Sie weniger als 100 mL des Mediums in jeder Flasche aber vermeiden Sie, ständige Algen entfernen.
   Hinweis: Führen Sie diese Prozedur innerhalb einer BSC und folgen Sie sterilen Technik. Eine einfache Vakuumapparatur kann mit entweder eine Thermoskanne oder Flasche konstruiert werden. Passen Sie eine sterile serologische Pipette auf das Ende des Schlauches.
3. Auszusetzen und die Algen Gülle auf steril 50 mL Zentrifuge Rohre übertragen. Zentrifugieren Sie bei 1.000 x g für 5 min weiter Algen konzentrieren.
4. Entfernen Sie in der BSC genügend überstand um ein Gesamtvolumen von ca. 80 mL Algen-Konzentrate für 12 Photobioreacters zu erreichen. Vermeiden Sie Staubsaugen, das Pellet. Die Algen-Konzentrat auf einen sterilen Behälter (oder der verwendeten Algen Lager Flasche) übertragen.
5. 6 mL Algen Gülle in jeder Photobioreaktor mit einer serologischen sterile 10-mL-Pipette hinzugeben.
6. Sterilfilter (0,2 mm Spritze oder Vakuum-Filter) und fügen Sie entsprechende Mengen an anderen Verbindungen (z. B. Vitamin Bestände) die nicht autoklaviert werden können.
7. Wirbel-Bioreaktoren Algen in das Medium zu mischen.
8. Zeichnen Sie eine 2 mL Probe von jedem Bioreaktor mit einem serologischen Pipette und Übertragung auf eine 2 mL-Tube. Sammeln Sie eine 2 mL Probe (BSC) alle 24 h um Kultur Fortschritt zu überwachen. Das Beispiel für die Verwendung von pH Teststreifen und den Reaktor nach Bedarf anpassen, mit entweder 3 M NaOH oder 3 M HCl.
9. Ziehen Sie die Bioreaktor-Deckel und legen Sie alle Bioreaktoren in der Fisch-Tank-Wasserbad. Passen Sie die Belüftung, CO₂und Beleuchtung auf die entsprechende Ebene für die Spezies. Drehen Sie die Bioreaktor-Position jeden Tag nach der Probenahme (Schritt 3.8).
10. Brunnen von einem 96 gut Mikrotestplatte 200 µL jeder Kultur Probe in dreifacher Ausfertigung zuweisen. Messen optische Dichte (OD) bei 550 nm und 680 nm.
    1. Am letzten Tag der Periode Kultur messen Sie OD unter verschiedenen Verdünnungsfaktoren (z. B. 1 X, 2 X, 4 X, 8 X, 16 X und 32 X), eine Korrelation zwischen der OD und das tatsächliche Trockengewicht nach der Ernte (Schritt 4) zu etablieren.
11. Zentrifugieren Sie das Probenröhrchen 2 mL bei 12.000 x g für 5 min.
12. Den Überstand durch 0,2 µm nicht sterile Spritze Filter filtern und speichern den überstand (und Pellet bei Bedarf) ohne über-20 ° C für langfristige Lagerung und späteren Analyse der Veränderungen in der Zusammensetzung der Medien.

4. Ernte und Gefriertrocknung von Mikroalgen Biomasse

1. Messen Sie ein bestimmtes Volumen der Algenkultur aus jedem Bioreaktor mit einem Messzylinder (z. B. 160 mL aus einem Bioreaktor, dass ursprünglich enthaltenen 200 mL Medium) und in die Zentrifuge Flaschen übertragen. Spülen Sie den Messzylinder mit dH₂O zwischen jeder Messung.
2. Zentrifuge bei 4.696 x g für 5 min. verwerfen den Überstand durch sorgfältig Absaugen es heraus.
3. Übertragen Sie die Pellets auf beschriftete 50 mL Röhrchen. Spülen Sie die Zentrifuge Flaschen mit dH₂O und Transfer Inhalt 50 mL-Tuben. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Rohr Volumen 45 mL nicht überschreitet.
4. Waschen Sie die Algen Pellets mit dH₂O Salze zu entfernen.
   1. Die 50 mL Röhrchen 4.696 x g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
   2. Jeweils 50 mL-Tube 40 mL dH₂O hinzufügen; Vortex mischen. Wieder bei 4.696 x g für 5 min Zentrifugieren und überstand verwerfen.
   3. Wiederholen Sie Schritt 4.4.2.
5. Beschriften und wiegen leer 15 mL Zentrifuge Röhren auf einem 4-dezimal-Gleichgewicht (beschriften Sie den Deckel und Schlauch und wiegen sie zusammen). Wiegen Sie eine Röhre pro Algenkultur. Wiegen Sie jedes 15 mL Röhrchen zweimal, um Fehler zu minimieren.
6. Verwerfen Sie nach der letzten Wäsche überstand, und 7,5 mL dH₂O zu jeweils 50 mL-Tube. Wirbel und Übertragung der Algen-Schlämme in der vorgewogene 15 mL Röhrchen. Spülen Sie die 50 mL Röhrchen mit zusätzlichen dH₂O und 15 mL-Tuben übertragen Sie Flüssigkeit. Vermeiden von mehr als 12 mL Gesamtvolumen in 15 mL-Tuben.
7. Zentrifugieren Sie die 15 mL Röhrchen 4.696 x g für 5 min und dekantieren Sie des Überstandes. Frieren Sie die Rohre mit Pellets bei-80 ° C für mindestens 30 min in der Vorbereitung für die Gefriertrocknung.
8. Einfrieren, trocknen über Nacht oder bis getrocknet.
9. Weigh und nimmt die gefriergetrocknete 15 mL Röhrchen mit Algen.

