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요약

여기, 우리 실험실 규모 거품 열 photobioreactors를 생성 하 고 문화 microalgae를 그들을 사용 하 여 프로토콜을 제시. 그것은 또한 문화 성장 율 및 중립 지질 내용에 대 한 메서드를 제공합니다.

초록

Microalgae 바이오 연료, 고부가가치 제품의 생산 등 엔지니어링 응용 프로그램에 대 한 및 폐기물의 처리를 위해의 연구에 상당한 관심이 있다. 대부분 새로운 연구 노력 실험실 규모에서 시작, 재현 방식에서 microalgae 재배에 대 한 비용 효과적인 방법에 대 한 필요가 있다. 여기, 우리 교통 문화 microalgae 실험실 규모 photobioreactors, 그리고 그 조류의 성장 내용과 중립 지질을 측정 하는 효과적인 접근 한다. 지침은 photobioreactor 시스템을 설정 하는 방법에 포함 됩니다. 예제에서는 생물 클로렐라 와 Auxenochlorella의 종 있지만,이 시스템 미세, 비 조류 종의 조류의 공동 문화를 포함 한 넓은 범위를 육성 하기 위해 적응 수 있다. 재고 문화 처음 inoculum photobioreactor 시스템을 생산 하는 병에서 성장 된다. 조류 inoculum 집중 이며 일괄 처리 모드에서 재배에 대 한 photobioreactors로 전송 합니다. 샘플은 광학 밀도 판독을 매일 수집 됩니다. 배치 문화의 끝에, 셀, 원심 분리기에 의해 수확 하 고 동결 건조는 최종 건조 중량 농도를. 최종 건조 중량 농도 광학 밀도 건조 중량 농도 사이의 상관 관계를 생성 하는 데 사용 됩니다. 수정된 Folch 메서드는 이후에 동결된 바이오 매스에서 총 지질을 추출 하 고 추출 microplate 분석 결과 사용 하 여 중립 지질 내용 분석. 이 분석 결과 이전에 게시 되었습니다 하지만 프로토콜 단계 오류가 자주 발생 하는 절차의 중요 한 단계를 강조 하기 위해 여기 포함 됐다. 여기에 설명 된 생물 반응 기 시스템 간단한 플라스 크 및 상업 bioreactors 완벽 하 게 제어 사이의 틈새 시장을 채웁니다. 치료 당도 3-4 생물 복제, 우리의 접근 방식 조류 배양 성장 및 지질 분석 실험에 꽉 표준 편차를 리드.

서문

미세 공학 및 생명 공학에서의 응용 프로그램은 최근 몇 년 동안에 큰 관심을 모으고 있다. Microalgae 폐수 처리1,2,3,4, 바이오 연료 생산5,6,7,8, 사용을 위해 공부 되 고 있다 그리고 영양 보충 식품 및 다른 높은 가치 제품9,10의 생산. 조류는 또한 유전자 수정 중인 큰 속도로 특정 엔지니어링 응용 프로그램11,12에 대 한 그들의 적합성을 향상 하기 위해 따라서, 제어 설정에서 산업으로 관련 유기 체를 가진 실험에 큰 관심이입니다. 이 방법의 목적은 문화 미세 제어 실험실 환경에서 효과적인 접근을 의사 소통을 하 고 측정할 성장과 그 조류의 중립 지질 내용. 성장을 향상 속도 중립 지질 콘텐츠 미세 조류 바이오 연료13의 상용화를 향해 두 주요 병목 확인 되었습니다.

다양 한 접근 문화 조류 실험적인 목적을 위해 사용 되었습니다. 일반적으로 이러한 방법은 대규모 야외 재배 및 소규모 실내 재배 사이 나눌 수 있습니다. Photobioreactors와 오픈 연못에 야외 재배 실험 실험실 규모 (예를 들어, 조류의 새로운 하이-지질 긴장의 스케일-업 테스트)에서 이미 입증 된 프로세스를 확장 하기 위한 위해 적합 하다14. 그러나, 실내 소규모 재배 적합 한 새로운 또는 향상 된 조류 종자를 개발 하는 경우 또는 생물 학적 메커니즘을 이해 하기 위한 실험을 수행. 이 후자의 경우에서 실험 제어의 높은 학위 생물 학적 행동에 미묘한 변화 애타게 필요 합니다. 이 위해, axenic 문화 종종 필연적으로 대규모 야외 시스템에서 성장 하는 다른 생물 (예: 박테리아, 다른 조류)와 관련 된 복잡 한 생물 요소를 최소화 하기 위해 필요 합니다. 조류와 다른 유기 체 사이 상호 작용을 공부 하는 경우에 우리 생물15,,1617간의 분자 교류를 조사할 때 높은 제어 실험 조건의 사용 유용 하는 것이 나타났습니다.

소규모 실내 조류 재배의 범주 내에서 다양 한 접근은 사용 되었다. 아마도 가장 일반적인 방법은 빛 은행18,19아래 통 테이블에 삼각 플라스 크에 조류를 성장 하는 것입니다. 산소와 CO2 의 교환 플라스 크의 상단에 있는 거품 플러그를 통해 수동 확산에 의해 일어난다. 일부 연구 자들은이 설정 플라스 크20의 활성 폭 기를 통해 향상 되었습니다. 다른 방법은 병, 저 어 바와 활성 폭 기 혼합에 조류를 배양 하는 것입니다. 그들의 단순에도 불구 하 고 우리는 플라스 크 및 병의 사용 수시로 이끌어 생물 복제 간의 일관성 없는 결과 것으로 나타났습니다. 아마도 이것은 위치 효과-다른 위치로 받을 또한 반응 기 내부 온도 영향을 미치는 다른 양의 빛. 새로운 위치로 원자로의 매일 회전 수 있지만 있기 때문에 문제를 완화 하지 않습니다 조류 성장의 특정 단계 (예를 들어, 초기 지 수) 다른 사람 (예를 들어, 로그 단계) 보다 위치 효과에 더 민감한.

기술적 정교의 스펙트럼의 반대 측에 완벽 하 게 통제 상업 photobioreactors가 있습니다. 이러한 시스템은 지속적으로 모니터링 하 고 조정 조류 성장을 최적화 하는 원자로. 그들은 실시간 온도 제어, 프로그래밍 가능한 조명과 pH 제어 했습니다. 불행히도, 그들은 비싼 그리고 일반적으로 반응 기 당 몇 천 달러를 비용. 가장 과학적이 고 공학 저널 생물 복제의 결과, 여러 bioreactors의 구매 필요로 필요 합니다. 우리는 현재 여기 거품 열 원자로 시스템 연구소 규모 조류 재배에 대 한 접근 (플라스 크) 간단 하 고 정교한 완전 제어 (bioreactor) 사이 분할을 다리. 거품 열 가스 거품 상승 가스 교류를 촉진 하 여 원자로 혼합 사용 합니다. 이 이렇게 어느 정도의 조명 및 온도 제어를 제공 하지만 비용 효과적인 방법으로 이렇게 한다. 또한, 우리 생물 복제 플라스 크 또는 병 접근에 비해 통계적으로 유의 한 결과 얻기 위해 필요한 필요한 수를 줄여이 시스템 생물학 복제 중 매우 일관 된 결과 얻을 수를 발견 했다. 우리는 또한 성공적으로 조류와 박테리아21의 혼합물을 육성 하기 위해이 시스템을 사용. 조류 재배 뿐만 아니라 우리 경작된 해 조류에 중성 지질 함량을 측정 하는 절차를 개설 한다. 후자의 방법은 되었습니다22, 다른 곳에서 출판 하지만 우리가 성공적으로 그것을 사용 하는 방법에 대 한 단계별 지침을 제공 하기 위해 여기 절차를 포함.

프로토콜

1입니다. 거품 열 Photobioreactors의 설치

  1. 1 리터 유리병과 교 잡 튜브 (회로도 및 사진 그림 1 참조)와 함께 제공 된 플라스틱 뚜껑에서 환풍구 뚜껑의 집합을 생성 합니다. 가습기, 트랩, 각 공기 리프트 photobioreactor와 각 병 원자로 뚜껑을 생성 합니다.
    1. ¼"뚜껑에 구멍을 드릴: 2 구멍에 필요한 생물 반응 기 및 가습기 뚜껑; 3 구멍 혼합 함정에 필요 합니다.
    2. 슬립 한 ¼"o-링을 스레드에 1/8" 패널 마운트 Luer 피팅의 그리고 뚜껑 (그림 1A)에 교 련된 구멍 ¼"에 이것을 슬라이드.
    3. 슬립 한 두 번째 ¼"o-링을 스레드에 뚜껑은 두 개의 오-링 사이 끼여. 스레드에 로크 슬립 하 고 자리에 패널 마운트 루어를 해결 하기 위해 강화.
    4. 잠금 고리는 노출 남성 Luer 투영에서 뚜껑에 스냅 합니다. 뚜껑에 각 구멍을 위한 1.1.2-1.1.4 단계를 반복 합니다.
    5. 뚜껑 거품 열 병 원자로에 사용할 연결 1/8"에 대 한 1.5" 바 브 피팅 하 여성 루어 1/8"ID PVC 튜브의 조각. 이러한 각각의 뚜껑에 노출된 남성 Luer 피팅 연결 합니다.
    6. 체크 밸브 (뚜껑 멀리 가리키는) 중 1/8"의 무료 끝 연결 조각.
      참고: 이것은 생물에 대 한 배기 포트 될 것입니다.
    7. 남성 Luer 바바라 1/8"튜빙 뚜껑에서 예상의 두 번째 부분을 연결 합니다. 제자리 회전 잠금 링을 클릭 하 고이 0.2 m m 공기 필터를 고정 시킵니다.
      참고:이 입구 포트는 원자로 대 한 될 것입니다.

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그림 1입니다. 회로도 및 사진 bioreactors 건설에 대 한 는 생물의 건설에 대 한 개략도 (A) 뚜껑 조립된 생물 뚜껑의 (B) 사진 및 사용 하는 가습기 조립된 뚜껑의 (C) 사진. 참고 가습기 피팅 뚜껑으로 밀폐 봉인 되도록 방수 실리콘에 코팅 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 공기 전달 시스템 조립 (회로도 및 사진에 대 한 그림 2A 및 2B 참조).
    1. 1/8"NPT 스레드 바 브 피팅 후미 및 각 rotameter의 뒤에 콘센트에 연결 합니다.
      참고: 200-2500 cm3/min rotameters는 가습기의 상류 공기 압력 변조에 대 한, 100-1000 cm3/min rotameters는 병 원자로, 50-500 c m3/분 rotameters 공기 리프트 생물 반응 기, 및 5-50 cm3/ 최소 rotemeters CO2 흐름 규칙에 대 한 있습니다. 마운트 rotameters 고정된 표면 (예: 플라스틱 시트)를 하는 것이 좋습니다 그래서 그들은 작업 중 떨어지지 않는다.
    2. 압축 공기 소스에서 입 하 다음 호스 클램프와 압축 공기 소스 ¼"ID 유연한 PVC 튜브를 연결. 1/8 "는 ¼" 바 브 피팅 및 1/8"바 브 피팅 남성 여성을 사용 하 여 ID PVC 유연한 튜브 호스 직경을 사임.
    3. 200-2500 cm3/min rotameter의 입구를 1/8"ID 튜빙의 자유로운 끝을 연결 합니다.
      참고:이 rotameter 콘센트 가습기 병 1/8"ID 배관 통해 공급 합니다.
    4. 1/8"환풍구 뚜껑 (연결을 운동 하는 여성 루어 사용)에 입구에 튜브 연결 합니다. 두 번째 조각의 1/8"패널 마운트 안쪽 튜브 연결 피팅.
      참고:이 작품 것 이다 아래로 가습기 물을 통해 거품 공기에 만요.
    5. 첨부 1/8"피팅 1/8" ID 튜브의 각 끝에 밥이 조각을 사용 하 여 혼합 트랩의 입구에는 가습기의 콘센트를 연결 하 여 루어.
    6. 1.2.5로 같은 방식으로, CO2 레 귤 레이 터의 콘센트 혼합 함정에 두 번째 포트에 연결 합니다.
    7. 구성 사용 하 여 1/8"매니폴드 배관 및 1/8" 멀티 포트 바바라 rotameter 은행에 공기를 공급을 (참조 그림 2 C).
      참고: 이러한 rotameters는 생물 반응 기 공급 사용 됩니다. 시리즈에서 6 개 이상의 rotameters 구성 하지 마십시오. 대신, rotameters의 병렬 은행을 사용 하 여 시스템을 확장. 모든 원자로 대 한 전체 흐름 수요 2500 cm3/min 미만 확인 (또는 다른 더 큰 rotameter 필요 하 게 됩니다는 가습기의 업스트림).
    8. 1/8"튜빙 및 1/8" 여성 바바라 루어를 사용 하 여 새로 생성 된 rotameter 은행에 혼합의 콘센트 (3rd 포트)를 연결 합니다.
    9. 충분히 긴 1/8"는 생물 반응 기에 공기 공급을 rotameter 은행에 각 rotameter의 출구에 튜브 연결 합니다. 은행에 rotameters 튜브의 끝에 레이블을 지정 합니다.
    10. 물-증거 실리콘 모든 포트 주위는 가습기와 혼합 되도록 그들은 공기가 꽉 트랩 뚜껑에 적용 됩니다.

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그림 2입니다. 회로도 및 조립 거품 열 시스템에 대 한 사진 (A) 회로도 가습기의 통 기 통풍 시스템 (B) 사진 함정, 그리고 rotameter 은행, 및 (C) 사진 rotameter 은행을 함께 연결 하는 데 사용 하는 매니폴드의 혼합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 물고기 탱크, 접시, 그리고 빛 (그림 3)를 저 어.
    주의:이 시스템 및 모든 구성 요소를 지 원하는 충분 한 회로 용량의 많은 수를 요구 한다. 모인 함께 여러 개의 전원 스트립 및 확장 코드 데이지-체인 방식 전기 위험 때문에 하지 마십시오. GFI 타입 콘센트와 멀티탭의 사용은 시스템에 매우 권장 물의 존재 때문 이다.
    1. 로우 프로 파일 자석 교 반기 물 가득한 물고기 탱크의 무게를 충분히 강한 평면에 정렬 합니다.
    2. 작은 나무 또는 플라스틱 블록 (저 접시 보다 약간 키가) 둘레에 물고기 탱크의 무게를 지원 하기 위해 저 어 접시의 장소.
      주의: 무게는 그들을 짝사랑으로 볶음 판에 직접 물고기 탱크를 배치 하지 마십시오.
    3. 저 어 접시에 놓고 물고기 탱크 블록을 지원 하 고 물으로 탱크를 채우기.
    4. 뚜껑으로 생선 탱크 위에 맞게 뻣 뻣 한 플라스틱 시트의 한 조각 잘라. 밖으로 교 잡 튜브 슬라이드이 커버에 구멍을 절단. 또한 물고기 탱크 히터에 대 한 구멍을 잘라.
    5. 물고기 탱크는 bioreactors의 가로 조명을 제공 옆 형광 빛 은행을 정렬 합니다. 일 또는 밤 주기를 설정 하는 가벼운 타이머 빛 은행을 연결 합니다.

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그림 3입니다. 시스템 회로도 병 생물 반응 기 (왼쪽)와 거품 열 photobioreactors (오른쪽)에 대 한. 이 그림에서 히 긴 스 외. 수정 되었습니다. 17. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2입니다. 미세 Inoculum의 준비

  1. 곳을 알아내는 보존, 도금, 또는 액체 문화에서 microalgae inoculum을 가져옵니다.
    참고: inoculum 세포가 가능한 고 결과 문화는 axenic로 사용 하기 전에 cryopreserved 유기 체를 도금 하는 것이 좋습니다. 한 천 매체 (예., ATCC #5 천 sporulating)21 cryo-스토리지에서 클로렐라 와 Auxenochlorella 의 종을 살리기 위해 잘 작동 하는 풍부한 매체입니다.
  2. 특정 미세 종족에 대 한 적합 한 미네랄 매체의 2.4 L를 준비 합니다.
    참고: 예로 N8 중간23 클로렐라, N8-NH4 중간21 Auxenochlorella의 종 종 있습니다. 조류 스트레인에 대 한 적절 한 매체의 사용으로 강력한 조류 성장을 보장 가장 중요 한 단계 중 하나입니다.
  3. 3 1 리터 유리병에 동등 하 게 미네랄 매체의 aliquot 2.4 L 각 병에 대 한 각 병 바 저 어 고 발명된 뚜껑 (그림 1)를 추가 합니다. 통 기 통풍 관 입구 쪽에 각 병은 재확인에 저 어 바가 있다.
  4. 고압 액체 살 균을 사용 하 여 주식 병 나중 도금에 사용 될 것입니다 동시에 이온된 수 (dH2O)와 일부 1.5 mL 튜브의 30 분 압력솥 100 ml (121 ° C)를 주기. 멋진 하룻밤 매체를 허용 합니다. 또는 실내 온도에 반응 기를 냉각 하 고 접종 전에 2 h에 대 한 다음 공기에 쐬 십시오.
  5. biosafety 내각 (BSC)에 접시 또는 axenic 액체 문화에서 미세 사진 병으로 예방. 다음 단계에서 axenic 문화를 유지 하기 위해 무 균 기술을 사용 합니다.
    1. 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브에 압력가 dH2O의 20 mL를 추가 합니다. 살 균 10 µ L 일회용 루프를 사용 하 여 단계 2.1에서에서 접시에서 여러 단일 식민지를 선택. 50 mL 튜브에 루프와 조류 세포 압력가 dH2균일 미세 솔루션 O. 동요 50 mL 튜브의 20 mL로 씻고.
    2. 10 mL 살 균 혈 청 학적인 피 펫으로 각 사진 병으로 미세 솔루션의 6 mL를 플라스틱. 매체에 있는 미세 균등 하 게 혼합 병을 소용돌이 친다.
  6. 2 mL 살 균 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 살 균 1.5 mL 튜브에 1 mL 샘플 각 주식 병 및 전송에서 그리는.
    참고: Micropipettes는 오염의 위험 때문에이 단계에 대 한 권장 하지 않습니다. 주식 병에 환풍구 뚜껑을 조입니다.
  7. 저 어 접시 (~ 150 rpm)에 주식 병을 놓고 공기 유량, CO2, 그리고 종족에 대 한 적절 한 조명 레벨을 조정 합니다. 매일 주식 병 위치를 회전 합니다.
  8. 2.6 단계 얻은 1ml 샘플 희석 (살 균 물에 100 희석 일반적으로 잘 작동) 다양 한 매체에 플레이트를 확산.
    참고:이 접시는 오염의 인스턴스 뿐만 위한 미래 조류 inoculum의 근원으로 봉사 하는으로 추가 실험 검사 하 사용할 수 있습니다.
  9. 걸릴 샘플 (BSC)에 병에서 매 2 일 미세 성장 확인.
    샘플 3 (200 µ L) 중에서 96 잘 microplate에 놓고 측정 광학 밀도 (OD) 550 nm와 680 nm OD까지 매 2 일에 도달 0.2-0.3 (요구 하는 일반적으로 5-7 일).
  10. 부 화를 중지 하 고 중력에 의해 정착 조류 셀 수 있도록 24-48 h에 대 한 벤치에 재고 병을 놓습니다.
    참고: 정착된 세포 거품 열 photobioreactors 접종에 다음 사용할 수 것입니다. 더 빠른 셀 컬렉션을 원하는 경우 셀 셀 수집을 더 이상 1000 x g에 centrifuged 수 있습니다.

3. 미세 거품 열 Photobioreactors에서의 재배

  1. 생물 접종 전날 적절 한 미디어를 준비 하 고 전송 200 mL (또는 원하는 볼륨) 거품 열 photobioreactor 하 관 (교 잡 튜브). 고압 튜브 미디어와 장소에서 환풍구 뚜껑.
    참고: 성장 매체, 오토 클레이 브 빈으로 폐수를 사용 하는 경우 생물 반응 기 (axenic 문화는 원하는 경우) 살 균 필터링 폐수를 추가.
  2. 진공 펌프를 사용 하 여 상쾌한 제거 하 여 정착된 microalgae 주식을 집중 한다. 각 병에 100ml 미만 매체를 떠나 하지만 정착된 조류를 제거 하지 마십시오.
    참고: BSC 내부이 절차를 수행 하 고 메 마른 기술에 따라. 진공 플라스 크 또는 병을 사용 하 여 간단한 진공 장치를 구성할 수 있습니다. 튜브의 끝에 살 균 혈 청 학적인 피 펫에 맞는.
  3. 일시 중단 하 고 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브 조류 슬러리 전송. 5 분 더 1000 x g에서 원심 분리기 조류 집중.
  4. BSC, 12 photobioreacters에 대 한 조류 집중의 ~ 80 mL의 총 볼륨을 달성 하기 위해 충분 한 상쾌한 제거. 펠 릿 밖으로 진공 청소기로 청소 하지 마십시오. 살 균 컨테이너 (또는 사용된 조류 재고 병) 조류 집중을 전송 합니다.
  5. 살 균 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 각 photobioreactor에 조류 슬러리의 6 mL를 추가 합니다.
  6. 살 균 필터 (0.2 m m 주사기 나 진공 필터) 및 어떤 다른 화합물 (예: 비타민 주식) 압력가 마로 소독 될 수 없습니다의 적절 한 금액을 추가.
  7. 매체에 조류를 섞어 bioreactors를 소용돌이 친다.
  8. 혈 청 학적인 피 펫 및 전송 2 mL 튜브를 사용 하 여 각 생물에서 2 mL 샘플을 그립니다. 문화 진행 상황을 모니터링할 모든 24 h 2 mL 샘플 (BSC)에 수집 합니다. 전화를 사용 하 여 샘플 테스트 스트립을 확인 하 고 M NaOH 또는 3 M HCl 중 3 필요에 따라 원자로 조정 합니다.
  9. 생물 반응 기 뚜껑을 강화 고 모든 bioreactors 물고기 탱크 물 목욕 합니다. 폭 기, CO2, 그리고 조명 종족에 대 한 적절 한 수준으로 조정 합니다. 회전 생물 반응 기 위치 (단계 3.8)를 샘플링 후 매일.
  10. 3 중에서 각 문화 샘플의 200 µ L 96 잘 microplate의 웰 스에 적용 됩니다. 광학 밀도 (OD)를 측정 하는 550 nm와 680 nm.
    1. 문화 시대의 마지막 날, 다른 희석 요인 (예를 들어, 1 x 2 배, 4 x, 8 배속, 16 배속, 32 x) 수확 (4 단계) 후 마약과 실제 건조 중량 사이의 상관 관계를 설정 하에서 OD를 측정 합니다.
  11. 5 분 동안 12000 x g에 2ml 샘플 튜브 원심
  12. 상쾌한 0.2 µ m 비 멸 균 주사기 필터를 통해 필터링 하 고 상쾌한 (및 필요한 경우 펠 릿) 없이 저장 장기 저장 및 미디어 구성에 변화의 나중 분석-20 ° C 보다 더 높은.

4. 수확 및 Microalgal 바이오 매스의 건조 동결

  1. 졸업된 실린더 (예를 들어, 생물 매체의 그 원래 포함 된 200 mL에서에서 160 mL)와 각 생물에서 조류 문화의 고정된 볼륨을 측정 하 고 원심 병으로 전송. DH2O 각 측정 사이 졸업된 실린더 린스.
  2. 5 분에 대 한 4,696 x g에서 원심 분리기는 신중 하 게 그것을 밖으로 진공 청소기로 상쾌한을 삭제 합니다.
  3. 레이블이 50 mL 튜브에 펠 릿을 전송 합니다. DH2O, 원심 분리기 병 및 전송 내용 50 mL 튜브에 린스. 총 관 볼륨 45 mL를 초과 하지 않는 확인 하십시오.
  4. DH2O 소금 제거 조류 펠 릿을 세척.
    1. 5 분 동안 4,696 x g에서 50 mL 튜브 원심 고는 상쾌한 삭제.
    2. 각 50 mL 튜브; 40 mL dH2O 추가 소용돌이를 섞어입니다. 다시 5 분 동안 4,696 x g에서 원심 하 고 상쾌한 삭제.
    3. 4.4.2 단계를 다시 반복 합니다.
  5. 레이블 및 빈 15 mL 원심 분리기 튜브 4 소수 균형에 무게 (뚜껑 및 튜브와 함께 그들을 무게). 조류 문화 당 하나의 튜브 무게. 오류를 최소화 하기 위해 두 번 각 15 mL 튜브 무게.
  6. 마지막 세척 후 상쾌한, 삭제 하 고 각 50 mL 튜브에 dH2O의 7.5 mL를 추가 합니다. 소용돌이 전송 사전 무게 15 mL에 조류 슬러리 튜브 합니다. 추가 dH2O 50 mL 튜브를 헹 구 고 15 mL 튜브에 액체를 전송. 15 mL 튜브에 총 볼륨의 12 mL을 초과 하지 마십시오.
  7. 5 분 동안 4,696 x g에서 15 mL 튜브 원심 고는 상쾌한 가만히 따르다. 적어도 30 분 동결에 대 한 준비-80 ° C에서 펠 릿으로 튜브를 고정 합니다.
  8. 동결 건조 하룻밤 또는 건조 될 때까지.
  9. 무게와 조류와 동결 건조 15 mL 튜브를 기록.

5. 지질 추출은 Folch 수정 방법24 를 사용 하 여

  1. 2 mL 나사 모자 폴 리 프로필 렌 관 (비드 기사에 대 한 적합 한 제품 인지 확인 제조 업체 라벨)으로 동결된 조류 바이오 매스의 20 밀리 그램을 무게.
  2. 각 2 mL 튜브 (동결된 조류의 20 밀리 그램을 포함)를 Folch 용 매 (2:1 클로 프롬/메탄올)의 1.5 mL를 추가 합니다. ~0.5 mL 지 르 코니 아/실리 카 구슬 (0.5 m m)에 붓고 각 튜브 튜브에 액체 수준 2 mL에 도달할 때까지.
    주의: 및 가스를 호흡 하지 않도록 또는 접촉 피부 클로 프롬 및 메탄올 증기 두건에서 처리할.
  3. 20 대 한 비드 밀 조류 샘플 균질 s 30에 대 한 얼음 6.5 m/s의 전송 튜브의 속도로 샘플 진정 s. 완전히 추출 지질을 5 회 반복 합니다.
  4. 스테인레스 스틸 와이어 메쉬 디스크 (#60 메쉬) 15 mL 튜브에는 filtrate 수집 구슬 밖으로 긴장을 포함 5 mL 주사기를 통해는 homogenate를 필터링 합니다.
  5. 필요한 만큼 주사기를 통해 액체를 밀어 Folch 매의 1.5 mL와 구슬 워시. 이 세척 두 번 더 반복 하 고 약 6 mL의 최종 볼륨을 저조한 15 mL 튜브에 모든 filtrate 수집.
  6. 0.9% (w/v) NaCl 솔루션 15 mL 튜브에 Folch 추출 하 고 잘 혼합 하는 소용돌이의 1.2 mL를 추가 합니다.
    참고: 지금까지 필요한 경우에 더 많은 Folch 솔벤트 구슬 (0.9 %NaCl 솔루션 단계 분리를 유도 하는 것의 총 세척 볼륨 x 0.2 사용)를 씻어 사용할 수 있습니다.
  7. 5 분 레코드를 가장 가까운 0.1 mL 15 mL 튜브의 측면 라인을 사용 하 여 하단 클로 프롬 (녹색) 단계 볼륨에 대 한 6000 x g에서 15 mL 튜브 원심 (뚜껑)와 유리 유리병에 하단 단계 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 전송 합니다.
  8. -20 ° C 또는 (경우이 추출 지방산 분석을 위해 사용 하는 계획이 있다 ° C-80) 지질을 저장 합니다.

6. 중립 지질 분석 결과 Microplate 메서드를 사용 하 여 (히 긴 스 외. 201422) 에서 적응

  1. 재고 솔루션을 준비 합니다. 클로 프롬에 10 mL 1 mg/mL 식물성 기름 표준을 준비 하 고-20 ° c.에 저장
    참고: 모든 식물성 기름 지방산의 종류를 구분 하지 않습니다 때문에이 분석 결과에 사용할 수 있습니다. 200 µ g/ml 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 나 일 레드 솔루션 10 mL를 준비 하 고 실 온에서 어둠 속에 저장.
  2. 증기 두건에서 55 ° C로 전 열 건조 microplate 블록. 이것은 열 하는 동안 희석 지질 추출 물과 식물성 기름 표준 3-fold와 메탄올.
    참고:이 희석, 조류의 지질 내용에 따라 변경 될 수 있습니다 하지만이 수준 대부분 클로렐라를 위해 잘 작동 합니다.
  3. 각 희석 샘플 quadruplicate에서 96 잘 폴 리 프로필 렌 microplate에 80 µ L를 추가 합니다.
    주의: 폴리스 티 렌 plasticware의 사용 유기 용 매와 함께 사용 하지 않는 좋습니다.
  4. 빈 용 매에 대 한 2:1 메탄올/quadruplicate에서 클로 프롬의 80 µ L을 적용 합니다. 표준, 10, 30, 60, 90, 및 quadruplicate에서 표준 희석 식물성 기름의 120 µ L를 추가 합니다.
  5. 20-30 분까지 모든 용 매 증발은 55 ° C에서 건조 블록 히터에 미 판 장소. 용 매 증발 하는 동안 준비 작업 나 일 레드 솔루션 (잘 접시 당 1 µ g/ml 해결책의 필요 200 µ L). 예를 들어, 12 샘플 및 표준의 전체 세트 1.0 µ g/mL 해결책; 16 mL 필요 16 mL dH2오를 (DMSO)에서 200 µ g/mL의 80 µ L를 용 해 하 여 준비
  6. 미 판 열 블록에서 제거 하 고 실내 온도에 차가운 시키십시오. 각 우물에 이소프로필 알코올 30 µ L을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 혼합. 모든 피 펫 채널 혼합 솔루션 및 지질, 저조한 균질 녹색 액체를 resuspending를 확인 하십시오.
  7. 위/아래를 섞어 10 배 나 일 레드 솔루션 (1 µ g/mL) 각 음, 플라스틱의 200 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 5 분 동안 접시를 품 어. 기다리는 동안,2오 20 µ L 당 잘 필요는 지명 타자로 사용 표 백제 (6% 차 아 염소 산)을 혼합 하 여 50%의 표 백제 솔루션을 준비 합니다. 50% 표 백제 3 mL의 준비는 12 샘플 및 표준의 전체 집합에 대 한 충분 한 이다.
  8. 잘 각 microplate에 표 백제 솔루션의 20 µ L을 추가 하 고 잘 섞어 5 번 위아래로 플라스틱. 실 온에서 30 분을 품 어.
  9. 30 분 후 읽기 샘플에서 형광 530 nm 여기/575 nm 방출에서 5-10 분 마다 자동 컷오프 570 설정 nm 조류 샘플에서 신호 안정화 될 때까지. 일반적으로, 전체 외피의 60 분은 충분 합니다.
  10. (0-40 ng 오일/우물의 범위)에서 식물성 기름 표준에 대 한 교정 곡선을 만듭니다.
    참고: 선형 맞는 저를 위해 잘 작동 (< 30 ng/잘) 오일 농도 및 적합 다항식 표준 30 ng/잘 초과 하는 경우 사용할 수 있습니다. 이 상관 관계를 사용 하 여 샘플 우물에서 중립 지질 계량.

결과

이 절차는 세 550 nm (그림 4A)에서 조류 광학 밀도 데이터의 시간 과정을 생성합니다. 광학 밀도 건조 중량 농도 데이터 수 상관 (그림 4B). 이것은 동결 단계 후 최종 건조 중량 조류 농도 계산 하 여 수행 됩니다. 다음, 문화 연속 희석 (샘플링의 마지막 날에 수행)과 실제 건조 중량 농도의 광학 밀도 상관 될 수 있다. 낮은 셀 농도 ...

토론

조류를 배양 할 때 가장 중요 한 고려 사항은 유기 체 또는 생물의 그룹의 특정 요구에 대 한 이해입니다. 여기에 설명 된 재배 시스템 문화 조류 하지만 특정 비 생물 적인 요인 (온도, 미디어, pH, 빛의 강도, CO2 수준, 통 기 통풍 속도)의 넓은 범위를 사용할 수 있는 조류 생물의 필요에 조정 될 필요가 있다. Note 여기에서 설명 하는 매개 변수 클로렐라 와 Auxenochlorella의 재배를 ...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 연구에 대 한 지원은 미국 농 무부 식품 및 농업 해치 프로젝트 ALA0HIGGINS는 학장, 연구를 위한 부사장 그리고는 사무엘 Ginn 대학의 공학의 고동색 대학 사무실에 의해 제공 되었다. 지원 또한 NSF에서 제공한 CBET 1438211를 부여.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Supplies for airlift photobioreactor setup
1 L Pyrex bottlesCorning16157-191For bottle reactors, humidifiers
1/2" hose clampHome DepotUC953Aor equivalent
1/4" female luer to barbNordson biomedicalNordson FTLL360-60051/4" ID, PP
1/4" ID, 3/8" OD autoclaveable PVC tubingThermo-Nalgene63013-24450'
1/4" in O-ringsGrainger1REC5#010 Medium Hard Silicone O-Ring, 0.239" I.D., 0.379"O.D.
1/8" Female luer to barbNordson biomedicalFTLL230-6005
1/8" ID, 1/4" OD autoclaveable PVC tubingThermo-Nalgene63013-608250'
1/8" male spinning luer to barbNordson biomedicalMLRL013-6005
1/8" multiport barbNordson biomedical4PLL230-60051/8" multiport barb
1/8" NPT to barbNordson biomedical18230-60051/8" 200 series barb
1/8" panel mount luerNordson biomedicalNordson MLRLB230-60051/8", PP
10 gallon fish tankWalmart802262Can hold up to 8 bioreactors depending on layout
100-1000 ccm flow meterDwyerRMA-13-SSVFor bottle reactors
2 ft fluorescent light bankAgrobriteFLT24 T5
200-2500 ccm flow meterDwyerRMA-14-SSVFor air regulation upstream of humidifier
250 mL Pyrex bottlesCorning16157-136For gas mixing after humidifier
50-500 ccm flow meterDwyerRMA-12-SSVFor hybridization tube reactors
5-50 ccm flow meterDwyerRMA-151-SSVFor CO2 flow rate control
Air filters 0.2 µmWhatman/ Fisher09-745-1APolyvent, 28 mm, 0.2 µm, PTFE, 50 pack
Check valvesVWR89094-714
Corning lids for pyrex bottlesVWR89000-23310 GL45 lids
Female luer endcapNordson biomedicalNordson FTLLP-6005Female stable PP
Hybridization tubesCorning32645-03035x300 mm, pack of 2
Light timerWalmart556393626
LocknutsNordson biomedicalNordson LNS-31/4", red nylon
Low profile magnetic stirrerVWR10153-690Low profile magnetic stirrer
Male luer endcapNordson biomedicalNordson LP4-6005Male plug PP
Spinning luer lock ringNordson biomedicalNordson FSLLR-6005
Stir bars - longVWR58949-04038.1 mm, for bottle reactors
Stir bars - mediumVWR58949-03425 mm, for hyridization tubes
Supplies and reagents for culturing algae
0.2 µm filtersVWR28145-49113 mm, PTFE, for filtering spent media from daily culture sampling
1 mL syringesAir-tite89215-216For filtering spent media from daily culture sampling
1.5 mL tubesVWR87003-294Sterile (or equivalent)
10 mL Serological pipettesGreiner Bio-One82050-482Sterile (or equivalent)
100 mm platesVWR25384-342100x15 mm stackable petri dishes, sterile
15 mL tubesGreiner Bio-One82050-276Sterile (or equivalent), polypropylene
2 mL Serological pipette tipsGreiner Bio-One82051-584Sterile (or equivalent)
2 mL tubesVWR87003-298Sterile (or equivalent)
50 mL tubesGreiner Bio-One82050-348Sterile (or equivalent), polypropylene
96 well microplateGreiner Bio-One89089-578Polystyrene with lid, flat bottom
Inocculating loopsVWR80094-478Sterile (or equivalent)
Liquid carbon dioxide tank and regulatorAirgasCD-50
Supplies and reagents for lipid extraction and neutral lipid assay
2 mL bead tubesVWR10158-556Polypropylene tube w/ lid
96 well microplatesGreiner Bio-One82050-774Polypropylene, flat bottom
BleachWalmart550646751Only use regular bleach, not cleaning bleach
ChloroformBDHBDH1109-4LG
Dimethyl sulfoxideBDHBDH1115-1LP
Isopropyl alcoholBDHBDH1133-1LP
MethanolBDHBDH20864.400
Nile redVWRTCN0659-5G
Pasteur pipette tipsVWR14673-010
Sodium chlorideBDHBDH9286-500G
Vegetable oilWalmart9276383Any vegetable oil should work as long as it is fresh
Zirconia/ silica beads (0.5 mm diameter)Biospec products11079105z
Equipment
Analytical balanceMettler-ToledoXS205DUCapable of at least 4 decimal accuracy
Bead homogenizerOmni19-040E
Benchtop micro centrifugeThermoHeraeus Fresco 21 with 24x2Including rotor capable of handling 1.5 and 2 mL tubes
Dry block heaterVWR75838-282Including dry block for a microplate
Freeze dryerLabconco76705202.5L freeze drying system
Large benchtop centrifugeThermoHeraeus Megafuge 16R TissueIncluding rotors capable of handling 400 mL bottles, 50 mL tubes, and 15 mL tubes
Microplate readerMolecular DevicesSpectraMax M2Capable of reading absorbance and fluorescence
Vortex mixerVWR10153-838

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