Модель In Vitro 3D и вычислительный трубопровод для количественной оценки васкулогенного потенциала iPSC-производных эндотелиальных прародителей

Резюме

Эндотелиальные прародители, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC-EPs), обладают потенциалом для революционизации лечения сердечно-сосудистых заболеваний и создания более верных моделей сердечно-сосудистых заболеваний. Здесь описана инкапсуляция iPSC-EPs в трехмерных (3D) коллагеновых микросредах и количественный анализ васкулогенного потенциала этих клеток.

Аннотация

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) являются специфическим для пациента, пролиферативным источником клеток, который может дифференцироваться в любой тип соматических клеток. Бипотентэндилиальных прародителей (EPs), которые могут дифференцировать в типы клеток, необходимых для сборки зрелых, функциональных сосуд, были получены из эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Однако эти клетки не были тщательно оценены в трехмерных средах, и количественное измерение их васкулогенного потенциала остается неуловимым. Здесь сначала очерчиваются генерация и изоляция iPSC-EPs с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток, за которым ипотретешься инкапсуляция и культура iPSC-EPs в коллагеновых гидрогелях. Эта внеклеточная матрица (ECM)-мимикрирующая микроокружение поощряет надежную васкулогенную реакцию; сосудистые сети образуются после недели культуры. Очертивалось создание вычислительного конвейера, используюго программное обеспечение с открытым исходным кодом для количественной оценки этого васкулогенного ответа. Этот конвейер специально разработан для сохранения 3D-архитектуры капиллярного сплетения для надежного определения количества ветвей, точек ветвления и общей длины сети с минимальным пользовательским входом.

Введение

Человеческие пупочные вены эндотелиальных клеток (HUVECs) и других основных типов эндотелиальных клеток были использованы в течение двух десятилетий для моделирования прорастания кровеносных сосудов и развития в пробирке¹. Такие сосудистые платформы обещают осветить молекулярные и тканевые механизмы сердечно-сосудистых заболеваний и могут представить физиологическое понимание развития примитивных сосудистых сетей^2,3. Хотя область сосудистого моделирования стала свидетелем значительных достижений, "золотой стандарт" анализ, который может количественно моделировать и оценивать физиологическое развитие сосудов остается неуловимым. Большинство опубликованных протоколов не адекватно резюмировать сосудистую нишу для поощрения формирования зрелых, функциональных кровеносных сосудов или не имеют метода количественного сравнения васкулогенного потенциала оцениваемых типов клеток в трех измерениях ( 3D).

Многие современные сосудистые модели ограничены в своей способности имитировать физиологическую сосудистую нишу. Один из наиболее часто используемых в пробирке платформ является желатиновый белок смеси основе трубки анализа. Кратко, HUVECs семя как одиночные клетки на тонком слое геля который consist of протеины собранные от внеклеточной матрицы саркомы murine (ECM); в течение одного-двух дней, HUVECs самостоятельно собирать сяпок в примитивные трубы⁴. Тем не менее, этот процесс происходит в двух измерениях (2D) и эндотелиальных клеток (ECs), используемых в этом исследовании не образуют закрытые, полые люмены, тем самым ограничивая физиологическое значение этих исследований. В последнее время, ECs и поддерживающие клетки (например, мезенхимальные стволовые клетки (MSC) и перициты) были совместно культивированы в 3D микросредах, которые имитируют волокнистую архитектуру родного ECM, такие как коллаген или фибринин гидрогели⁵. Для моделирования развития сосудов в этой микросреде, полимерные бусы, покрытые eCs, как правило, используются⁶. Добавление экзогенных факторов роста и/или факторов роста, выделяемых другими клетками, интерстилиально встроенными в гидрогель, может побудить ОР, покрывающие полимерные бусы, прорастать и сформировать один просвет; количество и диаметр ростков и сосудов могут быть вычислены. Тем не менее, эти ростки являются единственными и не образуют замкнутую, связанную сеть, как это видно в физиологических условиях и, таким образом, больше напоминает модель сосуды опухоли. Микрофлюидические устройства также были использованы для имитации сосудистой ниши и содействия образованию сосудов в EC-Ладена гидрогелей^7,8. Как правило, ангиогенный фактор роста градиент применяется к циркулирующей среде культуры клеток, чтобы вызвать миграцию ИК и прорастание. ЭК, составляющие просвет развитых сосудов, чувствительны к стрессу сдвига, вызванному применением потока жидкости через микрофлюидное устройство; таким образом, эти микрофлюидные устройства фиксируют ключевые физиологические параметры, которые не доступны в статических моделях. Однако эти устройства требуют дорогостоящих микрофабрикационных способностей.

Самое главное, все три сосудистые модели (2D, 3D, микрофлюидные) в подавляющем большинстве используют первичные ОР, а также первичные поддерживающие типы клеток. Первичные клетки не могут быть разработаны в эффективную сердечно-сосудистую терапию, потому что клетки породят иммунный ответ при имплантации; кроме того, HUVECs и аналогичные типы первичных клеток не являются конкретными для пациентов и не фиксируют сосудистые аномалии, которые возникают у пациентов с генетической предрасположенностью или уже существующими заболеваниями, например, сахарным диабетом. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) появились в последнее десятилетие в качестве пациента конкретных, пролиферативных клеток источника, которые могут быть дифференцированы во все соматические клетки в организме человека⁹. В частности, были опубликованы протоколы, в которых излагаются генерации и изоляции iPSC полученных эндотелиальных прародителей (iPSC-EPs)^10,11; iPSC-EPs являются бипотентными и поэтому могут быть дополнительно дифференцированы в эндотелиальные клетки и гладкие мышечные клетки/перициты, строительные блоки зрелой, функциональной сосуды. Только одно исследование убедительно подробно развитие первичного капиллярного сплетения от iPSC-EPs в 3D микросреде^12; хотя это исследование имеет решающее значение для понимания сборки iPSC-EP и дифференциации естественных и синтетических гидрогелей, оно не количественно сравнило сетевые топологии результирующей сосуды. Другое недавнее исследование использовало полимерную модель бисера для сравнения прорастания HUVECs и iPSC-производных ECs⁵. Таким образом, существует явная необходимость дальнейшего выяснения физических и химических сигнальных механизмов, которые регулируют iPSC-EP васкулогенез в 3D микросреде и определить, если эти клетки подходят для ишемической терапии и сердечно-сосудистых заболеваний Моделирования.

В последнее десятилетие были разработаны различные вычислительные трубопроводы с открытым исходным кодом и алгоритмы скелетизации для количественной оценки и сравнения длины и подключения сосудистой сети. Например, Charwat et al. разработали конвейер на основе Photoshop для извлечения фильтрованного, бинарного изображения сосудистых сетей, полученных из совместной культуры стволовых клеток, полученных из жировых стволовых клеток и экаторов в фибринной матрице^13,14. Возможно, наиболее широко используемым инструментом сравнения топологии является AngioTool, программа, опубликованная в Интернете Национальным институтом рака^15; несмотря на широкое распространение программы и хорошо документированную верность, программа ограничивается анализом судовых структур в двух измерениях и других программ, включая AngioSys и Wimasis, имеют одно и то же ограничение размерности¹⁶. Для анализа сетевой топологии микроваскулярии были разработаны мощные пакеты программного обеспечения, такие как Imaris, Lucis и Metamorph; однако эти пакеты являются непомерно затратными для большинства академических лабораторий и ограничивают доступ к исходному коду, что может помешать конечному пользователю настроить алгоритм под их конкретное приложение. 3D Slicer, с открытым исходным кодом магнитно-резонансной томографии / компьютерной томографии пакет, содержит сосудистого моделирования Toolkit, которые могут эффективно анализировать топологию 3D сосудистых сетей^17; однако, анализ зависит от пользователя, вручную размещающего конечные точки сети, которые могут стать утомительными при анализе большого набора данных и могут зависеть от подсознательных предубеждений пользователя. В этой рукописи подробно описан вычислительный конвейер, который может количественно очислить 3D сосудистые сети. Чтобы преодолеть вышеизложенные ограничения, этот вычислительный конвейер с открытым исходным кодом использует ImageJ для предварительного обработки приобретенных конфокальных изображений для загрузки 3D-объема в анализатор скелета. Анализатор скелета использует параллельный медиальная оси истончение алгоритма, и первоначально был разработан Kerschnitzki et al. для анализа длины и подключения остеоцитных сетей¹⁸; этот алгоритм может быть эффективно применен для характеристики длины и подключения инженерных микроваскулярности.

В целом, этот протокол описывает создание микрососудистых сетей в 3D микросреде и обеспечивает открытый исходный код и пользовательские предубеждения свободного вычислительного трубопровода, чтобы легко сравнить васкулогенный потенциал iPSC-EPs.

протокол

1. Подготовка культурных носителей и покрытий

1. Для приготовления раствора покрытия витромонектина разбавляют витромонектин 1:100 в фосфатно-буферном сольниковом растворе Dulbecco (DPBS).
   ВНИМАНИЕ: После разбавления не рекомендуется хранить это решение для использования в будущем.
2. После получения фенола без красного, фактор роста снижение желатиновой белковой смеси (см. Таблица материалов) от производителя, оттаивать на льду при 4 градусов по Цельсию, пока смесь не станет прозрачной и жидкости. Сохраняя смесь на льду в ламинарном капоте потока, пипетка 75 л. смеси в микроцентрифуге мощностью 1,8 мл и немедленно замерзает при -20 градусов по Цельсию. Эти aliquots могут храниться до одного года.
   ВНИМАНИЕ: Эта желатиновая белковая смесь становится очень вязкой при комнатной температуре и затвердевает при более высоких температурах. Держите этот раствор ледяным.
3. Чтобы подготовить эту смесь для покрытия, разморозить 75 л аликот на льду и разбавить 6 мл ледяной Dulbecco в модифицированных Eagle Medium: Питательная смесь F-12 (DMEM/F12). Этого подготовленного объема достаточно, чтобы покрыть 12 хорошо пластины.
4. Приготовьте 100 мг/мл бульонного раствора аскорбиновой кислоты магния-2-фосфата (белый лиофилизированный порошок) в ультрачистой воде, добавив 500 мг порошка до 5 мл воды в 10 мл стеклянного сцинтилляционного флакона. Агитировать с перемешивания бар, пока решение полностью прозрачным (это может занять до часа). Это решение может храниться при -20 градусов по Цельсию в течение одного года.
5. Создайте запас 10 мМ CHIR99021 (CHIR), растворив 10 мг лиофилизированного порошка в 1,9928 мл диметилсульфида (DMSO) в конической центрифуге 15 мл и прогрейтесь в 37-й ванне (или воде) до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Aliquot в 1,8 мл микроцентрифуговых труб и хранить при -20 градусов по Цельсию в течение одного года.
6. Создайте запас 10 мМ Y-27632, ингибитор ROCK (ROCKi), растворив 10 мг лиофилизированного порошка в 3,1225 мл диметилсульфида (DMSO) в 15 мл конической центрифуги трубки и теплой в 37 градусов по Цельсию (или воды) ванне до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Aliquot в 1,8 мл микроцентрифуговых труб и хранить при -20 градусов по Цельсию в течение одного года.
7. Для приготовления основных 8 (E8) средних, оттепель замороженные добавки, добавить в 500 мл бутылку базальной среды, и фильтр стерилизовать. Это решение может храниться при 4 градусах Цельсия в течение двух недель.
   ВНИМАНИЕ: Очень важно не нагревать эту среду при 37 градусах Цельсия, так как белки в средней формуле могут деградировать при длительном применении. Вместо этого, держать эту среду при комнатной температуре в течение 15 до 30 минут перед использованием.
8. Для подготовки сортировки буфера, добавить 1,33 мл 7,5% бычьего сыворотки альбумина (BSA) в DPBS и 200 л 0,5 мм этиленденедиаминететраатическая кислота (ЭДТА) до 48,5 мл DPBS для создания окончательного решения 0,5% BSA и 2 мМ EDTA.
9. Для приготовления LaSR Basal добавьте 300 л из 100 мг/мл аскорбиновой кислоты магния-2-фосфата и 5 мл GlutaMAX до 500 мл Advanced DMEM/F12. Это решение может храниться при 4 градусах Цельсия в течение одного месяца.
10. Для приготовления эндотелиальной клеточной среды роста Medium-2 (EGM-2), оттепели добавки и добавить к 500 мл бутылку базальной среды. Это решение может храниться при 4 градусах Цельсия в течение одного месяца.
11. Для приготовления блокирующего буфера добавьте 500 мг лиофильного сывороточки (BSA) и 50 л эмульгирующего реагента (см. Таблица материалов) до 48 мл DPBS. Инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение по крайней мере 15 минут, чтобы убедиться, что BSA не слипаются и впоследствии отделяются от раствора.

2. Оттачивание, техническое обслуживание и пропуск iPSCs

1. Перед оттаиванием криоконсервированного флакона iPSC покрасьте одну скважину из 6-колодца с 1 мл раствора витромонектина (подготовленного как описано в шаге 1.1). Инкубировать в течение одного ч при комнатной температуре. Не дайте этому покрытию воздуха высохнуть перед добавлением E8 среды на пластину.
2. Для размораживания iPSCs, получить криоконсервированный флакон iPSCs из его контейнера для хранения жидкого азота и оттепели при 37 градусов по Цельсию, пока небольшой кристалл льда остается. Тщательно (капля) перенесите содержимое оттаятого флакона в коническую центрифугу 15 мл, содержащую 8 мл ледяного DMEM/F12. Вымойте талой флакон с добавлением 1 мл ледяной DMEM/F12, чтобы свести к минимуму потерю клеток. Центрифуга в течение 5 мин при 300 х г.
3. В ожидании центрифуги, аспирировать раствор витронектина и добавить 1 мл среды E8 (подготовлены, как описано в шаге 1.6) к колодцу. Затем снимите супернатант DMEM/F12 с центрифуговой конической трубки и повторно подтяните гранулы в 1 мл среды E8. Перенесите клетки на недавно покрытую пластину, будучи уверенным, чтобы агитировать подвески, чтобы предотвратить колонии от слипания при посевной.
4. Существует, как правило, существенная гибель клеток после оттаивания. На следующее утро, удалить среду и заменить на свежий E8 среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Даже при оптимальных условиях, iPSCs, как правило, плохо оправиться от криоконсервации. Рекомендуется криоконсервировать почти конфлюент 6-ну для будущего посева в один 6-колодец. Наличие клеточного мусора является нормальным в течение первых 2-3 дней во время восстановления клеток.
5. Заменяйте среду E8 ежедневно, пока клетки не будут готовы к прохождению (70%-80% конфлюкс).
6. Для прохождения сначала подготовьте витрунектин-покрытые скважины (как описано в шаге 2.1).
   1. После того, как витрунектин покрытием скважины готовы (около 1 ч), аспир E8 среды из скважины, чтобы пройти и мыть дважды с 1 мл DPBS. Инкубировать с 1 мл 0,5 мм EDTA для 5-7 мин при 37 градусов по Цельсию. Во время инкубации удалите раствор витронектина с недавно покрытого колодца и замените 1-2 мл среды E8.
   2. Удалите раствор EDTA из скважин, чтобы пройти и отсоединить колонии, осторожно мыть один или два раза с 1 мл E8. Перенесите 75-200 л клеточной подвески в свежепокрытые E8-содержащие скважины, агитируют пластину, чтобы обеспечить равномерное покрытие, и поместите в инкубатор немедленно.
      ВНИМАНИЕ: Время инкубации для отслоения iPSC зависит от клеточной линии; рекомендуется, чтобы пользователь этого протокола тестировал ряд раз при достаточном расширении полученной/генерируемой линии iPSC. 75 ЗЛ клеточной суспензии обычно приводит к 4 дням между проходами; 150 кЛ или более приводит к 2-3 дней между проходами.

3. Поколение эндотелиальных прародителей iPSC (рисунок1).

1. При поддержании iPSCs, убедитесь, что колонии хорошо уплотняются и что Есть небольшое количество дифференцированных клеток в культуре. Если колонии начинают контактировать друг с другом, клетки, скорее всего, слишком сливочные и должны быть немедленно проходят.
2. Когда iPSCs 70%-80% слив, пальто 24-хорошо пластины с желатиновой белковой смеси (подготовлены, как описано в 1.2/1.3). Пипетка 250 л этой смеси в каждую скважину и держать в течение 1 ч при комнатной температуре.
3. Во время вышеуказанной инкубации 1-h, извлеките средство E8 и Y-27632 от холодильника и морозильника, соответственно. Как только E8 средний и Y-27632 достигнет комнатной температуры, подготовьте E8 и ROCKi, добавив 13 qL из 10 МКм Y-27632 до 13 мл E8 в 15 мл конической центрифуги трубки.
4. Удалите среду E8 из скважин iPSC, дважды промойте 1 мл DPBS, а затем инкубировать 0,5 мМ EDTA в течение 5-7 мин при 37 градусах Цельсия. После инкубационного периода, удалить ЭДТА и быстро стрижки клеток в одноклеточной подвески с P1000 пипетка отзыв с 1 мл E8 и ROCKi среды.
5. Подсчитайте клетки гемоситометром. Для подвески, которая может содержать миллионы iPSCs, добавьте 20 зл клеточной подвески до 180 злице трипан синего цвета. Определите количество клеток в одноклеточной подвеске.
6. Перенесите 0,432 x 10⁶ на 1,296 x 10⁶ ячеек (10⁴ х 3 х 10⁴ ячейки/см²⁾на оставшийся e8 и ROCKi medium. Удалите желатиновую смесь покрытия с недавно покрытием 12-наилучшим пластины и добавить 500 злицы клеточной подвески для каждой скважины, гарантируя, что клетки хорошо распределены и не образуют небольшие комки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот диапазон плотности является оптимальным для дифференциации положительных клеток CD34; однако, эти плотности посева зависят от линии клеток и, возможно, должны быть оптимизированы пользователем этого протокола.
7. После 24 ч культуры замените среду 500 л свежей среды E8. Инкубировать еще 24 ч при тех же условиях.
8. Удалите среду E8 и замените LaSR Basal, дополненный 6-12 мкм CHIR99021. Эта точка времени определяется как D0 дифференциации. После 24 ч культуры, заменить с той же среде культуры клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как описано ранее, количество CHIR99021, добавленного к этой среде, будет зависеть от использованной линии iPSC. Пожалуйста, проверьте диапазон концентраций CHIR99021, чтобы обеспечить оптимальные результаты.
9. После 48 ч инкубации с CHIR99021, заменить 1 мл Базала ЛаСР.
10. Замените среду ежедневно 2 мл Базала ЛаСР на 2-3 дополнительных дня. В этот момент времени (D5 дифференциации), значительная часть этих клеток будет выражать CD34 и может быть охарактеризована как эндотелиальных прародителей. Схема этого протокола изложена с репрезентативными результатами на рисунке 1 и описана в полном объеме следователями, которые впервые опубликовали этот метод ^11,19.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти эндотелиальные прародители могут быть дополнительно дифференцированы вдоль эндотелиальной линии (35%-99%) или гладкая мышечная линия (1%-65%). Эффективность дифференциации варьируется в зависимости от типа покрытия ECM и среды клеточной культуры, используемой во время дифференциации ^20.

4. FACS эндотелиальных прародителей

1. Перед тем, как разъединять дифференцированные ячейки D5/D6, подготовьте сортированный буфер, описанный в шаге 1.8, и держитесь на льду.
2. Инкубировать дифференцированные клетки с 250 qL раствора отслоения клетки в наилучшим образом (см. Таблицаматериалов) для 10 min на 37 C.
3. Разъедините клетки с наконечником пипетки P1000 в одноклеточной подвеске в растворе отслоения клеток. Консолидируйте смесь раствора отслоения клеток в конической центричной трубе 15 мл и центрифуге в течение 5 мин при 300 х г.
4. Удалите супернатант и приостановите в 200 году l ледяного сортировки буфера (подготовлено, как описано в шаге 1.7. Добавьте 5 qL концентрированного антитела CD34-PE к сортирующей буферной подвеске клетки и инкубируйте в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.
5. Повторно приостановить в 5 мл ледяной сортировки буфера. Фильтр эту подвеску через ячейку ситечко с крышкой 40 мкм перед размещением на сортировщике.
6. На соответствующем флуоресцентном канале сортируйте 10 000 клеток, которые не были помечены флуоресцентным антителом. Ворота области с высокой интенсивностью флуоресцентных, который не содержит ни одного из этих 10000 клеток(Рисунок 1D). Это будет служить негативным контролем.
7. Выполнить образец, содержащий iPSC-EPs помечены флуоресцентным раствором и начать сортировку. CD34 высоко выражен в этих эндотелиальных прародителях и легко отделяется от основной популяции. После сортировки перенесите раствор на коническую центрифугу мощностью 15 мл и центрифугу на 5 мин при 300 х г. Удалите супернатант.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если раствор находится в трубке больше, чем микроцентрифуговая трубка (например, проницаленная трубка 5 мл полистирола, обычно используемая во многих протоколах FACs), повторно приостанавливаетсить отсортированные клеточные гранулы в 1 мл сортировки буфера и перенесите это решение в микроцентрифуговую трубку. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин и удалить супернатант.
   1. Необязательно: если необходима дальнейшая характеристика iPSC-EP, добавьте другие первичные антитела (например, CD31-APC) одновременно с CD34-PE. Убедитесь, что перекрестный разговор между различными флуоресцентными каналами сведен к минимуму.

5. Инкапсуляция и долгосрочная культура гидрогелей коллагена iPSC-EP

1. Подготовка среды посева, добавив 40 л 10x среднего 199 до 400 л эндотелиальной среды роста (EGM-2) дополнены 10 МКм Y-27632 в 1,8 мл микроцентрифуга и место трубки на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как использование антибиотиков не рекомендуется для культуры стволовых клеток и поддержания дифференцированных клеток, дозировка с пером / Strep рекомендуется после сортировки, потому что трудно гарантировать бесплодие в среде сортировки (это больше императив, если сортатор распределяется между многими лабораториями).
2. Удалите все супернатанты из клеточной подвески и добавьте 200 зл EGM-2, дополненных 10 МКМ Y-27632. Перенесите суспензию клетки на среду посева и энергично перемешайте.
3. Добавьте 350 л коллагена в раствор, подготовленный в шаге 5.2 и хорошо перемешайте. Раствор станет бледно-желтым.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация коллагена может оказать значительное влияние на образование капиллярного сплетения. Этот протокол предполагает, что коллаген был поставлен на 10 мг/мл и что гидрогели имеют окончательную концентрацию 3,5 мг/мл. Отрегулируйте эти объемы для достижения их конечной концентрации коллагена; рекомендуется ограничить конечную концентрацию коллагена с 2 мг/мл до 4 мг/мл.
4. Добавьте 5 кл.л. 1М НаОХ к раствору, приготовленному в 5,3, и хорошо перемешайте, избегая введения пузырьков воздуха. Решение станет ярко-розовым.
5. Пипетка 56 л нейтрализованного коллагеново-клеточного раствора, приготовленного в 5,4 в отдельные скважины 96-хорошо ультра-низкой пластины культуры вложений U-bottom. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин. Перед добавлением носителей, убедитесь, что клетки были равномерно распределены путем изучения образцов с ярко-поля микроскоп.
6. Подготовьте 1 мл культурной среды, состоящей из EGM-2, дополненной 10 МКм Y-27632 и 50 нг/мл сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), добавив 1 л каждого запасного раствора в микроцентрифуговый фактор роста. После смешивания хорошо, пипетка 100 зл этой среде клеточной культуры на клетки груженых гидрогелей. Перенесите пластину на 37 градусов по Цельсию для долгосрочной культуры.
7. Заменить культуру среды ежедневно, добавив дополнительные ангиогенные факторы роста или малых ингибиторы молекулы, как продиктовано целью исследования. Для оптимального удаления носителей, наклоните пластину и используйте наконечник P100, чтобы мягко аспирировать среду, не нарушая гидрогеля.

6. Фиксация, иммуностоирование и визуализация сосудистых сетей на основе EP

1. После одной недели культуры добавьте 250 qL 4% параформальдегида (PFA) раствор азатем в 48-хорошую пластину. Заполните столько скважин, сколько гидрогелей. Удалить средство из гидрогелей (PFA) и использовать тонко йош тетизны для передачи гидрогелей ПФА, содержащих скважины. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре и удалить PFA путем быстрой промывания с PBS.
2. Permeabilize путем добавления 250 зЛ 0,5% от неионического сурфактанта (см. Таблица материалов) в течение 5 мин при комнатной температуре. Вымойте дважды с 250 Л Л PBS дополнены 300 мм глицин. Инкубировать при комнатной температуре по 5 мин для каждого шага стирки, чтобы обеспечить удаление избыточного моющего средства. Блок, погружая гидрогели в 250 л блокирующего буфера в течение 30 минут.
3. Инкубировать с желаемыми первичными антителами, разбавленными в блокирующем буфере на ночь при 4 градусах Цельсия. Например, если иммуностоина с фаллоидина и VE-кадерин, разбавить 1:40 и 1:200, соответственно, в блокирующем буфере.
4. На следующий день, удалить основной раствор антитела и мыть дважды с 0,5% эмульгирующий реагент в DPBS. Накройте алюминиевой фольгой и инкубируйте с видовыми вторичными антителами (например, 1:200 Alexa Fluor 488 в PBS) на 2 ч при комнатной температуре.
5. Удалить вторичный раствор антитела и мыть дважды с 0,5% эмульгирующий реагент в DPBS. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут для каждого шага стирки, чтобы обеспечить удаление свободных фторофоров.
6. Чтобы визуализировать ядра клеток, разбавить 4', 6-диамидино-2-фенилиноле (DAPI) 1:10000 в PBS и добавить в образец (ы).
   1. Инкубировать в течение 2 минут при комнатной температуре и дважды мыть PBS. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут для каждого шага стирки, чтобы обеспечить удаление свободных фторофоров.
7. Перенесите образцы на ангиогенез -Слайд или стеклянное нижнее блюдо Петри с помощью тонкого наконечником пинцета. Убедитесь, что никакие пузырьки воздуха не оказались в ловушке под гидрогелем.
8. Изображение на конфокальном микроскопе, приобретая z-стеки, которые простираются от нижней до верхней части образца. Убедитесь, что детектор не насыщен и что используется самое низкое увеличение (желательно большое поле зрения).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для будущей обработки убедитесь, что z-стеки сохраняются с минимальным сжатием (например, .czi).

7. Использование вычислительного конвейера для анализа и сравнения топологий сосудистой сети

1. Осмотрите каждый z-стек, чтобы убедиться, что ломтики содержат только сосуды. Откройте z-стек в ImageJ и повысить контраст, нажав на изображение Границы судна теперь четко разграничены, а фоновый уровень сведен к минимуму. Часто z-размеры не соответствуют размерам x/y. Чтобы исправить это, нажмите Изображение , нажмите изображение , отрегулируйте и измените количество z-срезов так, чтобы расстояние между каждым ломтиком эквивалентно одному пикселю в x/y. ImageJ будет интерполировать автоматически. Если этот шаг не выполняется должным образом, окончательные 3D тома будут отображаться сжатыми.
   ВНИМАНИЕ: ECs будет мигрировать к краям геля и будет образовывать небольшие колонии булыжника. Хотя они полезны для оценки границ гидрогеля, они будут мешать окончательному анализу изображений и должны быть удалены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ImageJ — это программное обеспечение для анализа изображений с открытым исходным кодом, разработанное совместно Национальными институтами здравоохранения и Лабораторией оптических и вычислительных приборов. Рекомендуется скачать Фиджи, который просто ImageJ в комплекте с полезными плагинами (https://fiji.sc/).
2. В ImageJ, размытие изображения в 3-измерения, нажав процесс ,gt; Фильтры , гауссианский Blur 3D, а затем установка значения сигмы во всех 3 измерениях до 2,0 (это значение, возможно, должны быть скорректированы конечным пользователем).
3. В ImageJ, нажмите Процесс (gt; Binary) и сделайте двоичный, а затем выберите подходящий алгоритм порога. Алгоритм порогового перекрестного энтропии, разработанный Li et al., эффективен в отделении судов от фона^21. Рассчитайте порог для каждого изображения и установите фон на "По умолчанию".
4. В ImageJ, удалить ложный шум и заполнить "дыры" в люменах, нажав процесс
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление "ярких" выбросов заполнит небольшие отверстия в соединенных сосудах; удаление "темных" выбросов позволит удалить мертвые клетки. Размер радиуса удаления будет варьироваться в зависимости от увеличения и размера судов. Для изображений, полученных с широкоугольной целью 512 x 512 пикселей, радиусы, как правило, варьируются от 4-6 пикселей.
5. Обработка всех необработанных (например, расширение czi) файлов и конвертировать в .tif файлы, прежде чем приступить к шагу 7.6. Для этой обработки к этой рукописи был прикреплен скрипт ImageJ "Binarize and Filter.ijm".
6. Сохраните обработанные файлы .tif в той же папке, что и файл "BatchProcessSkeleton.m", доступный для скачивания в рукописи. Этот сценарий, разработанный авторами, называет функции, опубликованные Филиппом Kollmannsberger²² и проводит некоторые дополнительные манипуляции файл.
7. Скачать и распаковать все файлы, связанные с двумя основными функциями "Skel2Graph3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) и "Skeleton3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d). Сохраните все функции в той же папке, что и открытый обработанный z-стек.
8. Откройте мультипарадигмическую численную вычислительную среду (см. таблицуматериалов) и перейдите к папке, где сохранены все файлы, описанные выше.
9. Выполнить "BatchProcessSkeleton.m" либо путем ввода BatchProcessSkeleton в окне команды или, открыв сценарий и нажав кнопку Run (правая зеленая стрелка) в редакторе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проанализировать большой набор данных с помощью одной команды, убедитесь, что строка внутри функции dir в строке 6 содержит звездочку (например, ''.tif'). В противном случае замените звездочку на имя файла, если пожелает проделать анализ одного файла.
10. Продолжительность времени, которое потребуется для выполнения этого скрипта, будет существенно отличаться в зависимости от имеющейся вычислительной мощности. Рекомендуется проводить этот анализ на компьютере с не менее 8 ГБ оперативной памяти, чтобы пользователь мог получить доступ к другим программам во время выполнения сценария.
    ВНИМАНИЕ: Хотя это и не является строго необходимым, график оригинального конфокального приобретения (в сером) и наложение с этой матрицы изображения с матрицей скелета (красным цветом) может помочь в оценке производительности алгоритма скелетизации. Кроме того, читатель может создать узловой график, реализованный Kollmannsberger et al., для оценки точности сетевого анализа. Создание обоих графиков, хотя и полезно, значительно увеличит время выполнения скрипта и потребует дополнительной памяти; если пользователь просто требует окончательного анализа топологии и не хочет визуализировать набор данных, просто прокомментировать строки 44 к 61 (скелетный график) и строки от 104 до 143 (топология график).
11. После завершения работы матрица данных, видимая в рабочем пространстве, теперь содержит обработанные данные. Дважды щелкните данные и откройте эту ячейку в редакторе Переменной.
    1. Обратите внимание, что эта матрица будет содержать, слева направо: 1) имя файла, 2) количество узлов (точки ветки и конечные точки), 3) точки ветви, 4) ссылки (т.е. сосуды), 5) длина сети (включая изолятные сосуды) и 6) количество ломтиков, содержащихся в z-стеке. Сохранить эти данные в виде файла .csv и экспортировать для дальнейшего анализа на любое программное обеспечение по своему выбору.

Результаты

После дифференциации(Рисунок 1), FACS и инкапсуляции iPSC-EPs в коллагеновых гидрогелях, клетки, как правило, остаются округлыми в течение 24 ч, прежде чем начать мигрировать и образуют начальные люмены. Примерно через 6 дней культуры, примитивное капиллярное с...

Обсуждение

Этот протокол включает в себя долгосрочную культуру клеток в трех типах носителей клеточной культуры: E8, LaSR Basal и EGM-2. Поэтому следует провести большую осторожность, чтобы надлежащим образом стерилизовать все материалы. Кроме того, лабораторные пальто и этинол-очищенные перчатки всегда...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	N/A	A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile	Corning	7007	Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	The base media for iPSC-EP differentiation.
Barnstead GenPure xCAD Plus	Thermo Fisher Scientific	50136165	Water purification system; others can be readily substituted
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture	Fisher Scientific	A8412	To preserve cell viability when FACs sorting
CD34-PE, human (clone: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs
CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg	VWR	354249	Main component of the 3D microenvironment
Conical centrifuge tubes (15/50 mL)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	To counterstain and visualize cell nuclei
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	ThermoFisher	14190-250	To wash monolayer cultures
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting
Endothelial Cell Growth Medium 2	PromoCell	C-22011	Promotes endothelial cell viability and proliferation
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	For maintenance of pluripotent stem cells
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT)	Sigma-Aldrich	50046	Neutralizes remaining detergent
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95%	Sigma-Aldrich	A8960	Component of iPSC-EP differentiation medium
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture)	Fisher Scientific	356231	Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation
Medium-199 10X	Thermo Fisher Scientific	1825015	Used to balance final hydrogel osmolarity and pH
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	VWR	87003-294	Stores small volumes of reagents
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	The main ingredient of the immunostaining solutions
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument
Recombinant Human VEGF 165 Protein	R&D Systems	293-VE	Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis
Rhodamine phalloidin	Themo Fisher Scientific	R415	To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks
Triton X-100 (nonionic surfactant)	Sigma-Aldrich	X-100	Detergent used to gently permeabilize cells
Tween-20 (emulsifying reagent)	Fisher Scientific	BP337	Increases the binding specificity of the added antibodies
VE-Cadherin (F-8)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989	To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels
Vitronectin	ThermoFisher	A14700	For maintenance of pluripotent stem cells
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded