Ein In-Vitro-3D-Modell und eine Computational Pipeline zur Quantifizierung des vaskulogenen Potenzials von iPSC-derived endotheliaalen Vorläufern

Zusammenfassung

Endotheliale Vorläufer, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC-EPs) gewonnen werden, haben das Potenzial, Herz-Kreislauf-Behandlungen zu revolutionieren und die Schaffung von originalgetreueren Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu ermöglichen. Dabei werden die Verkapselung von iPSC-EPs in dreidimensionalen (3D) Kollagen-Mikroumgebungen und eine quantitative Analyse des vaskulogenen Potenzials dieser Zellen beschrieben.

Zusammenfassung

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) sind eine patientenspezifische, proliferative Zellquelle, die sich in jeden somatischen Zelltyp differenzieren kann. Bipotente endotheliale Vorläufer (EPs), die sich in die Zelltypen differenzieren können, die für die Zusammenbau einer reifen, funktionellen Vaskulatur erforderlich sind, wurden sowohl aus embryonalen als auch aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet. Diese Zellen wurden jedoch in dreidimensionalen Umgebungen nicht streng evaluiert, und ein quantitatives Maß ihres vaskulogenen Potenzials bleibt schwer fassbar. Hier beiderin skizziert die Erzeugung und Isolierung von iPSC-EPs über fluoreszierend aktivierte Zellsortierung, gefolgt von einer Beschreibung der Verkapselung und Kultur von iPSC-EPs in Kollagenhydrogelen. Diese extrazelluläre Matrix (ECM)-mimitierende Mikroumgebung fördert eine robuste vaskulogene Reaktion; Gefäßnetzwerke bilden sich nach einer Woche Kultur. Die Erstellung einer Rechenpipeline, die Open-Source-Software verwendet, um diese vaskulogene Reaktion zu quantifizieren, wird abgegrenzt. Diese Pipeline wurde speziell entwickelt, um die 3D-Architektur des Kapillarplexus beizubehalten, um die Anzahl der Verzweigungen, Verzweigungspunkte und die gesamte Netzwerklänge mit minimaler Benutzereingabe robust zu identifizieren.

Einleitung

Menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) und andere primäre Endothelzelltypen werden seit zwei Jahrzehnten verwendet, um das Keimen von Blutgefäßen und die Entwicklung in vitro¹zu modellieren. Solche Gefäßplattformen versprechen, molekulare und Gewebe-Level-Mechanismen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu beleuchten und können physiologische Einblicke in die Entwicklung von primitiven Gefäßnetzwerken darstellen^2,3. Obwohl das Gebiet der vaskulären Modellierung erhebliche Fortschritte gemacht hat, bleibt ein "Goldstandard"-Assay, der die physiologische Gefäßentwicklung quantitativ modellieren und bewerten kann, schwer fassbar. Die meisten veröffentlichten Protokolle rekapitulieren die vaskuläre Nische nicht angemessen, um die Bildung reifer, funktioneller Blutgefäße zu fördern, oder verfügen nicht über eine Methode, um das vaskulogene Potenzial der untersuchten Zelltypen quantitativ in drei Dimensionen zu vergleichen ( 3D).

Viele aktuelle Vaskuläre Sind in ihrer Fähigkeit, die physiologische Vaskuläre Nische nachzuahmen, begrenzt. Eine der am häufigsten eingesetzten In-vitro-Plattformen ist der gelatinöse Protein-Gemisch-basierte Rohrbildungstest. Kurz gesagt, HUVECs werden als einzelne Zellen auf einer dünnen Gelschicht gesät, die aus Proteinen besteht, die aus der extrazellulären Matrix des murinen Sarkoms (ECM) geerntet werden; innerhalb von ein bis zwei Tagen bauen sich die HUVECs selbst in primitive Rohre⁴zusammen. Dieser Prozess findet jedoch in zwei Dimensionen (2D) statt und die in diesem Test verwendeten Endothelzellen (ECs) bilden keine geschlossenen, hohlen Lumen, wodurch die physiologische Bedeutung dieser Studien eingeschränkt wird. In jüngerer Zeit wurden ECs und unterstützende Zellen (z. B. mesenchymale Stammzellen (MSCs) und Pericyte) in 3D-Mikroumgebungen mitkultiviert, die die faserige Architektur des nativen ECM simulieren, wie Kollagen oder Fibrinhydrogele⁵. Um die Gefäßentwicklung in dieser Mikroumgebung zu modellieren, werden in der Regel mit ECs beschichtete Polymerperlen verwendet⁶. Die Zugabe von exogenen Wachstumsfaktoren und/oder Wachstumsfaktoren, die von anderen Zellen, die interstitiell in das Hydrogel eingebettet sind, sezerniert werden, kann die ECs, die die polymeren Perlen beschichten, dazu veranlassen, zu sprießen und ein einziges Lumen zu bilden; Die Anzahl und der Durchmesser von Sprossen und Gefäßen können dann berechnet werden. Diese Sprossen sind jedoch einzigartig und bilden kein geschlossenes, vernetztes Netzwerk, wie es bei physiologischen Bedingungen zu beobachten ist, und erinnern daher eher an ein Tumorvaskulaturmodell. Mikrofluidische Geräte wurden auch verwendet, um die vaskuläre Nische nachzuahmen und die Bildung von Vaskulatur in EC-beladenen Hydrogelen^7,8zu fördern. Typischerweise wird ein angiogener Wachstumsfaktor-Gradient auf das zirkulierende Zellkulturmedium angewendet, um DIE MIGRATION und das Keimen der EG zu induzieren. ECs, die das Lumen der entwickelten Gefäße bilden, reagieren empfindlich auf die Scherspannung, die durch die Anwendung des Flüssigkeitsflusses durch die mikrofluidische Vorrichtung verursacht wird; Daher erfassen diese mikrofluidischen Geräte wichtige physiologische Parameter, die in den statischen Modellen nicht zugänglich sind. Diese Geräte erfordern jedoch kostspielige Mikrofertigungsfähigkeiten.

Am wichtigsten ist, dass alle drei Vaskulärenmodelle (2D, 3D, mikrofluidic) überwiegend primäre ECs sowie primäre unterstützende Zelltypen nutzen. Primärzellen können nicht zu einer wirksamen kardiovaskulären Therapie entwickelt werden, da die Zellen bei der Implantation eine Immunantwort hervorrufen würden; Darüber hinaus sind HUVECs und ähnliche primäre Zelltypen nicht patientenspezifisch und erfassen keine Gefäßanomalien, die bei Patienten mit einer genetischen Disposition oder bereits bestehenden Gesundheitlichen Erkrankungen auftreten, z. B. Diabetes mellitus. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) haben sich in den letzten zehn Jahren als patientenspezifische, proliferative Zellquelle herauskristallisiert, die in alle somatischen Zellen im menschlichen Körper unterschieden werden kann⁹. Insbesondere wurden Protokolle veröffentlicht, die die Erzeugung und Isolierung von iPSC-abgeleiteten endotheliale Vorläuferitoren (iPSC-EPs)^10,11beschreiben; iPSC-EPs sind bipotent und lassen sich daher weiter in Endothelzellen und glatte Muskelzellen/Pericyten, die Bausteine einer reifen, funktionellen Vaskulatur, differenzieren. Nur eine Studie hat die Entwicklung eines primären Kapillarplexus aus iPSC-EPs in einer 3D-Mikroumgebung überzeugend detailliert beschrieben¹²; Obwohl diese Studie für das Verständnis der iPSC-EP-Montage und Differenzierung in natürlichen und synthetischen Hydrogelen von entscheidender Bedeutung ist, wurden die Netzwerktopologien der resultierenden Vaskulatur nicht quantitativ verglichen. Eine weitere aktuelle Studie hat das Polymerperlenmodell verwendet, um das Keimen von HUVECs und iPSC-abgeleiteten ECs⁵zu vergleichen. Daher besteht die klare Notwendigkeit, die physikalischen und chemischen Signalmechanismen, die die iPSC-EP-Vaskulogenese in 3D-Mikroumgebungen regulieren, weiter aufzuklären und festzustellen, ob diese Zellen für ischämische Therapien und Herz-Kreislauf-Erkrankungen geeignet sind. Modellierung.

In den letzten zehn Jahren wurden verschiedene Open-Source-Rechenpipelines und Skelettierungsalgorithmen entwickelt, um die Länge und Konnektivität von vaskulären Netzwerken zu quantifizieren und zu vergleichen. Zum Beispiel entwickelten Charwat et al. eine Photoshop-basierte Pipeline, um ein gefiltertes, binarisiertes Bild von Gefäßnetzwerken zu extrahieren, das aus einer Kokultur von adipose-abgeleiteten Stammzellen und Auswuchs-ECs in einer Fibrin-Matrix^13,14abgeleitet wurde. Das vielleicht am weitesten verbreitete Topologie-Vergleichstool ist AngioTool, ein Programm, das online vom National Cancer Institute¹⁵veröffentlicht wurde; trotz der weit verbreiteten Akzeptanz und gut dokumentierten Treue des Programms beschränkt sich das Programm auf die Analyse von schiffsähnlichen Strukturen in zwei Dimensionen und andere Programme, einschließlich AngioSys und Wimasis, teilen die gleiche Maßeinheitsbeschränkung¹⁶. Leistungsstarke Software-Suiten wie Imaris, Lucis und Metamorph wurden entwickelt, um die Netzwerktopologie der technischen Mikrovaskulatur zu analysieren; Diese Suiten sind jedoch für die meisten akademischen Labors kostenprohibitiv und beschränken den Zugriff auf den Quellcode, was die Fähigkeit des Endbenutzers, den Algorithmus an seine spezifische Anwendung anzupassen, behindern kann. 3D Slicer, ein Open-Source-Magnetresonanztomographie/Computertomographie-Paket, enthält ein Vascular Modeling Toolkit, das die Topologie von 3D-Gefäßnetzwerken effektiv analysieren kann¹⁷; Die Analyse hängt jedoch davon ab, dass der Benutzer die Endpunkte des Netzwerks manuell platziert, was bei der Analyse eines großen Datasets mühsam werden kann und durch die unbewussten Verzerrungen des Benutzers beeinflusst werden kann. In diesem Manuskript wird eine Rechnerpipeline beschrieben, die 3D-Gefäßnetzwerke quantifizieren kann. Um die oben beschriebenen Einschränkungen zu überwinden, verwendet diese Open-Source-Rechenpipeline ImageJ, um erfasste konfokale Bilder vorab zu verarbeiten, um das 3D-Volumen in einen Skelettanalysator zu laden. Der Skelettanalysator verwendet einen parallelen medialen Achsenausdünnungsalgorithmus und wurde ursprünglich von Kerschnitzki et al. entwickelt, um die Länge und Konnektivität von Osteozytennetzwerken zu analysieren¹⁸; Dieser Algorithmus kann effektiv angewendet werden, um die Länge und Konnektivität der technischen Mikrovaskulatur zu charakterisieren.

Insgesamt skizziert dieses Protokoll die Schaffung mikrovaskulärer Netzwerke in 3D-Mikroumgebungen und bietet eine Open-Source- und Benutzer-Bias-freie Rechenpipeline, um das vaskulogene Potenzial von iPSC-EPs leicht zu vergleichen.

Protokoll

1. Vorbereitung von Kulturmedien und Beschichtungslösungen

1. Zur Herstellung einer vitronectin-Beschichtungslösung ist vitronectin 1:100 in der phosphatgepufferten Saline (DPBS) von Dulbecco verdünnt.
   VORSICHT: Nach der Verdünnung wird nicht empfohlen, diese Lösung für die zukünftige Verwendung zu speichern.
2. Bei Aufnahme von phenolrot-frei, Wachstumsfaktor-reduzierten gelatinösen Protein-Mischung (siehe Tabelle der Materialien) vom Hersteller, tauen auf Eis bei 4 °C, bis die Mischung transparent und flüssig ist. Halten Sie das Gemisch in einer laminaren Durchflusshaube auf Eis, Pipette 75 l des Gemischs in ein 1,8 ml Mikrozentrifugenrohr geben und bei -20 °C sofort einfrieren. Diese Aliquots können bis zu einem Jahr gelagert werden.
   VORSICHT: Diese gelatinöse Proteinmischung wird bei Raumtemperatur sehr zähflüssig und erstarrt bei höheren Temperaturen. Halten Sie diese Lösung eiskalt.
3. Um diese Mischung für die Beschichtung vorzubereiten, tauen Sie ein 75 L Aliquot auf Eis auf und verdünnen Sie mit 6 ml eiskaltem Dulbecco es Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12). Dieses vorbereitete Volumen reicht aus, um eine 12-Well-Platte zu beschichten.
4. Bereiten Sie eine 100 mg/ml-Stammlösung mit Ascorbinsäure Magnesium-2-Phosphat (ein weißes lyophilisiertes Pulver) in Reinstwasser vor, indem Sie 500 mg Pulver zu 5 ml Wasser in einer 10 ml Glasszintillationsdurchstechflasche hinzufügen. Rühren Sie mit einer Rührstange, bis die Lösung vollständig transparent ist (dies kann bis zu einer Stunde dauern). Diese Lösung kann bis zu einem Jahr bei -20 °C gelagert werden.
5. Erstellen Sie einen 10 mM Gehalt an CHIR99021 (CHIR), indem Sie 10 mg lyophilisiertes Pulver in 1,9928 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem 15 ml konischen Zentrifugenrohr auflösen und in einem 37 °C-Perlenbad (oder Wasser) erwärmen, bis die Lösung transparent ist. In 1,8 ml Mikrozentrifugenröhrchen einfließen und bis zu einem Jahr bei -20 °C lagern.
6. Erstellen Sie einen 10 mM Vorrat an Y-27632, einem ROCK-Hemmer (ROCKi), indem Sie 10 mg lyophilisiertes Pulver in 3,1225 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem 15 ml konischen Zentrifugenrohr auflösen und in einem 37 °C-Strahl (oder Wasser) erwärmen, bis die Lösung transparent ist. In 1,8 ml Mikrozentrifugenröhrchen einfließen und bis zu einem Jahr bei -20 °C lagern.
7. Um Essential 8 (E8) Medium vorzubereiten, tauen gefrorene Ergänzungen, fügen Sie die 500 ml Flasche Basalmedium, und Filter sterilisieren. Diese Lösung kann bis zu zwei Wochen bei 4 °C gelagert werden.
   VORSICHT: Es ist sehr wichtig, dieses Medium nicht bei 37 °C zu erwärmen, da die Proteine in der Mediumformulierung bei längerem Gebrauch abbauen können. Stattdessen halten Sie dieses Medium vor Gebrauch 15 bis 30 min bei Raumtemperatur.
8. Zur Herstellung des Sortierpuffers 1,33 ml 7,5 % Rinderserumalbumin (BSA) in DPBS und 200 l 0,5 ml Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) auf 48,5 ml DPBS hinzufügen, um eine von 0,5% BSA und 2 mM EDTA zu schaffen.
9. Zur Herstellung von LaSR Basal 300 l mit 100 mg/ml Ascorbinsäure Magnesium-2-Phosphat und 5 ml GlutaMAX zu 500 ml Advanced DMEM/F12 hinzufügen. Diese Lösung kann bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden.
10. Um Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) vorzubereiten, Tauwetter Ergänzungen und fügen Sie zu 500 ml Flasche Basalmedium. Diese Lösung kann bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden.
11. Um einen Sperrpuffer vorzubereiten, fügen Sie 500 mg lyophilisiertes Rinderserumalbumin (BSA) und 50 l eines emulgierenden Reagenzes (siehe Materialtabelle) zu 48 ml DPBS hinzu. Bei 37 °C mindestens 15 min inkubieren, um sicherzustellen, dass die BSA nicht verklumpt und sich anschließend von der Lösung trennt.

2. Auftauen, Warten und Passieren von iPSCs

1. Vor dem Auftauen einer kryokonservierten iPSC-Durchstechflasche einen einzigen Brunnen einer 6-Well-Platte mit 1 ml Vitronectin-Lösung (zubereitet wie in Schritt 1.1 beschrieben) anlegen. Bei Raumtemperatur für ein h brüten. Lassen Sie diese Beschichtungsluft nicht trocknen, bevor Sie E8 medium auf die Platte geben.
2. Um iPSCs aufzutauen, holen Sie eine kryokonservierte Durchstechflasche mit iPSCs aus ihrem Flüssigstickstoffspeicherbehälter und tauen Sie bei 37 °C auf, bis ein kleiner Kristall aus Eis übrig bleibt. Den Inhalt der aufgetauten Durchstechflasche vorsichtig (tropfend) auf ein 15 ml konisches Zentrifugenrohr mit 8 ml eiskaltem DMEM/F12 übertragen. Waschen Sie die aufgetaute Durchstechflasche mit einer Zugabe von 1 ml eiskaltem DMEM/F12, um den Zellverlust zu minimieren. Zentrifuge für 5 min bei 300 x g.
3. Während des Wartens auf die Zentrifuge, aspirieren Sie die vitronectin Lösung und fügen Sie 1 ml E8 Medium (vorbereitet wie in Schritt 1.6 beschrieben) in den Brunnen. Entfernen Sie dann den DMEM/F12-Überstand aus dem zentrifugierten konischen Rohr und hängen Sie das Pellet in 1 ml E8 medium wieder auf. Übertragen Sie die Zellen auf die neu beschichtete Platte, wobei Sie sicher sind, die Suspension zu agitieren, um zu verhindern, dass die Kolonien bei der Aussaat verklumpen.
4. Es gibt in der Regel erheblichen Zelltod nach dem Auftauen. Am nächsten Morgen das Medium entfernen und durch frisches E8-Medium ersetzen.
   HINWEIS: Selbst unter optimalen Bedingungen neigen iPSCs dazu, sich schlecht von der Kryokonservierung zu erholen. Es wird empfohlen, einen nahezu konfluenten 6-Well für die zukünftige Aussaat in einem einzigen 6-Well zu kryokonservieren. Das Vorhandensein von Zellablagerungen ist normal für die ersten 2-3 Tage während der Zellerholung.
5. Ersetzen Sie E8 medium täglich, bis die Zellen für die Passierung bereit sind (70% –80% Konfluenz).
6. Zum Durchgang zunächst vitronectinbeschichtete Brunnen vorbereiten (wie in Schritt 2.1 beschrieben).
   1. Sobald vitronectinbeschichtete Brunnen fertig sind (ca. 1 h), e8 medium aus gut durchgehen und zweimal mit 1 ml DPBS waschen. Inkubieren Sie mit 1 ml 0,5 mM EDTA für 5–7 min bei 37 °C. Entfernen Sie während der Inkubation die Vitronectin-Lösung aus dem neu beschichteten Brunnen und ersetzen Sie sie durch 1–2 ml E8-Medium.
   2. Entfernen Sie die EDTA-Lösung aus den durchgehenden Brunnen und lösen Sie die Kolonien, indem Sie sie ein- oder zweimal mit 1 ml E8 sanft waschen. 75-200 l Zellsuspension in die frisch beschichteten E8-haltigen Brunnen geben, die Platte aufregen, um eine gleichmäßige Abdeckung zu gewährleisten, und sofort in den Inkubator legen.
      VORSICHT: Die Inkubationszeit für die iPSC-Ablösung ist zelllinienabhängig; Es wird empfohlen, dass der Benutzer dieses Protokolls eine Reihe von Tests bei ausreichender Erweiterung einer empfangenen/generierten iPSC-Leitung durchführt. 75 l der Zellsuspension führt in der Regel zu 4 Tagen zwischen den Passagen; 150 l oder mehr führt zu 2-3 Tagen zwischen den Passagen.

3. Erzeugung von iPSC-abgeleiteten endotheliale Vorläuferitoren (Abbildung 1).

1. Achten Sie bei der Wartung von iPSCs darauf, dass die Kolonien gut verdichtet sind und dass es eine geringe Anzahl differenzierter Zellen in der Kultur gibt. Wenn die Kolonien beginnen, miteinander in Kontakt zu treten, sind die Zellen höchstwahrscheinlich zu konfluent und müssen sofort durchgesieben werden.
2. Wenn iPSCs 70%–80% konfluent sind, beschichten Sie eine 24-Well-Platte mit der gelatinösen Proteinmischung (zubereitet wie unter 1.2/1.3 beschrieben). Pipette 250 l dieser Mischung in jeden Brunnen und halten Sie für 1 h bei Raumtemperatur.
3. Entfernen Sie während der oben genannten 1-h-Inkubation das E8-Medium bzw. das Y-27632 aus dem Kühlschrank bzw. Gefrierschrank. Sobald E8 medium und Y-27632 Raumtemperatur erreichen, bereiten Sie E8 + ROCKi vor, indem Sie 13 l von 10 'M Y-27632 bis 13 ml E8 in einem 15 ml konischen Zentrifugenrohr hinzufügen.
4. Entfernen Sie das E8-Medium aus den iPSC-Brunnen, waschen Sie es zweimal mit 1 ml DPBS und brüten Sie dann mit 0,5 mM EDTA für 5-7 min bei 37 °C. Nach der Inkubationszeit die EDTA entfernen und die Zellen mit einer P1000 Pipettenspitze mit 1 ml E8 + ROCKi-Medium schnell in eine einzellige Suspension scheren.
5. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Für eine Suspension, die Millionen von iPSCs enthalten kann, fügen Sie 20 L Zellsuspension zu 180 l Trypan blau hinzu. Bestimmen Sie die Anzahl der Gesamtzellen in der Einzelzellsuspension.
6. Übertragen Sie 0,432 x 10⁶ bis 1,296 x 10⁶ Zellen (10⁴ bis 3 x 10⁴ Zellen/cm²⁾auf das verbleibende E8 + ROCKi Medium. Entfernen Sie die gelatinöse Mischungsbeschichtung von der neu beschichteten 12-Well-Platte und fügen Sie jedem Brunnen 500 l Zellsuspension hinzu, um sicherzustellen, dass die Zellen gut verteilt sind und keine kleinen Klumpen bilden.
   HINWEIS: Dieser Dichtebereich ist optimal für die Differenzierung von CD34-positiven Zellen; Diese Sädichten sind jedoch zelllinienabhängig und müssen möglicherweise vom Benutzer dieses Protokolls optimiert werden.
7. Nach 24 h Kultur, ersetzen Medium durch 500 l frisches E8 Medium. Unter den gleichen Bedingungen für weitere 24 stunden inkubieren.
8. Entfernen Sie das E8-Medium und ersetzen Sie es durch LaSR Basal, ergänzt durch 6-12 M CHIR99021. Dieser Zeitpunkt ist definiert als D0 der Differenzierung. Nach 24 h Kultur, ersetzen Sie durch das gleiche Zellkulturmedium.
   HINWEIS: Wie bereits beschrieben, hängt die Menge an CHIR99021, die diesem Medium hinzugefügt wird, von der verwendeten iPSC-Leitung ab. Bitte testen Sie einen Bereich von CHIR99021-Konzentrationen, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
9. Nach 48 h Inkubation mit CHIR99021 durch 1 ml LaSR Basal ersetzen.
10. Ersetzen Sie das Medium täglich durch 2 ml LaSR Basal für 2-3 zusätzliche Tage. Zu diesem Zeitpunkt (D5 der Differenzierung) wird ein signifikanter Teil dieser Zellen CD34 exprimieren und kann als endotheliale Vorläufer charakterisiert werden. Ein Schema dieses Protokolls wird mit repräsentativen Ergebnissen in Abbildung 1 umrissen und von den Forschern, die diese Methode zuerst veröffentlicht haben, vollständig beschrieben ^11,19.
    ANMERKUNG: Diese endotheliale Vorläufer können entlang einer endotheliaalen Abstammung weiter differenziert werden (35%–99%) oder eine glatte Muskellinie (1%–65%). Die Differenzierungseffizienz variiert je nach Art der ECM-Beschichtung und dem bei der Differenzierung verwendeten Zellkulturmedium ²⁰.

4. FACS von endotheliale Vorläufer

1. Bevor Sie die D5/D6 differenzierten Zellen trennen, bereiten Sie den Sortierpuffer wie in Schritt 1.8 beschrieben vor und halten Sie sich auf Eis.
2. Inkubieren Sie die differenzierten Zellen mit 250 l Zellablösung pro Bohrung (siehe Materialtabelle) 10 min bei 37 °C.
3. Dissoziieren Sie die Zellen mit einer P1000 Pipettenspitze in eine einzellige Suspension in Zellablösung. Konsolidieren Sie das Zell-Zell-Ablösungslösungsgemisch in einem 15 ml konischen Zentrifugenrohr und Zentrifuge für 5 min bei 300 x g.
4. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie ihn in 200 l eiskalten Sortierpuffer (vorbereitet wie in Schritt 1.7 beschrieben) wieder auf. 5 L des konzentrierten CD34-PE-Antikörpers in die Zellsortierungspuffersuspension geben und 10 min bei 4 °C inkubieren.
5. Wiederaufhängen in 5 ml eiskalten Sortierpuffer. Filtern Sie diese Suspension durch ein Zellsieb mit einer Kappe von 40 m, bevor Sie sie auf den Sortierer legen.
6. Sortieren Sie auf dem entsprechenden Fluoreszenzkanal 10.000 Zellen, die nicht mit einem fluoreszierenden Antikörper gekennzeichnet wurden. Gate eine Region mit einer hohen fluoreszierenden Intensität, die keine dieser 10.000 Zellen enthält (Abbildung 1D). Dies wird als negative Kontrolle dienen.
7. Führen Sie die Probe mit iPSC-EPs aus, die mit einer fluoreszierenden Lösung gekennzeichnet sind, und beginnen Sie mit der Sortierung. CD34 ist in diesen endotheliale Vorläufern stark exprimiert und lässt sich leicht von der Hauptpopulation trennen. Nach dem Sortieren die Lösung für 5 min bei 300 x gin ein 15 ml kegelförmiges Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge übertragen. Entfernen Sie den Überstand.
   HINWEIS: Befindet sich die Lösung in einem Rohr, das größer ist als ein Mikrozentrifugenrohr (z. B. ein 5 ml Polystyrolrohr, das häufig in vielen FACs-Protokollen verwendet wird), das sortierte Zellpellet in 1 ml Sortierpuffer wieder aufsetzen und diese Lösung in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min und entfernen Sie den Überstand.
   1. Optional: Wenn eine weitere iPSC-EP-Charakterisierung gewünscht wird, fügen Sie andere primäre Antikörper (z.B. CD31-APC) gleichzeitig mit CD34-PE hinzu. Stellen Sie sicher, dass das Übersprechen zwischen verschiedenen Fluoreszenzkanälen minimiert wird.

5. Verkapselung und Langzeitkultur von iPSC-EP-beladenen Kollagenhydrogelen

1. Bereiten Sie das Aussaatmedium vor, indem Sie 40 l 10x medium 199 bis 400 l endothelialem Wachstumsmedium (EGM-2) hinzufügen, das mit 10 'M Y-27632 in einer 1,8 ml Mikrozentrifuge ergänzt wird, und das Rohr auf Eis legen.
   ANMERKUNG: Während für die Stammzellkultur und die Aufrechterhaltung differenzierter Zellen von der Verwendung von Antibiotika abgeraten wird, wird die Einstung mit Pen/Strep nach der Sortierung empfohlen, da es schwierig ist, sterilität in der Sortierumgebung zu gewährleisten (dies ist mehr erforderlich, wenn der Sortierer von vielen Laboratorien geteilt wird).
2. Entfernen Sie alle Überstande aus der Zellsuspension und fügen Sie 200 L EGM-2 hinzu, ergänzt um 10 M Y-27632. Die Zellsuspension auf das Aussaatmedium übertragen und kräftig mischen.
3. Fügen Sie der in Schritt 5.2 zubereiteten Lösung 350 l Kollagen hinzu und mischen Sie sie gut. Die Lösung wird blassgelb.
   HINWEIS: Die endgültige Konzentration von Kollagen kann einen signifikanten Einfluss auf die Bildung des Kapillarplexus haben. Dieses Protokoll geht davon aus, dass das Kollagen mit 10 mg/ml zugeführt wurde und dass die Hydrogele eine Endkonzentration von 3,5 mg/ml haben. Passen Sie diese Volumina an, um ihre endgültige Kollagenkonzentration zu erreichen; Es wird empfohlen, die endgültige Kollagenkonzentration von 2 mg/ml auf 4 mg/ml zu begrenzen.
4. Fügen Sie der in 5.3 zubereiteten Lösung 5 L 1M NaOH hinzu und mischen Sie sie gut, wodurch die Einführung von Luftblasen vermieden wird. Die Lösung wird hellrosa.
5. Pipette 56 l neutralisierte Kollagen-Zell-Lösung in 5,4 in einzelnen Bohrungen einer 96-well ultra-niedrigen Befestigung U-Boden-Zell-Kulturplatte hergestellt. Bei 37 °C für 30 min inkubieren. Überprüfen Sie vor dem Hinzufügen von Medien, ob die Zellen gleichmäßig verteilt wurden, indem Sie die Proben mit einem Hellfeldmikroskop untersuchen.
6. Bereiten Sie 1 ml Kulturmedium, bestehend aus EGM-2, ergänzt mit 10 M Y-27632 und 50 ng/ml vaskulärem endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), vor, indem Sie einem Mikrozentrifugenrohr 1 l jeder Stammlösung hinzufügen. Nach dem Mischen von Gut, Pipette 100 l dieses Zellkulturmedium auf die zellbeladenen Hydrogele. Übertragen Sie die Platte auf 37 °C für langfristige Kultur.
7. Ersetzen Sie das Kulturmedium täglich und fügen Sie zusätzliche angiogene Wachstumsfaktoren oder kleine Molekülinhibitoren hinzu, wie es das Ziel der Studie vorschreibt. Um die Medien optimal zu entfernen, neigen Sie die Platte und verwenden Sie eine P100-Spitze, um das Medium sanft zu aspirieren, ohne das Hydrogel zu stören.

6. Fixierung, Immunfärbung und Visualisierung von EP-basierten Gefäßnetzwerken

1. Nach einer Woche Kultur eine 48-Well-Platte mit einer 48-Well-Platte hinzufügen. Füllen Sie so viele Brunnen, wie es Hydrogele gibt. Entfernen Sie das Medium aus den Hydrogelen (PFA) und verwenden Sie eine feingekippte Pinzette, um die Hydrogele auf PFA-haltige Brunnen zu übertragen. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren und das PFA entfernen, indem Sie es schnell mit PBS waschen.
2. Permeabilisieren, indem man 250 l von 0,5% eines nichtionischen Tensids (siehe Materialtabelle)für 5 min bei Raumtemperatur hinzufügt. Waschen Sie zweimal mit 250 l PBS, ergänzt mit 300 mM Glycin. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 min für jeden Waschschritt, um die Entfernung von überschüssigem Reinigungsmittel zu gewährleisten. Blockieren Sie, indem Sie die Hydrogele in 250 l Sperrpuffer für 30 min eintauchen.
3. Mit den gewünschten Primärantikörpern in Blockierpuffer über Nacht bei 4 °C verdünnt inkubieren. Zum Beispiel, wenn Immunostaining mit Phalloidin und VE-Cadherin, verdünnen 1:40 bzw. 1:200, in Blockierpuffer.
4. Am nächsten Tag die primäre Antikörperlösung entfernen und zweimal mit 0,5% emulgierendem Reagenz in DPBS waschen. Mit Aluminiumfolie abdecken und mit einem artspezifischen Sekundärantikörper (z.B. 1:200 Alexa Fluor 488 in PBS) für 2 h bei Raumtemperatur bebrüten.
5. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung und waschen Sie zweimal mit 0,5% emulgierendem Reagenz in DPBS. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 min für jeden Waschschritt, um die Entfernung von freien Fluorophoren zu gewährleisten.
6. Um Zellkerne zu visualisieren, verdünnen Sie 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) 1:10000 in PBS und fügen Sie die Probe(n) hinzu.
   1. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren und zweimal mit PBS waschen. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 min für jeden Waschschritt, um die Entfernung von freien Fluorophoren zu gewährleisten.
7. Übertragen Sie die Proben mit einer feingekippten Pinzette auf eine Angiogenese-Slide oder eine Glasboden-Petrischale. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen unter dem Hydrogel gefangen sind.
8. Bild auf einem konfokalen Mikroskop, indem Z-Stacks erworben werden, die sich von unten bis zum oberen Rand der Probe erstrecken. Stellen Sie sicher, dass der Detektor nicht gesättigt ist und dass die niedrigste verfügbare Vergrößerung verwendet wird (ein großes Sichtfeld ist wünschenswert).
   HINWEIS: Stellen Sie für die zukünftige Verarbeitung sicher, dass die Z-Stacks mit minimaler Komprimierung (z. B. .czi) gespeichert werden.

7. Verwenden der Rechenpipeline zum Analysieren und Vergleichen von vaskulären Netzwerktopologien

1. Überprüfen Sie jeden Z-Stack, um sicherzustellen, dass Slices nur Gefäße enthalten. Öffnen Sie den Z-Stack in ImageJ, und verbessern Sie den Kontrast, indem Sie auf Bild > Anpassen > Helligkeit/Kontrastklicken. Die Schiffsgrenzen sind nun klar abgegrenzt, und die Hintergrundebene wird minimiert. Oft stimmen die Z-Dimensionen nicht mit den x/y-Dimensionen überein. Um dies zu beheben, klicken Sie auf Bild > Anpassen > Größe und ändern Sie die Anzahl der Z-Slices, sodass der Abstand zwischen den einzelnen Slices einem Pixel in x/y entspricht. ImageJ wird automatisch interpoliert. Wenn dieser Schritt nicht ordnungsgemäß ausgeführt wird, werden die endgültigen 3D-Volumes komprimiert angezeigt.
   VORSICHT: ECs wandern an die Ränder des Gels und bilden kleine Kopfsteinpflasterkolonien. Diese sind zwar nützlich, um die Grenzen des Hydrogels zu schätzen, stören aber die endgültige Bildanalyse und sollten gelöscht werden.
   HINWEIS: ImageJ ist eine Java-basierte Open-Source-Bildanalyse-Software, die gemeinsam von den National Institutes of Health und dem Laboratory for Optical and Computational Instrumentation entwickelt wurde. Es wird empfohlen, Fidschi herunterzuladen, das einfach ImageJ mit nützlichen Plugins (https://fiji.sc/ gebündelt ist.
2. Verwischen Sie in ImageJ das Bild in 3 Dimensionen, indem Sie auf Prozess > Filter > Gaußsche Unschärfe 3D klicken und dann die Sigma-Werte in allen 3 Dimensionen auf 2,0 festlegen (dieser Wert muss möglicherweise vom Endbenutzer angepasst werden).
3. Klicken Sie in ImageJ auf Prozess > Binär > Binary erstellen, und wählen Sie dann einen geeigneten Schwellenwertalgorithmus aus. Der von Li et al. entwickelte Cross-Entropie-Schwellenalgorithmus ist wirksam bei der Trennung von Gefäßen vom Hintergrund²¹. Berechnen Sie den Schwellenwert für jedes Bild und legen Sie den Hintergrund auf "Standard" fest.
4. Entfernen Sie in ImageJ falsche Geräusche, und füllen Sie "Löcher" in Lumen aus, indem Sie auf Prozess > Rauschen > Ausreißer entfernenklicken.
   ANMERKUNG: Das Entfernen von "hellen" Ausreißern füllt kleine Löcher in verbundenen Gefäßen; Durch das Entfernen "dunkler" Ausreißer werden abgestorbene Zellen entfernt. Die Größe des Entfernungsradius variiert je nach Vergrößerung und Größe der Gefäße. Bei Bildern, die mit einem Breitfeldobjektiv von 512 x 512 Pixeln aufgenommen wurden, reichen die Radien in der Regel zwischen 4 und 6 Pixeln.
5. Verarbeiten Sie alle raw -Dateien (z. B. czi-Erweiterungsdateien) und konvertieren Sie sie in .tif-Dateien, bevor Sie mit Schritt 7.6 fortfahren. Um diese Verarbeitung zu unterstützen, wurde diesem Manuskript ein ImageJ-Skript "Binarize und Filter.ijm" beigefügt.
6. Speichern Sie die verarbeiteten .tif-Dateien im selben Ordner wie die Datei "BatchProcessSkeleton.m", die im Manuskript zum Download zur Verfügung steht. Dieses von den Autoren entwickelte Skript nennt die von Phillip Kollmannsberger²² veröffentlichten Funktionen und führt einige zusätzliche Dateimanipulationen durch.
7. Laden Sie alle Dateien herunter, die mit den beiden Hauptfunktionen "Skel2Graph3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) und "Skeleton3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d) verknüpft sind. Speichern Sie alle Funktionen in demselben Ordner wie der geöffnete verarbeitete Z-Stack.
8. Öffnen Sie eine numerische Computerumgebung mit mehreren Paradigmen (siehe Tabelle der Materialien), und navigieren Sie zu dem Ordner, in dem alle oben beschriebenen Dateien gespeichert wurden.
9. Führen Sie "BatchProcessSkeleton.m" entweder durch Eingabe von BatchProcessSkeleton im Befehlsfenster oder durch Öffnen des Skripts und Drücken der Run-Schaltfläche (rechtsgerichteter grüner Pfeil) im Editor aus.
   HINWEIS: Um ein großes Dataset mit einem einzigen Befehl zu analysieren, stellen Sie sicher, dass die Zeichenfolge innerhalb der Dir-Funktion in Zeile 6 ein Sternchen enthält (z. B. '*.tif'). Andernfalls ersetzen Sie das Sternchen durch den Dateinamen, wenn die Analyse einer einzelnen Datei gewünscht wird.
10. Die Dauer der Ausführung dieses Skripts hängt wesentlich von der verfügbaren Rechenleistung ab. Es wird empfohlen, diese Analyse auf einem Computer mit mindestens 8 GB RAM durchzuführen, damit der Benutzer während der Skriptlaufzeit auf andere Programme zugreifen kann.
    VORSICHT: Obwohl nicht unbedingt notwendig, kann das Grafischisieren der ursprünglichen konfokalen Erfassung (in grau) und das Überlagern mit dieser Bildmatrix mit der Skelettmatrix (in rot) bei der Bewertung der Leistung des Skelettierungsalgorithmus helfen. Darüber hinaus kann der Leser ein Knotendiagramm erstellen, wie es von Kollmannsberger et al. implementiert wurde, um die Genauigkeit der Netzwerkanalyse zu bewerten. Das Erstellen beider Diagramme ist zwar nützlich, erhöht jedoch die Laufzeit des Skripts erheblich und erfordert zusätzlichen Arbeitsspeicher. Wenn der Benutzer einfach eine abschließende Topologieanalyse benötigt und den Datensatz nicht visualisieren möchte, kommentieren Sie einfach die Zeilen 44 bis 61 (Skelettdiagramm) und die Zeilen 104 bis 143 (Topologiediagramm) aus.
11. Nach Abschluss enthält die im Arbeitsbereich sichtbare Datenmatrix nun die verarbeiteten Daten. Doppelklicken Sie auf Daten, und öffnen Sie diese Zelle im Variablen-Editor.
    1. Beachten Sie, dass diese Matrix von links nach rechts: 1) den Dateinamen, 2) die Anzahl der Knoten (Zweigpunkte + Endpunkte), 3) Verzweigungspunkte, 4) Verknüpfungen (d. h. Gefäße), 5) Netzwerklänge (einschließlich Isolatgefäße) und 6) die Anzahl der im Z-Stack enthaltenen Slices enthält. Speichern Sie diese Daten als .csv-Datei und exportieren Sie sie zur weiteren Analyse in jede Software Ihrer Wahl.

Ergebnisse

Nach der Differenzierung (Abbildung1), FACS und Verkapselung von iPSC-EPs in Kollagenhydrogelen bleiben die Zellen in der Regel 24 h gerundet, bevor sie mit der Migration beginnen und erste Lumen bilden. Nach ca. 6 Tagen Kultur wird ein primitiver Kapillarplexus im Hydrogel sichtbar sein, wenn er mit der Hellfeldmikroskopie betrachtet wird (Abbildung 2). Nach der Abbildung der fixierten, mit Zell beladenen Hydrogele auf einem kon...

Diskussion

Dieses Protokoll bezieht die langfristige Zellkultur in drei Arten von Zellkulturmedien ein: E8, LaSR Basal und EGM-2. Daher sollte sehr darauf geachtet werden, alle Materialien angemessen zu sterilisieren. Darüber hinaus sollten Labormäntel und ethanolgereinigte Handschuhe immer getragen werden, wenn sie in der laminaren Durchflusshaube des Labors arbeiten. Es wird empfohlen, häufig auf Mykoplasmenkontamination zu testen; Wenn während der iPSC-Kultur eine große Menge an Schmutz beobachtet wird oder ein plötzlicher...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	N/A	A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile	Corning	7007	Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	The base media for iPSC-EP differentiation.
Barnstead GenPure xCAD Plus	Thermo Fisher Scientific	50136165	Water purification system; others can be readily substituted
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture	Fisher Scientific	A8412	To preserve cell viability when FACs sorting
CD34-PE, human (clone: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs
CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg	VWR	354249	Main component of the 3D microenvironment
Conical centrifuge tubes (15/50 mL)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	To counterstain and visualize cell nuclei
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	ThermoFisher	14190-250	To wash monolayer cultures
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting
Endothelial Cell Growth Medium 2	PromoCell	C-22011	Promotes endothelial cell viability and proliferation
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	For maintenance of pluripotent stem cells
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT)	Sigma-Aldrich	50046	Neutralizes remaining detergent
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95%	Sigma-Aldrich	A8960	Component of iPSC-EP differentiation medium
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture)	Fisher Scientific	356231	Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation
Medium-199 10X	Thermo Fisher Scientific	1825015	Used to balance final hydrogel osmolarity and pH
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	VWR	87003-294	Stores small volumes of reagents
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	The main ingredient of the immunostaining solutions
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument
Recombinant Human VEGF 165 Protein	R&D Systems	293-VE	Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis
Rhodamine phalloidin	Themo Fisher Scientific	R415	To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks
Triton X-100 (nonionic surfactant)	Sigma-Aldrich	X-100	Detergent used to gently permeabilize cells
Tween-20 (emulsifying reagent)	Fisher Scientific	BP337	Increases the binding specificity of the added antibodies
VE-Cadherin (F-8)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989	To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels
Vitronectin	ThermoFisher	A14700	For maintenance of pluripotent stem cells
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded