Un modèle 3D in vitro et un pipeline computationnel pour quantifier le potentiel vasculogénique des progéniteurs endothéliaux dérivés de l'iPSC

Résumé

Les progéniteurs endothéliaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPS-EP) ont le potentiel de révolutionner les traitements des maladies cardiovasculaires et de permettre la création de modèles de maladies cardiovasculaires plus fidèles. Ici, l'encapsulation des iPSC-EPs dans les microenvironnements tridimensionnels (3D) de collagène et une analyse quantitative du potentiel vasculogenic de ces cellules sont décrites.

Résumé

Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont une source cellulaire proliférante spécifique au patient qui peut se différencier en n'importe quel type de cellule somatique. Les progéniteurs endothéliaux bipotents (PE), qui peuvent se différencier en types de cellules nécessaires pour assembler la vascularisation mature et fonctionnelle, ont été dérivés de cellules souches pluripotentes embryonnaires et induites. Cependant, ces cellules n'ont pas été rigoureusement évaluées dans des environnements tridimensionnels, et une mesure quantitative de leur potentiel vasculogénique reste insaisissable. Ici, la génération et l'isolement des iPSC-EPs par le tri fluorescent-activé de cellules sont d'abord décrits, suivis d'une description de l'encapsulation et de la culture des iPSC-EPs dans les hydrogels de collagène. Ce microenvironnement extracellulaire de matrice (ECM)-imitation encourage une réponse vasculogenic robuste ; les réseaux vasculaires se forment après une semaine de culture. La création d'un pipeline de calcul qui utilise un logiciel open-source pour quantifier cette réponse vasculogénique est délimitée. Ce pipeline est spécialement conçu pour préserver l'architecture 3D du plexus capillaire afin d'identifier solidement le nombre de branches, les points de ramification et la longueur totale du réseau avec un minimum d'entrée de l'utilisateur.

Introduction

Les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs) et d'autres types primaires de cellules endothéliales ont été employées pendant deux décennies pour modéliser la germination et le développement de vaisseaux sanguins in vitro^1. Ces plates-formes vasculaires promettent d'éclairer les mécanismes moléculaires et tissulaires des maladies cardiovasculaires et peuvent présenter un aperçu physiologique du développement des réseaux vasculaires primitifs^2,3. Bien que le domaine de la modélisation vasculaire ait connu des progrès significatifs, un essai « d'étalon-or » qui peut modéliser et évaluer quantitativement le développement vasculaire physiologique demeure insaisissable. La plupart des protocoles publiés ne récapitulent pas adéquatement la niche vasculaire pour encourager la formation de vaisseaux sanguins matures et fonctionnels ou n'ont pas de méthode pour comparer quantitativement le potentiel vasculogénique des types de cellules évaluées en trois dimensions ( 3D).

Beaucoup de modèles vasculaires actuels sont limités dans leur capacité à imiter la niche vasculaire physiologique. L'une des plates-formes in vitro les plus couramment utilisées est l'analyse de formation de tubes à base de mélange de protéines gélatineuses. En bref, les HUVEC sont ensevants sous forme de cellules uniques sur une fine couche de gel qui se compose de protéines récoltées à partir de la matrice extracellulaire du sarcome murine (ECM); dans un délai d'un à deux jours, les HUVEC s'auto-assemblent en tubes primitifs⁴. Cependant, ce processus se produit dans les deux dimensions (2D) et les cellules endothéliales (ECs) utilisées dans ce procès ne forment pas des lumens creux fermés, limitant ainsi la signification physiologique de ces études. Plus récemment, les EC et les cellules de soutien (p. ex., les cellules souches mésenchymales (MSC) et les péritéytes) ont été co-cultivées dans des microenvironnements 3D qui simulent l'architecture fibreuse de l'ECM indigène, comme le collagène ou les hydrogels à la fibrine⁵. Pour modéliser le développement vasculaire dans ce microenvironnement, les perles polymères enduites d'ECsont sont généralement employées⁶. L'ajout de facteurs de croissance exogènes et/ou de facteurs de croissance sécrétés par d'autres cellules incrustées interstitiellement dans l'hydrogel peut induire les CE, enduire les perles polymères, germer et former un lumen unique; le nombre et le diamètre des germes et des vaisseaux peuvent alors être calculés. Cependant, ces germes sont singuliers et ne forment pas un réseau clos et connecté comme on le voit dans des conditions physiologiques et rappelle donc plus un modèle de vascularisation tumorale. Des dispositifs microfluidiques ont également été utilisés pour imiter la niche vasculaire et pour promouvoir la formation de la vascularisation dans les hydrogels chargés d'EC^7,8. Typiquement, un facteur de croissance-gradient angiogénique est appliqué au milieu circulant de culture de cellules pour induire la migration et la germination d'EC. Les CE qui constituent le lumen des vaisseaux développés sont sensibles au stress de cisaillement induit par l'application du flux de fluide par le dispositif microfluidique ; ainsi, ces dispositifs microfluidiques capturent les paramètres physiologiques clés qui ne sont pas accessibles dans les modèles statiques. Cependant, ces dispositifs nécessitent des capacités de microfabrication coûteuses.

Plus important encore, les trois modèles vasculaires (2D, 3D, microfluidique) utilisent massivement les ECprimaires ainsi que les types de cellules primaires de soutien. Les cellules primaires ne peuvent pas être développées en une thérapie cardio-vasculaire efficace parce que les cellules engendreraient une réponse immunitaire à l'implantation ; en outre, les HUVEC et les types semblables de cellules primaires ne sont pas patients-spécifiques et ne saisissent pas des anomalies vasculaires qui se produisent dans les patients présentant une disposition génétique ou des conditions de santé préexistantes, par exemple, le diabète sucré. Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) ont émergé au cours de la dernière décennie comme une source cellulaire proliférante spécifique au patient qui peut être différenciée en toutes les cellules somatiques du corps humain⁹. En particulier, des protocoles ont été publiés qui décrivent la génération et l'isolement des progéniteurs endothéliaux dérivés de l'iPSC (iPSC-EPs)^10,11; iPSC-EPs sont bipotents et peuvent, par conséquent, être différenciés en cellules endothéliales et cellules musculaires lisses / périytes, les éléments constitutifs de la maturité, vascularisation fonctionnelle. Une seule étude a détaillé de manière convaincante le développement d'un plexus capillaire primaire à partir d'iPSC-EPs dans un microenvironnement 3D¹²; bien que cette étude soit essentielle à la compréhension de l'assemblage iPSC-EP et à la différenciation dans les hydrogels naturels et synthétiques, elle n'a pas comparé quantitativement les topologies réseau de la vascularisation résultante. Une autre étude récente a utilisé le modèle de perle polymère pour comparer la germination des HUVEC et des EC 5 dérivés de l'iPSC. Par conséquent, il est clairement nécessaire d'élucider davantage les mécanismes de signalisation physique et chimique qui régulent la vasculogenèse iPSC-EP dans les microenvironnements 3D et de déterminer si ces cellules sont appropriées pour la thérapie ischémique et les maladies cardiovasculaires Modélisation.

Au cours de la dernière décennie, différents pipelines et algorithmes de squezation de réseau open source ont été développés pour quantifier et comparer la longueur et la connectivité du réseau vasculaire. Par exemple, Charwat et coll. ont mis au point un pipeline basé sur Photoshop pour extraire une image filtrée et binarisée des réseaux vasculaires dérivée d'une co-culture de cellules souches dérivées de l'adipose et d'ECs excroissance dans une matrice de fibrine^13,14. Peut-être l'outil de comparaison topologie le plus largement utilisé est AngioTool, un programme publié en ligne par l'Institut national du cancer^15; malgré l'adoption généralisée du programme et sa fidélité bien documentée, le programme se limite à l'analyse de structures semblables à des navires en deux dimensions et d'autres programmes, y compris AngioSys et Wimasis, partagent la même limitation de dimensionnalité¹⁶. De puissantes suites logicielles telles que Imaris, Lucis et Metamorph ont été développées pour analyser la topologie réseau de la microvasculature modifiée; cependant, ces suites sont prohibitives pour la plupart des laboratoires universitaires et limitent l'accès au code source, ce qui peut entraver la capacité de l'utilisateur final à personnaliser l'algorithme à leur application spécifique. 3D Slicer, un ensemble d'imagerie par résonance magnétique et de tomographie calculée en source, contient une trousse d'outils de modélisation vasculaire qui peut analyser efficacement la topologie des réseaux vasculaires 3D^17; cependant, l'analyse dépend de l'utilisateur plaçant manuellement les points de terminaison du réseau, qui peuvent devenir fastidieux lors de l'analyse d'un grand jeu de données et peuvent être influencés par les biais subconscients de l'utilisateur. Dans ce manuscrit, un pipeline computationnel qui peut quantifier les réseaux vasculaires 3D est décrit en détail. Pour surmonter les limites décrites ci-dessus, ce pipeline de calcul open source utilise ImageJ pour pré-traiter les images confocalisées acquises pour charger le volume 3D dans un analyseur squelette. L'analyseur de squelette utilise un algorithme d'amincissement médial parallèle de l'axe, et a été initialement développé par Kerschnitzki et coll. pour analyser la longueur et la connectivité des réseaux d'ostéocytes¹⁸; cet algorithme peut être appliqué efficacement pour caractériser la longueur et la connectivité de la microvasculature modifiée.

Au total, ce protocole décrit la création de réseaux microvasculaires dans les microenvironnements 3D et fournit un pipeline de calcul libre et libre de biais utilisateur et open-source pour comparer facilement le potentiel vasculogénique des iPSC-EPs.

Protocole

1. Préparation des solutions de médias et de revêtements de culture

1. Pour préparer la solution de revêtement de vitronectin, diluer la vitronectin 1:100 dans la saline phosphate-tamponnée de Dulbecco (DPBS).
   CAUTION: Une fois dilué, il n'est pas recommandé de stocker cette solution pour une utilisation future.
2. Après avoir reçu du phenol sans rouge, le mélange de protéines gélatineuses à teneur réduite par facteur de croissance (voir Tableau des matériaux)du fabricant, décongeler sur la glace à 4 oC jusqu'à ce que le mélange soit transparent et fluide. Garder le mélange sur la glace dans une hotte à débit laminaire, pipette 75 'L du mélange dans un tube microcentrifuge de 1,8 ml et congeler à -20 oC immédiatement. Ces aliquots peuvent être stockés jusqu'à un an.
   CAUTION: Ce mélange de protéines gélatineuses devient très visqueux lorsqu'il est conservé à température ambiante et se solidifie à des températures plus élevées. Gardez cette solution glacée.
3. Pour préparer ce mélange pour le revêtement, décongeler un aliquot de 75 L sur la glace et diluer avec 6 ml de glace-froid Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12). Ce volume préparé est suffisant pour enrober une plaque de 12 puits.
4. Préparer une solution de 100 mg/mL de magnésium-2-phosphate d'acide ascorbique (une poudre lyophilisée blanche) dans de l'eau ultrapure en ajoutant 500 mg de poudre à 5 ml d'eau dans une fiole de scintillation en verre de 10 ml. Agiter avec une barre d'agitation jusqu'à ce que la solution soit complètement transparente (cela peut prendre jusqu'à une heure). Cette solution peut être stockée à -20 oC jusqu'à un an.
5. Créez un stock de 10 mM de CHIR99021 (CHIR) en dissolvant 10 mg de poudre lyophilisée dans 1,9928 mL de sulfoxide de diméthyle (DMSO) dans un tube conique de centrifugeuse de 15 ml et chaud dans un bain de perles (ou d'eau) de 37 oC jusqu'à ce que la solution soit transparente. Aliquot en tubes microcentrifuges de 1,8 ml et entreposer à -20 oC jusqu'à un an.
6. Créez un stock de 10 mM de Y-27632, un inhibiteur ROCK (ROCKi), en dissolvant 10 mg de poudre lyophilisée dans 3,1225 mL de sulfoxure de diméthyle (DMSO) dans un tube conique de centrifugeuse de 15 ml et chaud dans un bain de perles (ou eau) de 37 oC jusqu'à ce que la solution soit transparente. Aliquot en tubes microcentrifuges de 1,8 ml et entreposer à -20 oC jusqu'à un an.
7. Pour préparer Essential 8 (E8) moyen, décongeler les suppléments congelés, ajouter à la bouteille de 500 ml de milieu basal, et filtrer la stérilisation. Cette solution peut être stockée à 4 oC pendant une période pouvant aller jusqu'à deux semaines.
   CAUTION : Il est très important de ne pas réchauffer ce milieu à 37 oC, car les protéines de la formulation moyenne peuvent se dégrader avec une utilisation prolongée. Au lieu de cela, garder ce milieu à température ambiante pendant 15 à 30 minutes avant utilisation.
8. Pour préparer un tampon de tri, ajouter 1,33 mL d'albumine de sérum bovin (BSA) à 7,5 % en DPBS et 200 oL d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) à 48,5 mL de DPBS pour créer une solution finale de 0,5 % de BSA et de 2 mM EDTA.
9. Pour préparer LaSR Basal, ajouter 300 'L de 100 mg/mL d'acide ascorbique magnésium-2-phosphate et 5 ml de GlutaMAX à 500 ml de DMEM/F12 avancé. Cette solution peut être stockée à 4 oC jusqu'à un mois.
10. Pour préparer endothélial Cell Growth Medium-2 (EGM-2), décongeler les suppléments et ajouter à 500 ml bouteille de milieu basal. Cette solution peut être stockée à 4 oC jusqu'à un mois.
11. Pour préparer le tampon de blocage, ajouter 500 mg d'albumine de sérum bovin lyophilisé (BSA) et 50 l d'un réactif émulsionné (voir Tableau des matériaux) à 48 ml de DPBS. Incuber à 37 oC pendant au moins 15 min pour s'assurer que le BSA ne s'agglutine pas et se sépare par la suite de la solution.

2. Dégel, entretien et passage des iPSC

1. Avant de décongeler une fiole iPSC cryoconservée, enrober un seul puits d'une plaque de 6 puits avec 1 ml de solution vitronectin (préparée comme décrit à l'étape 1.1). Incuber pendant une h à température ambiante. Ne laissez pas sécher ce revêtement à l'air avant d'ajouter le milieu E8 à la plaque.
2. Pour décongeler les iPSC, récupérez un flacon cryoconservé d'iPSC dans son contenant de stockage d'azote liquide et dégelez-le à 37 oC jusqu'à ce qu'il reste un petit cristal de glace. Transférer soigneusement (en toute baisse) le contenu du flacon décongelé dans un tube conique de centrifugeuse de 15 ml contenant 8 ml de DMEM/F12 glacé. Laver le flacon décongelé avec un ajout de 1 ml de DMEM/F12 glacé pour minimiser la perte cellulaire. Centrifugeuse de 5 min à 300 x g.
3. En attendant la centrifugeuse, aspirez la solution vitronectin et ajoutez 1 ml de milieu E8 (préparé comme décrit à l'étape 1.6) au puits. Ensuite, retirez le supernatant DMEM/F12 du tube conique centrifié et suspendez à nouveau la pastille dans 1 ml de milieu E8. Transférer les cellules dans la plaque nouvellement enduite, en toute saquité pour agiter la suspension pour empêcher les colonies de s'agglutiner lors de l'ensemencement.
4. Il y a généralement une mort cellulaire importante après la décongélation. Le lendemain matin, retirez le milieu et remplacez-le par un milieu E8 frais.
   REMARQUE : Même dans des conditions optimales, les iPSC ont tendance à se rétablir mal de la cryoconservation. Il est recommandé de cryoconserver un puits de 6 quasi-confluents pour l'ensemencement futur en un seul puits de 6. La présence de débris cellulaires est normale pendant les 2-3 premiers jours pendant la récupération cellulaire.
5. Remplacer le milieu E8 tous les jours jusqu'à ce que les cellules soient prêtes à passer (70 % à 80 % de confluence).
6. Pour le passage, préparer d'abord les puits enduits de vitronectin (comme décrit à l'étape 2.1).
   1. Une fois les puits enduits de vitronectin sont prêts (environ 1 h), aspirent le milieu E8 du puits à passer et lavez deux fois avec 1 ml de DPBS. Incuber avec 1 ml de 0,5 mM EDTA pour 5 à 7 min à 37 oC. Pendant l'incubation, retirer la solution vitronectin du puits nouvellement enduit et remplacer par 1/2 ml de milieu E8.
   2. Retirez la solution EDTA des puits à passer et détachez les colonies en lavant doucement une ou deux fois avec 1 ml d'E8. Transférer 75-200 l de suspension cellulaire dans les puits e8 fraîchement enduits, agiter la plaque pour assurer une couverture uniforme, et placer dans l'incubateur immédiatement.
      CAUTION : Le temps d'incubation pour le détachement d'iPSC dépend de la lignée cellulaire ; il est recommandé que l'utilisateur de ce protocole teste une série de fois après avoir suffisamment élargi une ligne iPSC reçue/générée. 75 ll de suspension cellulaire se traduit généralement par 4 jours entre les passages; 150 l ou plus mène à 2 à 3 jours entre les passages.

3. Génération d'ancêtres endothéliaux dérivés de l'iPSC (figure 1).

1. Lors de l'entretien des iPSC, assurez-vous que les colonies sont bien compactées et qu'il y a un faible nombre de cellules différenciées en culture. Si les colonies commencent à se contacter, les cellules sont probablement trop confluentes et doivent être passages immédiatement.
2. Lorsque les iPSC sont confluents de 70 % à 80 %, enrober une assiette de 24 puits avec le mélange de protéines gélatineuses (préparé comme décrit dans 1,2/1.3). Pipette 250 l de ce mélange dans chaque puits et garder pendant 1 h à température ambiante.
3. Pendant l'incubation ci-dessus de 1 h, retirer le milieu E8 et Y-27632 du réfrigérateur et du congélateur, respectivement. Une fois que l'E8 moyen et le Y-27632 atteignent la température ambiante, préparez E8 et ROCKi en ajoutant 13 'L de 10 'M Y-27632 à 13 ml d'E8 dans un tube conique de centrifugeuse de 15 ml.
4. Retirer le milieu E8 des puits iPSC, laver deux fois avec 1 ml de DPBS, puis couver avec 0,5 mM EDTA pendant 5-7 min à 37 oC. Après la période d'incubation, retirez l'EDTA et cisaillez rapidement les cellules dans une suspension unicellulaire avec une pointe de pipette P1000 avec 1 ml de milieu E8 ET ROCKi.
5. Comptez les cellules avec un hémocytomètre. Pour une suspension qui peut contenir des millions d'iPSC, ajoutez 20 l de suspension cellulaire à 180 l de bleu trypan. Déterminer le nombre total de cellules dans la suspension unicellulaire.
6. Transférer 0,432 x 10⁶ à 1,296 x 10⁶ cellules (10⁴ à 3 x 10⁴ cellules/cm²) vers le support E8 et ROCKi restant. Retirez le mélange gélatineux de la plaque de 12 puits nouvellement enrobée et ajoutez 500 L de suspension cellulaire à chaque puits, en veillant à ce que les cellules soient bien réparties et ne forment pas de petits amas.
   REMARQUE : Cette gamme de densités est optimale pour la différenciation des cellules positives cD34 ; cependant, ces densités d'ensemencement sont dépendantes de la lignée cellulaire et peuvent devoir être optimisées par l'utilisateur de ce protocole.
7. Après 24 h de culture, remplacer le milieu par 500 l de milieu E8 frais. Incuber pendant 24 h supplémentaires dans les mêmes conditions.
8. Retirez le milieu E8 et remplacez-le par Du LaSR Basal complété par 6-12 M de CHIR99021. Ce point temporel est défini comme D0 de différenciation. Après 24 h de culture, remplacer par le même milieu de culture cellulaire.
   REMARQUE : Tel que décrit précédemment, la quantité de CHIR99021 ajoutée à ce support dépendra de la ligne iPSC utilisée. Veuillez tester une gamme de concentrations de CHIR99021 pour assurer des résultats optimaux.
9. Après 48 h d'incubation avec CHIR99021, remplacer par 1 ml de LaSR Basal.
10. Remplacer le milieu tous les jours par 2 ml de LaSR Basal pendant 2-3 jours supplémentaires. À ce stade (D5 de différenciation), une proportion significative de ces cellules exprimera CD34 et peut être caractérisée comme progéniteurs endothéliaux. Un schéma de ce protocole est décrit avec des résultats représentatifs dans la figure 1 et décrit dans son intégralité par les chercheurs qui ont d'abord publié cette méthode ^11,19.
    REMARQUE : Ces ancêtres endothéliaux peuvent être différenciés davantage le long d'une lignée endothéliale (35 % à 99 %) ou une lignée musculaire lisse (1 % à 65 %). L'efficacité de la différenciation varie selon le type de revêtement ECM et le milieu de culture cellulaire utilisé lors de la différenciation ²⁰.

4. FACS des progéniteurs endothéliaux

1. Avant de dissocier les cellules différenciées D5/D6, préparez le tampon de tri tel que décrit à l'étape 1.8 et restez sur la glace.
2. Incuber les cellules différenciées avec 250 l de solution de détachement cellulaire par puits (voir Tableau des matériaux) pendant 10 min à 37 oC.
3. Dissocier les cellules avec une tiptte P1000 pipette dans une suspension de cellule unique dans la solution de détachement cellulaire. Consolider le mélange de solution de détachement cellulaire dans un tube conique de centrifugeuse de 15 ml et une centrifugeuse pendant 5 min à 300 x g.
4. Retirez le supernatant et suspendez-le dans 200 l de tampon de tri glacé (préparé tel que décrit à l'étape 1.7. Ajouter 5 ll de l'anticorps cD34-PE concentré à la suspension tampon de tri cellulaire et couver pendant 10 min à 4 oC.
5. Suspendre à nouveau dans 5 ml de tampon de tri glacé. Filtrer cette suspension à travers une passoire cellulaire avec un bouchon de 40 m avant de placer sur le trieur.
6. Sur le canal fluorescent approprié, trier 10 000 cellules qui n'ont pas été étiquetées avec un anticorps fluorescent. Portez une région à haute intensité fluorescente qui ne contient aucune de ces 10 000 cellules (figure 1D). Cela servira de contrôle négatif.
7. Exécutez l'échantillon contenant iPSC-EPs étiqueté avec une solution fluorescente et commencez le tri. Le CD34 est très exprimé dans ces ancêtres endothéliaux et est facilement séparé de la population principale. Après le tri, transférer la solution dans un tube conique de centrifugeuse de 15 ml et une centrifugeuse pendant 5 min à 300 xg. Retirez le supernatant.
   REMARQUE : Si la solution se trouve dans un tube plus grand qu'un tube de microcentrifuge (p. ex., un tube de polystyrène de 5 ml couramment utilisé dans de nombreux protocoles de CAO), suspendez à nouveau le granule de cellules triés dans 1 ml de tampon de tri et transférez cette solution dans un tube de microcentrifugeur. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min et retirer le supernatant.
   1. Facultatif : si d'autres caractérisations iPSC-EP sont souhaitées, ajoutez d'autres anticorps primaires (p. ex., CD31-APC) simultanément avec CD34-PE. Assurez-vous que les traques entre les différents canaux fluorescents sont réduites au minimum.

5. Encapsulation et culture à long terme des hydrogels de collagène chargés d'iPSC-EP

1. Préparer le milieu d'ensemencement en ajoutant 40 oL de 10x moyens 199 à 400 l de milieu de croissance endothéliale (EGM-2) complété par 10 M Y-27632 dans un microcentrifugeur de 1,8 ml et placer le tube sur la glace.
   REMARQUE : Bien que l'utilisation d'antibiotiques soit déconseillée pour la culture des cellules souches et le maintien de cellules différenciées, le dosage avec pen/Strep est recommandé après le tri parce qu'il est difficile de garantir la stérilité dans l'environnement de tri (c'est plus si le trieur est partagé entre de nombreux laboratoires).
2. Retirez tous les supernatants de la suspension cellulaire et ajoutez 200 l d'EGM-2 complétés par 10 M Y-27632. Transférer la suspension cellulaire au milieu d'ensemencement et mélanger vigoureusement.
3. Ajouter 350 l de collagène à la solution préparée à l'étape 5.2 et bien mélanger. La solution deviendra jaune pâle.
   REMARQUE : La concentration finale de collagène peut avoir un impact significatif sur la formation du plexus capillaire. Ce protocole suppose que le collagène a été fourni à 10 mg/ml et que les hydrogels ont une concentration finale de 3,5 mg/mL. Ajuster ces volumes pour atteindre leur concentration finale de collagène; il est recommandé de limiter la concentration finale de collagène de 2 mg/mL à 4 mg/mL.
4. Ajouter 5 'L de 1M NaOH à la solution préparée en 5.3 et bien mélanger, en évitant l'introduction de bulles d'air. La solution deviendra rose vif.
5. Pipette 56 l de solution de collagène-cellule neutralisée préparée en 5.4 dans des puits individuels d'une plaque de culture de cellules U-bottom d'attachement ultra-faible de 96 puits. Incuber à 37 oC pendant 30 min. Avant d'ajouter des supports, vérifiez que les cellules ont été réparties uniformément en examinant les échantillons à l'aube d'un microscope à champ lumineux.
6. Préparer 1 mL de milieu de culture composé d'EGM-2 complété par 10 M Y-27632 et 50 ng/mL facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) en ajoutant 1 L de chaque solution de stock à un tube microcentrifuge. Après bien mélanger, pipette 100 l de ce milieu de culture cellulaire sur les hydrogels chargés de cellules. Transférer la plaque à 37 oC pour une culture à long terme.
7. Remplacer le milieu de culture quotidiennement, en ajoutant des facteurs de croissance angiogéniques supplémentaires ou des inhibiteurs de petites molécules comme dictée par l'objectif de l'étude. Pour enlever le support de façon optimale, inclinez la plaque et utilisez une pointe P100 pour aspirer doucement le milieu sans déranger l'hydrogel.

6. Fixation, immunostaining, et visualisation des réseaux vasculaires EP-basés

1. Après une semaine de culture, ajouter 250 l de 4 % de paraformaldéhyde (PFA) solution à une plaque de 48 puits. Remplissez autant de puits qu'il y a d'hydrogels. Retirer le milieu des hydrogels (PFA) et utiliser une pince à bout fin pour transférer les hydrogels aux puits contenant de pfA. Incuber 10 min à température ambiante et retirer le PFA en lavant rapidement avec du PBS.
2. Perméabilize en ajoutant 250 l de 0,5 % d'un surfactant nonionique (voir Tableau des matériaux) pendant 5 min à température ambiante. Laver deux fois avec 250 L de PBS complété s'il y a 300 mM de glycine. Incuber à température ambiante pendant 5 min pour chaque étape de lavage afin d'assurer l'élimination de l'excès de détergent. Bloquer en immerger les hydrogels dans 250 l de tampon de blocage pendant 30 min.
3. Incuber avec les anticorps primaires désirés dilués dans le tampon de blocage pendant la nuit à 4 oC. Par exemple, si l'immunostaining avec la phalloidin et ve-cadherin, diluer 1:40 et 1:200, respectivement, dans le tampon de blocage.
4. Le lendemain, retirez la solution d'anticorps primaire et lavez-les deux fois avec un réactif émulsionné de 0,5 % dans DPBS. Couvrir de papier d'aluminium et couver d'un anticorps secondaire spécifique à une espèce (p. ex., 1:200 Alexa Fluor 488 en PBS) pendant 2 h à température ambiante.
5. Retirez la solution d'anticorps secondaire et lavez-la deux fois avec un réactif émulsifiant de 0,5 % dans DPBS. Incuber à température ambiante pendant 5 min pour chaque étape de lavage afin d'assurer l'élimination des fluorophores libres.
6. Pour visualiser les noyaux cellulaires, diluer 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:10000 en PBS et ajouter à l'échantillon(s).
   1. Incuber 2 min à température ambiante et laver deux fois avec du PBS. Incuber à température ambiante pendant 5 min pour chaque étape de lavage afin d'assurer l'élimination des fluorophores libres.
7. Transférer les échantillons dans une angiogenèse ou un plat de Pétri à fond de verre à l'aide d'une pince à bout fin. Assurez-vous qu'aucune bulle d'air n'est emprisonnée sous l'hydrogel.
8. Image sur un microscope confocal en acquérant des z-stacks qui s'étendent du bas vers le haut de l'échantillon. Assurez-vous que le détecteur n'est pas saturé et que le grossissement le plus bas disponible est utilisé (un grand champ de vision est souhaitable).
   REMARQUE : Pour un traitement futur, assurez-vous que les z-stacks sont enregistrés avec une compression minimale (p. ex., .czi).

7. Utilisation du pipeline computationnel pour analyser et comparer les topologies du réseau vasculaire

1. Inspectez chaque z-pile pour vous assurer que les tranches ne contiennent que des récipients. Ouvrez le z-stack dans ImageJ et améliorer le contraste en cliquant sur Image 'gt; Ajuster 'gt; Luminosité / Contraste. Les bordures des navires sont maintenant clairement délimitées, et le niveau d'arrière-plan est réduit au minimum. Souvent, les z-dimensions ne correspondent pas aux dimensions x/y. Pour rectifier cela, cliquez sur Image 'gt; Ajuster 'gt; Taille et modifier le nombre de z-tranches de sorte que la distance entre chaque tranche est équivalente à un pixel en x/y. ImageJ interpolera automatiquement. Si cette étape n'est pas effectuée correctement, les volumes 3D finaux apparaîtront compressés.
   CAUTION : Les CE migreront vers les bords du gel et formeront de petites colonies de pavés. Bien qu'ils soient utiles pour estimer les limites de l'hydrogel, ils interfèrent avec l'analyse finale de l'image et doivent être supprimés.
   REMARQUE : ImageJ est un logiciel d'analyse d'images open source basé en Java développé de concert par les National Institutes of Health et le Laboratory for Optical and Computational Instrumentation. Il est recommandé de télécharger Fidji, qui est tout simplement ImageJ livré avec des plugins utiles (https://fiji.sc/).
2. Dans ImageJ, brouillez l'image en 3 dimensions en cliquant sur Processus de 3 dimensions et de réglages de flou 3D, puis en définissant les valeurs sigma dans les 3 dimensions à 2,0 (cette valeur pourrait devoir être ajustée par l'utilisateur final).
3. Dans ImageJ, cliquez sur Processus 'gt; Binaire 'gt; Faire binaire, puis sélectionnez un algorithme de seuil approprié. L'algorithme de seuil d'entropie croisée développé par Li et coll. est efficace pour séparer les navires de l'arrière-plan²¹. Calculez le seuil pour chaque image et fixez l'arrière-plan à "Défaut".
4. Dans ImageJ, supprimer le bruit fallacieux et remplir les "trous" dans les lumens en cliquant sur processus 'gt; Bruit 'gt; Supprimer les valeurs aberrantes.
   REMARQUE : L'élimination des valeurs aberrantes « brillantes » comblera de petits trous dans les navires connectés; enlever les valeurs aberrantes « sombres » éliminera les cellules mortes. La taille du rayon d'enlèvement varie en fonction du grossissement et de la taille des navires. Pour les images acquises avec un objectif de large champ qui sont 512 x 512 pixels, le radii va généralement varier de 4-6 pixels.
5. Traiter tous les fichiers bruts (p. ex., extension czi) et les convertir en fichiers .tif avant de passer à l'étape 7.6. Pour faciliter ce traitement, un script ImageJ, "Binarize and Filter.ijm" a été joint à ce manuscrit.
6. Enregistrez les fichiers .tif traités dans le même dossier que le fichier "BatchProcessSkeleton.m", disponible en téléchargement dans le manuscrit. Ce script, développé par les auteurs, appelle les fonctions publiées par Phillip Kollmannsberger²² et effectue une manipulation de fichiers supplémentaires.
7. Téléchargez et décompressez tous les fichiers associés aux deux fonctions principales "Skel2Graph3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) et "Skeleton3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d). Enregistrez toutes les fonctions dans le même dossier que la z-stack traitée ouverte.
8. Ouvrez un environnement informatique numérique multi-paradigme (voir Tableau des matériaux) et naviguez vers le dossier où tous les fichiers décrits ci-dessus ont été enregistrés.
9. Exécutez "BatchProcessSkeleton.m" soit en tapant BatchProcessSkeleton dans la fenêtre de commande ou en ouvrant le script et en appuyant sur le bouton Run (flèche verte orientée vers la droite) dans l'éditeur.
   REMARQUE : Pour analyser un grand jeu de données avec une seule commande, assurez-vous que la chaîne à l'intérieur de la fonction dir de la ligne 6 contient un astérisque (p. ex., '.tif'). Sinon, remplacez l'astérisque par le nom de fichier si l'analyse d'un seul fichier est souhaitée.
10. La durée d'exécution de ce script variera considérablement en fonction de la puissance de calcul disponible. Il est recommandé d'effectuer cette analyse sur un ordinateur avec au moins 8 Go de RAM afin que l'utilisateur puisse accéder à d'autres programmes pendant que le script s'exécute.
    CAUTION: Bien qu'il ne soit pas strictement nécessaire, le graphique de l'acquisition confocale originale (en gris) et la superposition de cette matrice d'image avec la matrice squelette (en rouge) peuvent aider à évaluer les performances de l'algorithme de skeletonisation. En outre, le lecteur peut créer un graphique nodal, tel que mis en œuvre par Kollmannsberger et al., pour évaluer l'exactitude de l'analyse du réseau. La création des deux graphiques, bien qu'utile, augmentera considérablement le temps d'exécution du script et nécessitera une mémoire supplémentaire ; si l'utilisateur a simplement besoin d'une analyse toptologique finale et ne veut pas visualiser l'ensemble de données, il suffit de commenter les lignes 44 à 61 (graphique squelette) et les lignes 104 à 143 (graphique de topologie).
11. Une fois terminée, la matrice de données, visible dans l'espace de travail, contient maintenant les données traitées. Double clic Données et ouvrez cette cellule dans l'éditeur Variable.
    1. Notez que cette matrice contiendra, de gauche à droite : 1) le nom du fichier, 2) le nombre de nœuds (points de branche et points d'extrémité), 3) points de branche, 4) liens (c.-à-d. navires), 5) longueur du réseau (y compris les vaisseaux isolats) et 6) le nombre de tranches contenues dans la pile Z. Enregistrer ces données comme un fichier .csv et d'exporter pour une analyse plus approfondie à tout logiciel de choix.