(5) Lipid-Extraktion mittels geändert Folch Methode²⁴

1. Wiegen Sie 20 mg gefriergetrocknetes Algenbiomasse in ein 2 mL Schraubverschluss aus Polypropylen Röhrchen (Check Hersteller Etikett um sicherzustellen, dass Produkt für Perle Extraktionen geeignet ist).
2. Jeweils 2 mL-Tube (enthält 20 mg gefriergetrockneten Algen) fügen Sie 1,5 mL Folch Lösungsmittel (2:1 Chloroform/Methanol hinzu). Gießen Sie ~0.5 mL Zirkonia/Kieselsäure Perlen (0,5 mm) in jede Röhre bis Flüssigkeitsstand im Rohr 2 mL erreicht.
   Achtung: Behandeln, Chloroform und Methanol in einer Dampfhaube und Einatmen der Dämpfe vermeiden oder Hautkontakt.
3. Homogenisieren der Algen-Proben in einer Korn-Mühle für 20 s mit einer Geschwindigkeit von 6,5 m/s-Rohrweiche zu Eis für 30 s Proben zu entspannen. Wiederholen Sie fünfmal mehr Lipide vollständig zu extrahieren.
4. Filtern Sie das Homogenat durch eine 5 mL Spritze mit einem Edelstahl-Draht Mesh Datenträger (#60 Mesh) zu belasten, die Perlen sammeln Filtrat in einem 15 mL-Tube.
5. Waschen Sie die Perlen mit 1,5 mL Folch Lösungsmittel, Flüssigkeit mit der Spritze bei Bedarf durchschieben. Wiederholen Sie diese waschen zweimal und sammeln Sie alle Filtrat in der 15 mL Tube, einem Endvolumen von ca. 6 mL nachgeben.
6. Fügen Sie 1,2 mL 0,9 % (w/V) NaCl-Lösung zu den Folch-Extrakt in der 15 mL Tube und Wirbel um gut zu mischen.
   Hinweis: Bei Bedarf kann weitere Folch Lösungsmittel Perlen (Nutzung 0,2 x total waschen Volumen von 0,9 % NaCl-Lösung induzieren Phasentrennung) Waschen verwendet werden.
7. Zentrifugieren Sie die 15 mL Röhrchen bei 6.000 x g für 5 min. Aufzeichnung der unteren Chloroform (grün) Phase Volumen auf die nächste 0,1 mL mit Linien auf der Seite der 15 mL Tube. Übertragen Sie die untere Phase zu einem Glasfläschchen (mit Deckel) mit einem Glas Pasteurpipette.
8. Speichern Sie die Lipid bei-20 ° C oder (-80 ° C Wenn es geplant ist, diesen Auszug für die Fettsäure-Analyse verwenden).

(6) Neutral Lipid-Assay mit einer Mikrotestplatte Methode (adaptiert von Higgins Et Al. 2014²²( )

1. Stammlösungen vorzubereiten. Vorbereitung 10 mL 1 mg/mL Pflanzenöl Standard in Chloroform und Lagerung bei-20 ° C.
   Hinweis: Jedes Pflanzenöl kann in diesem Test verwendet werden, da es nicht auf die Arten von Fettsäuren reagiert. 10 mL von 200 µg/mL Nil Rote Lösungin Dimethyl Sulfoxid (DMSO) vorbereiten und im Dunkeln bei Raumtemperatur lagern.
2. Vorheizen trocken Mikrotestplatte Block auf 55 ° C in einer Dampfhaube. Während dieser Heizung ist, verdünnen Sie die Lipid-Extrakte und Pflanzenöl standard 3-Fach mit Methanol.
   Hinweis: Diese Verdünnung kann geändert werden, basierend auf der Lipidgehalt der Algen, aber dieses Niveau eignet sich gut für die meisten Chlorella.
3. Fügen Sie für jede verdünnte Probe 80 µL einer 96 gut Polypropylen Mikrotestplatte in vervierfacht hinzu.
   Achtung: Verwendung von Polystyrol Plasticware empfiehlt sich nicht für die Verwendung mit organischen Lösungsmitteln.
4. Beantragen Sie das Lösungsmittel leer 80 µL 2:1 Methanol/Chloroform in vervierfacht. Fügen Sie für Standards 10, 30, 60, 90 und 120 µL des verdünnten Pflanzenöls standard in vervierfacht.
5. Legen Sie die Mikrotestplatte in eine trockene Block Heizung bei 55 ° C für 20-30 min, bis alle Lösungsmittel verdunstet ist. Während das Lösungsmittel verdampft, bereiten die Arbeiten Nile Red Lösung (Notwendigkeit 200 µL 1 µg/ml Lösung pro Platte gut). Als Beispiel erfordert zwölf Proben und eine ganze Reihe von Normen 16 mL 1,0 µg/mL Lösung; durch Auflösen der Bestand von 200 µg/mL (in DMSO) 80 µL in 16 mL dH₂O. vorbereiten
6. Entfernen Sie die Mikrotestplatte vom Heizblock und lassen Sie auf Raumtemperatur abkühlen. 30 µL Isopropanol in jede Vertiefung und Mischen von Pipettieren rauf und runter. Sicherzustellen, dass alle Pipette Kanäle mischen der Lösung und resuspending die Lipide, die eine homogene grüne Flüssigkeit nachgeben.
7. Fügen Sie 200 µL Nil rot-Lösung (1 µg/mL), jeweils gut pipette, oben/unten 10 Mal zu mischen. Inkubieren Sie die Platte für 5 min bei Raumtemperatur. Während des Wartens, bereiten Sie eine 50 % Bleichmittel-Lösung durch Mischen Bleichmittel (6 % Hypochlorit) mit dH₂O. 20 µL pro Bohrloch sind erforderlich. Vorbereitung von 3 mL 50 % Bleichmittel ist ausreichend für 12 Proben und eine ganze Reihe von Normen.
8. Gut jeder Mikrotestplatte 20 µL Bleichmittel-Lösung hinzu und pipette rauf und runter 5 mal gut mischen. Inkubieren Sie 30 min bei Raumtemperatur.
9. Nach 30 min lesen Fluoreszenz in den Proben alle 5-10 min bei 530 nm Anregung/575 nm Emission mit Auto Cut-off setzen auf 570 nm bis das Signal aus Algen Proben stabilisiert hat. 60 min der gesamten Inkubation ist in der Regel ausreichend.
10. Erstellen einer Kalibrierkurve für den Pflanzenöl-Standards (im Bereich von 0-40 ng/Ölquelle).
    Hinweis: Eine lineare passen eignet sich gut für niedrige (< 30 ng/Well) Öl-Konzentrationen und ein Polynom passen können verwendet werden, wenn der Standard 30 ng/Well übersteigt. Verwenden Sie diese Korrelation, um die neutralere Lipid in der Probe-Brunnen zu quantifizieren.

Ergebnisse

Diese Prozedur ergibt einen zeitlichen Verlauf der Algen optische Dichte Daten bei OD 550 nm (Abb. 4A). Die optische Dichte und Trockengewicht Konzentration Daten korreliert (Abbildung 4 b). Dies wird erreicht durch die erste Berechnung der endgültigen Trockengewicht Algen Konzentration nach der Gefriertrocknung Schritt. Als nächstes kann die optische Dichte der Kultur serielle Verdünnung (durchgeführt am letzten Tag der Prob...

Diskussion

Die wichtigste Überlegung bei der Kultivierung von Algen ist ein Verständnis für die spezifischen Bedürfnisse des Organismus oder der Gruppe von Organismen. Die Algen Anbausystem hier beschriebenen kann verwendet werden, um eine breite Palette von Algen aber die spezifischen abiotischen Faktoren (Temperatur, Medien, pH-Wert, Lichtintensität, CO_-2 -Ebene, Belüftung Rate) Kultur auf die Bedürfnisse des Organismus angepasst werden müssen. Hinweis: die hier beschriebenen Parameter für den Anbau von Ch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies for airlift photobioreactor setup
1 L Pyrex bottles	Corning	16157-191	For bottle reactors, humidifiers
1/2" hose clamp	Home Depot	UC953A	or equivalent
1/4" female luer to barb	Nordson biomedical	Nordson FTLL360-6005	1/4" ID, PP
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubing	Thermo-Nalgene	63013-244	50'
1/4" in O-rings	Grainger	1REC5	#010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D.
1/8" Female luer to barb	Nordson biomedical	FTLL230-6005
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubing	Thermo-Nalgene	63013-608	250'
1/8" male spinning luer to barb	Nordson biomedical	MLRL013-6005
1/8" multiport barb	Nordson biomedical	4PLL230-6005	1/8" multiport barb
1/8" NPT to barb	Nordson biomedical	18230-6005	1/8" 200 series barb
1/8" panel mount luer	Nordson biomedical	Nordson MLRLB230-6005	1/8", PP
10 gallon fish tank	Walmart	802262	Can hold up to 8 bioreactors depending on layout
100-1000 ccm flow meter	Dwyer	RMA-13-SSV	For bottle reactors
2 ft fluorescent light bank	Agrobrite	FLT24 T5
200-2500 ccm flow meter	Dwyer	RMA-14-SSV	For air regulation upstream of humidifier
250 mL Pyrex bottles	Corning	16157-136	For gas mixing after humidifier
50-500 ccm flow meter	Dwyer	RMA-12-SSV	For hybridization tube reactors
5-50 ccm flow meter	Dwyer	RMA-151-SSV	For CO2 flow rate control
Air filters 0.2 µm	Whatman/ Fisher	09-745-1A	Polyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack
Check valves	VWR	89094-714
Corning lids for pyrex bottles	VWR	89000-233	10 GL45 lids
Female luer endcap	Nordson biomedical	Nordson FTLLP-6005	Female stable PP
Hybridization tubes	Corning	32645-030	35x300 mm, pack of 2
Light timer	Walmart	556393626
Locknuts	Nordson biomedical	Nordson LNS-3	1/4", red nylon
Low profile magnetic stirrer	VWR	10153-690	Low profile magnetic stirrer
Male luer endcap	Nordson biomedical	Nordson LP4-6005	Male plug PP
Spinning luer lock ring	Nordson biomedical	Nordson FSLLR-6005
Stir bars - long	VWR	58949-040	38.1 mm, for bottle reactors
Stir bars - medium	VWR	58949-034	25 mm, for hyridization tubes
Supplies and reagents for culturing algae
0.2 µm filters	VWR	28145-491	13 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling
1 mL syringes	Air-tite	89215-216	For filtering spent media from daily culture sampling
1.5 mL tubes	VWR	87003-294	Sterile (or equivalent)
10 mL Serological pipettes	Greiner Bio-One	82050-482	Sterile (or equivalent)
100 mm plates	VWR	25384-342	100x15 mm stackable petri dishes, sterile
15 mL tubes	Greiner Bio-One	82050-276	Sterile (or equivalent), polypropylene
2 mL Serological pipette tips	Greiner Bio-One	82051-584	Sterile (or equivalent)
2 mL tubes	VWR	87003-298	Sterile (or equivalent)
50 mL tubes	Greiner Bio-One	82050-348	Sterile (or equivalent), polypropylene
96 well microplate	Greiner Bio-One	89089-578	Polystyrene with lid, flat bottom
Inocculating loops	VWR	80094-478	Sterile (or equivalent)
Liquid carbon dioxide tank and regulator	Airgas	CD-50
Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay
2 mL bead tubes	VWR	10158-556	Polypropylene tube w/ lid
96 well microplates	Greiner Bio-One	82050-774	Polypropylene, flat bottom
Bleach	Walmart	550646751	Only use regular bleach, not cleaning bleach
Chloroform	BDH	BDH1109-4LG
Dimethyl sulfoxide	BDH	BDH1115-1LP
Isopropyl alcohol	BDH	BDH1133-1LP
Methanol	BDH	BDH20864.400
Nile red	VWR	TCN0659-5G
Pasteur pipette tips	VWR	14673-010
Sodium chloride	BDH	BDH9286-500G
Vegetable oil	Walmart	9276383	Any vegetable oil should work as long as it is fresh
Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter)	Biospec products	11079105z
Equipment
Analytical balance	Mettler-Toledo	XS205DU	Capable of at least 4 decimal accuracy
Bead homogenizer	Omni	19-040E
Benchtop micro centrifuge	Thermo	Heraeus Fresco 21 with 24x2	Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes
Dry block heater	VWR	75838-282	Including dry block for a microplate
Freeze dryer	Labconco	7670520	2.5L freeze drying system
Large benchtop centrifuge	Thermo	Heraeus Megafuge 16R Tissue	Including rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax M2	Capable of reading absorbance and fluorescence
Vortex mixer	VWR	10153-838