Résultats

Après la différenciation (Figure 1), FACS et encapsulation des iPSC-EPs dans les hydrogels de collagène, les cellules resteront typiquement arrondies pendant 24 h avant de commencer à migrer et à former des lumens initiaux. Après environ 6 jours de culture, un plexus capillaire primitif sera visible dans l'hydrogel lorsqu'il est vu avec une microscopie brightfield (Figure 2). Après l'imagerie des hydrogels fixes et tachés...

Discussion

Ce protocole implique la culture à long terme des cellules dans trois types de médias de culture cellulaire : E8, LaSR Basal, et EGM-2. Par conséquent, un grand soin doit être pris pour stériliser de manière appropriée tous les matériaux. De plus, les blouses de laboratoire et les gants nettoyés à l'éthanol doivent toujours être portés lorsque vous travaillez dans le capuchon à débit laminaire du laboratoire. Il est recommandé de tester fréquemment la contamination par le mycoplasme; si une grande quanti...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	N/A	A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile	Corning	7007	Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	The base media for iPSC-EP differentiation.
Barnstead GenPure xCAD Plus	Thermo Fisher Scientific	50136165	Water purification system; others can be readily substituted
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture	Fisher Scientific	A8412	To preserve cell viability when FACs sorting
CD34-PE, human (clone: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs
CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg	VWR	354249	Main component of the 3D microenvironment
Conical centrifuge tubes (15/50 mL)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	To counterstain and visualize cell nuclei
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	ThermoFisher	14190-250	To wash monolayer cultures
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting
Endothelial Cell Growth Medium 2	PromoCell	C-22011	Promotes endothelial cell viability and proliferation
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	For maintenance of pluripotent stem cells
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT)	Sigma-Aldrich	50046	Neutralizes remaining detergent
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95%	Sigma-Aldrich	A8960	Component of iPSC-EP differentiation medium
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture)	Fisher Scientific	356231	Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation
Medium-199 10X	Thermo Fisher Scientific	1825015	Used to balance final hydrogel osmolarity and pH
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	VWR	87003-294	Stores small volumes of reagents
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	The main ingredient of the immunostaining solutions
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument
Recombinant Human VEGF 165 Protein	R&D Systems	293-VE	Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis
Rhodamine phalloidin	Themo Fisher Scientific	R415	To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks
Triton X-100 (nonionic surfactant)	Sigma-Aldrich	X-100	Detergent used to gently permeabilize cells
Tween-20 (emulsifying reagent)	Fisher Scientific	BP337	Increases the binding specificity of the added antibodies
VE-Cadherin (F-8)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989	To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels
Vitronectin	ThermoFisher	A14700	For maintenance of pluripotent stem cells
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded