iPSC 유래 내피 선조의 혈관 전위를 정량화하는 체외 3D 모델 및 전산 파이프라인

요약

유도 된 만능 줄기 세포에서 파생 된 내피 전구체 (iPSC-EP)는 심혈관 질환 치료에 혁명을 일으킬 잠재력을 가지고 있으며 보다 충실한 심혈관 질환 모델을 생성 할 수 있습니다. 본 명세서에서, 3차원(3D) 콜라겐 미세환경에서 iPSC-EP의 캡슐화 및 이들 세포의 혈관전위액의 정량적 분석이 기재되어 있다.

초록

유도된 만능 줄기 세포(iPSCs)는 임의의 체세포 유형으로 분화할 수 있는 환자 특이적, 증식성 세포 공급원이다. 성숙하고 기능적인 혈관을 조립하는 데 필요한 세포 유형으로 분화할 수 있는 이중내피 전구체(EP)는 배아 및 유도 만능 줄기 세포 모두에서 유래되었습니다. 그러나, 이 세포는 3차원 환경에서 엄격하게 평가되지 않았고, 그들의 혈관 전위도의 양적 측정은 애매하게 남아 있습니다. 여기서, 형광 활성화 세포 선별을 통한 iPSC-EP의 생성 및 격리가 먼저 설명되고, 그 다음에 콜라겐 하이드로겔에서 iPSC-EP의 캡슐화 및 배양에 대한 설명이 뒤따랐다. 이 세포외 매트릭스 (ECM)모방 미세 환경은 강력한 혈관 반응을 장려합니다. 혈관 네트워크는 배양의 주 후에 형성됩니다. 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 이러한 혈관 반응을 정량화하는 계산 파이프라인의 생성이 설명됩니다. 이 파이프라인은 모세관 신경총의 3D 아키텍처를 보존하여 최소한의 사용자 입력으로 분기, 분기 점 및 전체 네트워크 길이를 강력하게 식별하도록 설계되었습니다.

서문

인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVECs) 및 기타 1차 내피 세포 유형은 2년 동안 시험관내 혈관 발아및 발달을 모델링하기 위해 활용되어 왔다. 이러한 혈관 플랫폼은 심혈관 질환의 분자 및 조직 수준 메커니즘을 조명할 것을 약속하고 원시 혈관네트워크의 발달에 대한 생리학적 통찰력을 제시할 수 있다 2,^3. 혈관 모델링 분야는 상당한 발전을 목격했지만 생리학적 혈관 발달을 정량적으로 모델링하고 평가할 수 있는 "금 본위제" 분석은 여전히 애매합니다. 대부분의 출판된 프로토콜은 성숙하고 기능적인 혈관의 형성을 장려하기 위해 혈관 틈새 시장을 적절히 회수하지 못하거나 평가된 세포 유형의 혈관 전위를 3차원으로 정량적으로 비교하는 방법이 없는 경우( 3D).

많은 현재 혈관 모형은 생리적인 혈관 틈새시장을 모방하는 그들의 기능에 있는 제한됩니다. 시험관내 에서 가장 일반적으로 사용되는 것 중 하나는 젤라틴 단백질 혼합물 계 튜브 형성 분석이다. 간략하게, HUVECs는 뮤린 육종 세포 외 매트릭스 (ECM)에서 수확 한 단백질로 구성된 겔의 얇은 층에 단일 세포로 시드된다; 1 ~ 2 일 이내에 HUVECs는 원시 튜브^4로자체 조립됩니다. 그러나, 이러한 과정은 2차원(2D)과 이 분석법에서 활용되는 내피 세포(ECs)에서 발생하며, 이러한 연구의 생리학적 중요성을 제한함으로써 동봉된 중공 루멘을 형성하지 않는다. 보다 최근에는, ECs 및 지지 세포(예를 들어, 중간엽 줄기 세포(SC) 및 회구)는 콜라겐 또는 피브린 하이드로겔과 같은 네이티브 ECM의 섬유질 구조를 시뮬레이션하는3D 미세 환경에서 공동 배양되고 있다 5. 이러한 미세 환경의 혈관 발달을 모델링하기 위해, EC로 코팅된 중합체 비드는 전형적으로^6을채용한다. 하이드로겔에 간질적으로 내장된 다른 세포에 의해 분비되는 외인성 성장 인자 및/또는 성장 인자의 첨가는 ECs를 유도할 수 있고, 중합체 비드를 코팅하고, 싹트고 단일 루멘을 형성할 수 있다; 그런 다음 새싹과 용기의 수와 직경을 계산할 수 있습니다. 그러나, 이러한 새싹은 단수이며 생리학적 조건에서 볼 수 있듯이 동봉된 연결된 네트워크를 형성하지 않으므로 종양 혈관 구조 모델을 연상시킵니다. 미세유체 장치는 또한 혈관 틈새 시장을 모방하고 EC-라덴 하이드로겔^7,8에서혈관 구조의 형성을 촉진하기 위해 활용되었다. 전형적으로, 혈관신생 성장 인자-구배는 순환 세포 배양 배지에 적용되어 EC 이동 및 발아를 유도한다. 개발된 용기의 루멘을 구성하는 ECs는 미세유체 장치를 통한 유체 흐름의 적용에 의해 유도된 전단 응력에 민감하며; 따라서 이러한 미세 유체 장치는 정적 모델에서 액세스할 수 없는 주요 생리학적 매개 변수를 캡처합니다. 그러나 이러한 장치는 비용이 많이 드는 미세 제작 능력이 필요합니다.

가장 중요한 것은, 세 가지 혈관 모델(2D, 3D, 미세유체)이 1차 EC뿐만 아니라 1차 지지 세포 유형을 압도적으로 활용했다는 것입니다. 세포가 이식시 면역 반응을 일으키기 때문에 1 차적인 세포는 효과적인 심장 혈관 치료로 발전될 수 없습니다; 더욱이, HUVECs 및 유사한 1 차적인 세포 모형은 환자 특정하지 않으며 유전 처리 또는 기존 건강 상태, 예를 들면, 당뇨병 mellitus를 가진 환자에서 생기는 혈관 이상을 포착하지 않습니다. 유도된 만능 줄기세포(iPSCs)는 지난 10년간 인체내의 모든 체세포로 분화될 수 있는 환자 특이적, 증식성 세포 공급원으로 나타났다. 특히, iPSC 유래 내피 선조(iPSC-EP)의 생성 및 격리를 설명하는 프로토콜이 10,^11; iPSC-EP는 이중성이며, 따라서, 성숙하고 기능적인 혈관구조의 빌딩 블록인 내피 세포와 평활근 세포/회핵세포로 더욱 분화될 수 있다. 단 하나의 연구는 설득력 3D 미세 환경^12에서iPSC-EP에서 기본 모세관 신경총의 개발을 상세히했다; 본 연구는 iPSC-EP 어셈블리의 이해와 천연 및 합성 하이드로겔의 분화에 매우 중요하지만, 생성된 혈관구조의 네트워크 와 사과를 정량적으로 비교하지는 않았다. 또 다른 최근 연구는 HUVECs 및 iPSC 유래 ECs5의 발아를 비교하기 위해 폴리머 비드 모델을 사용했다. 따라서 3D 미세 환경에서 iPSC-EP 혈관 발생을 조절하는 물리적 및 화학적 신호 메커니즘을 더 명확히 밝히고 이러한 세포가 허혈성 치료 및 심혈관 질환에 적합한지 여부를 결정할 필요가 있습니다. 모델링.

지난 10년 동안 혈관 네트워크 길이와 연결을 정량화하고 비교하기 위해 다양한 오픈 소스 계산 파이프라인과 스켈레톤 알고리즘이 개발되었습니다. 예를 들어, Charwat 등은 피브린 매트릭스^13,14에서지방 유래 줄기 세포 및 아웃성장 EC의 공동 배양으로부터 유래된 혈관 네트워크의 필터링된 이불화 이미지를 추출하는 포토샵 기반 파이프라인을 개발하였다. 아마도 가장 널리 사용되는 토폴로지 비교 도구는 AngioTool, 국립 암 연구소에 의해 온라인으로 출판 된 프로그램입니다^15; 프로그램의 광범위한 채택과 잘 문서화 된 충실도에도 불구하고,이 프로그램은 AngioSys 및 Wimasis를 포함한 두 가지 차원의 선박과 같은 구조를 분석하는 것으로 제한되며 동일한 차원 제한^16을공유합니다. Imaris, Lucis 및 변형과 같은 강력한 소프트웨어 제품군은 엔지니어링 된 미세 혈관 구조의 네트워크 토폴로지를 분석하기 위해 개발되었습니다. 그러나 이러한 제품군은 대부분의 학술 실습에서 비용이 많이 들며 소스 코드에 대한 액세스를 제한하므로 최종 사용자가 특정 응용 프로그램에 맞게 알고리즘을 사용자 지정하는 데 방해가 될 수 있습니다. 3D 슬라이서, 오픈 소스 자기 공명 영상 / 컴퓨터 단층 촬영 패키지, 효과적으로 3D 혈관 네트워크의 토폴로지를 분석 할 수있는 혈관 모델링 도구 키트를 포함^(17; 그러나 분석은 사용자가 네트워크의 끝점을 수동으로 배치하는 데 의존하며, 이는 큰 데이터 집합을 분석할 때 지루해질 수 있으며 사용자의 잠재 의식 편향에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 이 원고에서는 3D 혈관 네트워크를 정량화할 수 있는 계산 파이프라인을 자세히 설명합니다. 위에서 설명한 한계를 극복하기 위해 이 오픈 소스 계산 파이프라인은 ImageJ를 활용하여 획득한 공초점 이미지를 사전 처리하여 3D 볼륨을 스켈레톤 분석기로 로드합니다. 상기 골격 분석기는 병렬 내측축 숱이 알고리즘을 사용하며, 원래 Kerschnitzki 등에서 개발하여 골혈구망(18)의 길이 및 연결을 분석한다. 이 알고리즘은 엔지니어링 된 미세 혈관 구조의 길이와 연결을 특성화하기 위해 효과적으로 적용 될 수 있습니다.

이 프로토콜은 3D 미세 환경에서 미세 혈관 네트워크의 생성을 간략하게 설명하고 iPSC-EP의 혈관 전위를 쉽게 비교할 수 있는 오픈 소스 및 사용자 편향 없는 계산 파이프라인을 제공합니다.

프로토콜

1. 배양 배지 및 코팅 솔루션 의 준비

1. 비트로넥틴 코팅 용액을 준비하려면, 덜베코의 인산완충식염수(DPBS)에서 비트로넥틴 1:100을 희석합니다.
   주의: 희석후에는 나중에 사용할 수 있도록 이 솔루션을 보관하지 않는 것이 좋습니다.
2. 페놀을 적색으로 받으면, 성장 인자 감소 젤라틴 단백질 혼합물(재료 표참조)을 제조업체로부터 받은 후, 혼합물이 투명하고 유체가 될 때까지 4°C에서 얼음을 해동한다. 혼합물을 층류 후드에 얼음 위에 유지시키고, 혼합물의 피펫 75 μL을 1.8 mL 마이크로원심지 튜브에 넣고 즉시 -20°C에서 동결한다. 이 알리쿼트는 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.
   주의: 이 젤라틴 단백질 혼합물은 실온에서 보관할 때 매우 점성이 있으며 더 높은 온도에서 굳어질 것입니다. 이 용액을 얼음으로 차갑게 유지하십시오.
3. 코팅을 위해 이 혼합물을 준비하려면 얼음 에 75 μL aliquot를 녹이고 얼음 차가운 덜베코의 변형 된 독수리 매체 6 mL로 희석하십시오 : 영양소 혼합물 F-12 (DMEM / F12). 이 준비된 부피는 12개의 웰 플레이트를 코팅하기에 충분하다.
4. 아스코르브산 마그네슘-2-인산염(백색 호색애 분말)의 100 mg/mL 스톡 용액을 10 mL 유리 송신 바이알에 5 mL의 물에 500 mg의 분말을 첨가하여 초순수에 준비합니다. 용액이 완전히 투명할 때까지 교반막대로 교반합니다(최대 1시간이 걸릴 수 있음). 이 용액은 최대 1 년 동안 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.
5. 15 mL 원추형 원심분리튜브에 1.9928 mL의 디메틸 설폭소(DMSO)에 10 mg의 효조용 분말을 용해시켜 37°C 비드(또는 물) 욕조에서 따뜻하게 하여 10mMM 스톡을 만듭니다. Aliquot를 1.8 mL 마이크로 원심 분리튜브에 넣고 -20°C에서 최대 1년 동안 보관합니다.
6. 10 mM 의 Y-27632, ROCK 억제제 (ROCKi)의 10 mM 스톡을 생성하고, 용액이 투명해질 때까지 15 mL 원소 원심 분리관에서 3.1225 mL의 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 10 mg의 효용 분말을 용해시키고 37 °C 의 콩 (또는 물) 욕조에서 따뜻하게 합니다. Aliquot를 1.8 mL 마이크로 원심 분리튜브에 넣고 -20°C에서 최대 1년 동안 보관합니다.
7. Essential 8(E8) 매체를 준비하려면 냉동 보충제를 해동하고 기저 배지 500 mL 병에 넣고 필터멸균을 넣으세요. 이 용액은 최대 2 주 동안 4 °C에서 보관할 수 있습니다.
   주의: 배지 의 단백질이 장기간 사용시 저하될 수 있으므로 이 배지를 37°C에서 따뜻하게 하지 않는 것이 매우 중요합니다. 대신, 사용하기 전에 15-30 분 동안 실온에서이 매체를 유지하십시오.
8. 선별 버퍼를 준비하려면 DPBS에 7.5% 소 혈청 알부민(BSA)의 1.33 mL을 추가하고 0.5 mM의 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)에 200 μL을 추가하여 DPBS의 48.5 mL에 0.5% BSA 및 2 mMEdTA의 최종 용액을 생성합니다.
9. LaSR 기저부를 준비하려면 100 mg/mL 아스코르브산 마그네슘-2-인산염 300 μL과 글루타맥스 5 mL를 고급 DMEM/F12 500 mL에 추가하십시오. 이 용액은 최대 1 개월 동안 4 °C에서 보관할 수 있습니다.
10. 내피 세포 성장 배지-2 (EGM-2)를 준비 하려면, 보충 교재를 해동 하 고 기초 매체의 500 mL 병에 추가. 이 용액은 최대 1 개월 동안 4 °C에서 보관할 수 있습니다.
11. 차단 버퍼를 준비하려면, 500 mg의 동포소 혈청 알부민(BSA)과 유화 시약 50 μL을 DPBS 48 mL에 추가합니다. BSA가 뭉치지 않고 이어서 용액으로부터 분리되지 않도록 하기 위해 적어도 15분 동안 37°C에서 배양한다.

2. iPSCs의 해동, 유지 보수 및 통과

1. 냉동 보존 된 iPSC 바이알을 해동하기 전에, 1 mL의 vitronectin 용액 (단계 1.1에 기재된 대로 제조)으로 6 웰 플레이트의 단일 웰을 코팅합니다. 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 접시에 E8 배지를 추가하기 전에 이 코팅을 공기건조시키지 마십시오.
2. iPSC를 해동하려면 액체 질소 저장 용기에서 iPSCs의 극저온 바이알을 회수하고 얼음의 작은 결정이 남아있을 때까지 37 °C에서 해동하십시오. 해동 바이알의 함량을 8 mL의 얼음 차가운 DMEM/F12를 포함하는 15 mL 원추형 원심분리관으로 조심스럽게 전달합니다. 해동된 바이알을 1mL의 얼음-차가운 DMEM/F12를 추가하여 세척하여 세포 손실을 최소화합니다. 원심분리기 300 x g에서5 분.
3. 원심분리기를 기다리는 동안, 비트로넥틴 용액을 흡인하고 E8 배지 1 mL(단계 1.6에 기재된 대로 제조)을 웰에 첨가한다. 그런 다음 원심 분리 된 원심 튜브에서 DMEM / F12 상급자를 제거하고 E8 배지의 1 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 새로 코팅 된 플레이트에 세포를 전송, 파종 시 응집에서 식민지를 방지하기 위해 현탁액을 교반해야합니다.
4. 해동 후 일반적으로 상당한 세포 사멸이 있습니다. 다음날 아침, 매체를 제거하고 신선한 E8 매체로 교체하십시오.
   참고: 최적의 조건에서도 iPSC는 동결 보존에서 제대로 회복되지 않는 경향이 있습니다. 그것은 하나의 6 웰에 미래의 파종을 위해 거의 수렴 6 웰을 냉동 보존하는 것이 좋습니다. 세포 파편의 존재는 세포 회복 중 처음 2-3 일 동안 정상입니다.
5. 세포가 통과 할 준비가 될 때까지 매일 E8 배지를 교체하십시오 (70 %-80 % 동률).
6. 통과하려면 먼저 vitronectin 코팅 된 우물을 준비하십시오 (단계 2.1에 설명된 대로).
   1. 일단 vitronectin 코팅 된 우물은 준비 (약 1 시간), 잘에서 E8 배지를 흡인하고 DPBS의 1 mL로 두 번 세척한다. 37°C에서 5-7분 동안 0.5 mM EDTA의 1 mL로 배양합니다. 배양하는 동안, 새로 코팅된 우물에서 비트로넥틴 용액을 제거하고 E8 배지의 1-2 mL로 대체한다.
   2. 통로가 될 우물에서 EDTA 용액을 제거하고 E8의 1 mL로 한 두 번 부드럽게 세척하여 식민지를 분리하십시오. 75-200 μL의 셀 서스펜션을 갓 코팅된 E8 함유 웰로 옮기고, 균일한 커버리지를 보장하기 위해 플레이트를 교반하고, 인큐베이터에 즉시 놓는다.
      주의: iPSC 분리에 대한 인큐베이션 시간은 세포주 의존적입니다. 이 프로토콜의 사용자는 수신/생성된 iPSC 회선을 충분히 확장할 때 범위를 테스트하는 것이 좋습니다. 75 μL의 세포 현탁액은 일반적으로 대강 사이의 4 일; 150 μL 이상은 구절 사이에 2-3 일 이르게.

3. iPSC 유래 내피 선조의 생성 (그림1).

1. iPSCs를 유지할 때, 식민지가 잘 압축되어 있고 배양에서 분화 된 세포의 수가 적다는 것을 확인하십시오. 식민지가 서로 접촉하기 시작하면 세포는 너무 부유할 가능성이 높으며 즉시 통과해야합니다.
2. iPSCs가 70%-80% 동점일 때, 젤라틴 단백질 혼합물(1.2/1.3에 기재된 대로 제조)으로 24웰 플레이트를 코팅합니다. 이 혼합물의 피펫 250 μL을 각 우물에 넣고 실온에서 1 시간 동안 유지하십시오.
3. 상기 1-h 배양 동안, 냉장고 및 냉동고로부터 E8 배지 및 Y-27632를 각각 제거한다. E8 배지와 Y-27632가 실온에 도달하면 15 mL 원엽 원심 분리튜브에 E8의 10 μM Y-27632 ~ 13 mL을 추가하여 E8 + ROCKi를 준비합니다.
4. iPSC 웰에서 E8 배지를 제거하고 DPBS 1 mL로 두 번 씻은 다음 37 °C에서 5-7 분 동안 0.5 mM EDTA로 배양하십시오. 잠복기 후, EDTA를 제거하고 E8 + ROCKi 배지의 1 mL로 P1000 파이펫 팁으로 세포를 단일 세포 현탁액으로 빠르게 전단한다.
5. 혈세포계로 세포를 계산합니다. 수백만 개의 iPSC를 함유할 수 있는 현탁액의 경우, 트립판 블루의 180 μL에 20 μL의 셀 서스펜션을 추가하십시오. 단일 셀 현탁액의 총 셀 수를 결정합니다.
6. 0.432 x 10⁶ ~ 1.296 x 10⁶ 셀 (10⁴ ~ 3 x 10^{4 셀} /cm2)을 나머지 E8 + ROCKi 배지로 옮니다. 새로 코팅된 12웰 플레이트에서 젤라틴 혼합물 코팅을 제거하고 각 웰에 500 μL의 셀 현탁액을 추가하여 세포가 잘 분포되어 있고 작은 덩어리를 형성하지 않도록 합니다.
   참고 : 밀도의이 범위는 CD34 양성 세포의 분화에 최적입니다; 그러나 이러한 시드 밀도는 세포주의존적이며 이 프로토콜의 사용자에 의해 최적화되어야 할 수도 있습니다.
7. 배양 24시간 후, 배지를 500 μL의 신선한 E8 배지로 교체하십시오. 동일한 조건에서 추가로 24 시간 동안 배양하십시오.
8. E8 배지를 제거하고 CHIR99021의 6-12 μM으로 보충된 LaSR 기저부로 교체하십시오. 이 타임포인트는 차별화의 D0로 정의됩니다. 배양 24시간 후, 동일한 세포 배양 배지로 교체한다.
   참고: 앞에서 설명한 바와 같이, 이 배지에 추가된 CHIR99021의 양은 활용되는 iPSC 라인에 따라 달라집니다. 최적의 결과를 보장하기 위해 CHIR99021 농도의 범위를 테스트하십시오.
9. CHIR99021로 48 시간 의 인큐베이션 후, LaSR 기저병 1 mL로 교체하십시오.
10. 매일 2 mL의 LaSR 기저병으로 2-3 일 동안 교체하십시오. 이 시점에서(D5 분화의), 이들 세포의 상당 수는 CD34를 발현하고 내피 전구로서 특징지어질 수 있다. 이 프로토콜의 회로도는 도 1의 대표적인 결과로 설명되고 이 방법을 처음 공표한 조사자들에 의해 전체적으로 기술된다 ^11,19.
    참고 : 이러한 내피 선조는 내피 혈통 (35 %-99 %)을 따라 더 분화 될 수 있습니다. 또는 평활근 혈통 (1%-65%). 분화 효율은 분화 시 사용되는 ECM 코팅 및 세포 배양 배지의 종류에 따라 달라지다.

4. 내피 선조의 FACS

1. D5/D6 분화 세포를 해리하기 전에 1.8단계에서 설명한 대로 정렬 버퍼를 준비하고 얼음을 유지합니다.
2. 37°C에서 10분 동안 잘 당 250 μL의 세포 분리 용액으로 분화 된 세포를 배양합니다.(재료 표참조).
3. P1000 파이펫 팁으로 셀을 세포 분리 용액의 단일 셀 현탁액으로 분리합니다. 세포 분리 용액 혼합물을 15 mL 원추형 원심분리관 및 원심분리기에서 300 x g에서5분 동안 통합한다.
4. 상급체를 제거하고 200 μL의 얼음-차가운 선별 버퍼(단계 1.7에 기재됨)에서 재중단한다. 농축된 CD34-PE 항체의 5 μL을 세포 선별 완충액에 넣고 4°C에서 10분 동안 배양한다.
5. 얼음 냉간 선별 버퍼 5mL에서 다시 일시 중단합니다. 선별기에 놓기 전에 40 μm 캡으로 셀 스트레이너를 통해 이 현탁액을 필터링합니다.
6. 적절한 형광 채널에서 형광 항체로 표지되지 않은 10,000개의 세포를 분류합니다. 이들 10,000개의 세포 중 어느 것을 포함하지 않는 높은 형광강도로 영역을 게이트(도 1D). 이것은 부정적인 제어역할을 합니다.
7. 형광 액으로 표지된 iPSC-EP가 포함된 샘플을 실행하고 정렬을 시작합니다. CD34는 이러한 내피 선조에서 고도로 발현되며 주요 집단으로부터 쉽게 분리된다. 선별 후 용액을 15 mL 원유 원심분리기 튜브및 원심분리기로 5분 동안 300 x g로 옮긴다. 상급체를 제거합니다.
   참고 : 용액이 마이크로 원심 분리 튜브 (예 : 많은 FACs 프로토콜에 일반적으로 사용되는 5 mL 폴리스티렌 튜브)보다 큰 튜브에 있는 경우, 정렬 된 세포 펠릿을 선별 버퍼의 1 mL에서 다시 중단하고이 솔루션을 마이크로 원심 분리 튜브로 옮김을 옮긴다. 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 상류를 제거하십시오.
   1. 선택 사항: 추가iPSC-EP 특성화가 필요한 경우, CD34-PE와 동시에 다른 1차 항체(예: CD31-APC)를 추가합니다. 서로 다른 형광 채널 간의 누화가 최소화되었는지 확인합니다.

5. iPSC-EP-라덴 콜라겐 하이드로겔의 캡슐화 및 장기 배양

1. 1.8 mL 의 미세 원심 분리기에 10 μM Y-27632로 보충된 내피 성장 배지(EGM-2)의 10x medium 10μL을 40 μL을 첨가하여 파종 배지를 얼음 위에 놓습니다.
   참고 : 항생제의 사용은 줄기 세포 배양 및 분화 세포의 유지 보수에 대한 권장되지만, 분류 환경에서 불임을 보장하기 어렵기 때문에 Pen / Strep으로 투여하는 것이 좋습니다 (이것은 더 많은 것입니다. 선별기를 많은 실험실 간에 공유하는 경우 필수적입니다)
2. 세포 현탁액에서 모든 상급체를 제거하고 10 μM Y-27632로 보충된 EGM-2의 200 μL을 첨가합니다. 세포 현탁액을 시딩 배지로 옮기고 활발하게 혼합합니다.
3. 5.2단계에서 제조된 용액에 350 μL의 콜라겐을 넣고 잘 섞습니다. 용액은 옅은 노란색이 됩니다.
   참고 : 콜라겐의 최종 농도는 모세관 신경총의 형성에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 이 프로토콜은 콜라겐이 10 mg/mL로 공급되었고 하이드로겔의 최종 농도가 3.5 mg/mL라고 가정합니다. 그들의 최종 콜라겐 농도 달성 하기 위해 이러한 볼륨을 조정; 최종 콜라겐 농도를 2 mg/mL에서 4 mg/mL로 제한하는 것이 좋습니다.
4. 5.3에서 제조된 용액에 5 μL의 1M NaOH를 추가하고 기포의 도입을 피하면서 잘 섞습니다. 해결책은 밝은 분홍색이 될 것입니다.
5. 5.4에서 제조된 중화된 콜라겐 세포 용액의 피펫 56 μL은 96웰 초저 부착 U-bottom 세포 배양 플레이트의 개별 웰로 제조하였다. 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 매체를 추가하기 전에, 세포가 밝은 필드 현미경으로 견본을 검토해서 고르게 분포되었는지 확인하십시오.
6. 10 μM Y-27632 및 50 ng/mL 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로 보충된 EGM-2로 구성된 배양 배지 1 mL을 미세 원심분리튜브에 각 스톡 용액의 1 μL을 첨가하여 준비합니다. 잘 혼합한 후, 이 세포 배양 배지의 피펫 100 μL을 세포-라덴 하이드로겔 상에 혼합하였다. 장기 배양을 위해 플레이트를 37°C로 옮깁니다.
7. 매일 배양 배지를 대체하고, 연구의 목적에 의해 지시된 바와 같이 추가적인 혈관신생 성장 인자 또는 소분자 억제제들을 추가한다. 매체를 최적으로 제거하려면 플레이트를 기울이고 P100 팁을 사용하여 하이드로겔을 방해하지 않고 매체를 부드럽게 흡인합니다.

6. EP 기반 혈관 네트워크의 고정, 면역 염색 및 시각화

1. 배양 1주일 후, 48웰 플레이트에 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액 250 μL을 첨가하였다. 하이드로겔이 있는 만큼 우물을 채우자. 하이드로겔(PFA)에서 배지를 제거하고 미세 기울어진 핀셋을 사용하여 하이드로겔을 함유된 웰로 PFA로 옮니다. 실온에서 10분 동안 배양하고 PBS로 빠르게 세척하여 PFA를 제거합니다.
2. 실온에서 5분 동안 250 μL의 요온 계면활성제(재료 표참조)를 첨가하여 투과한다. 300 mM 글리신으로 보충된 PBS 250 μL로 두 번 씻으소서. 여분의 세제의 제거를 보장하기 위해 각 세척 단계에 대해 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 하이드로겔을 블로킹 버퍼의 250 μL에서 30분 동안 침지하여 차단합니다.
3. 원하는 원발성 항체를 4°C에서 하룻밤 동안 차단 완충액으로 희석하여 배양한다. 예를 들어, 파할로이드와 VE-카데린으로 면역 염색을 하면 각각 1:40 및 1:200을 블로킹 버퍼에서 희석시다.
4. 다음날, 1차 항체 용액을 제거하고 DPBS에서 0.5% 유화 시약으로 2회 세척한다. 알루미늄 호일로 덮고 종 별 이차 항체 (예 : 1 : 200 Alexa Fluor 488 PBS)로 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.
5. 이차 항체 용액을 제거하고 DPBS에서 0.5 % 유화 시약으로 두 번 씻어. 자유 형광단의 제거를 보장하기 위해 각 세척 단계마다 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
6. 세포 핵을 시각화하려면, 4', 6-디아미디노-2-페니린들(DAPI) 1:10000을 PBS에서 희석시키고 샘플에 첨가한다.
   1. 실온에서 2 분 동안 배양하고 PBS로 두 번 씻으하십시오. 자유 형광단의 제거를 보장하기 위해 각 세척 단계마다 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
7. 미세 팁 핀셋을 사용하여 혈관 신생 μ-Slide 또는 유리 바닥 페트리 접시에 샘플을 전송합니다. 하이드로겔 아래에 기포가 끼어 있지 않은지 확인합니다.
8. 샘플의 아래에서 위쪽으로 확장되는 z-stack을 획득하여 공초점 현미경상의 이미지. 검출기가 포화되지 않았는지, 사용 가능한 가장 낮은 배율이 사용 중인지 확인합니다(넓은 시야각이 바람직함).
   참고: 향후 처리를 위해 z-스택이 최소한의 압축(예: .czi)으로 저장되었는지 확인합니다.

7. 전산 파이프라인을 사용하여 혈관 네트워크 토폴로지 분석 및 비교

1. 각 z-stack을 검사하여 슬라이스에 용기만 포함되어 있는지 확인합니다. ImageJ에서 z 스택을 열고 이미지 > 조정 > 밝기/콘트라스트를클릭하여 대비를 향상시킵니다. 이제 선박 테두리가 명확하게 구분되고 배경 수준이 최소화됩니다. z 차원이 x/y 치수와 일치하지 않는 경우가 많습니다. 이를 수정하려면 이미지 > adjust > 크기를 클릭하고 z-slices 수를 변경하여 각 슬라이스 사이의 거리가 x/y의 한 픽셀과 동일하도록 ImageJ가 자동으로 보간되도록 합니다. 이 단계가 제대로 수행되지 않으면 최종 3D 볼륨이 압축된 것처럼 나타납니다.
   주의: 전자는 젤의 가장자리쪽으로 이동하고 작은 조약돌 식민지를 형성합니다. 하이드로겔의 경계를 추정하는 데 유용하지만 최종 이미지 분석을 방해하므로 삭제해야 합니다.
   참고 : ImageJ는 국립 보건원과 광학 및 전산 계측 연구소가 공동으로 개발 한 자바 기반의 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어입니다. 그것은 피지를 다운로드 하는 것이 좋습니다., 단순히 ImageJ 유용한 플러그인번들 (https://fiji.sc/).
2. ImageJ에서 3차원에서 이미지를 흐리게 하여 프로세스 > 필터 > 가우시안 흐림 효과 3D를 클릭한 다음 3차원의 시그마 값을 모두 2.0으로 설정합니다(최종 사용자가 이 값을 조정해야 할 수 있음).
3. ImageJ에서 프로세스 > 바이너리 > 바이너리 만들기를 클릭한 다음 적절한 임계값 알고리즘을 선택합니다. Li et al.에 의해 개발된 교차 엔트로피 임계값 알고리즘은 배경^21로부터혈관을 분리하는 데 효과적이다. 각 이미지의 임계값을 계산하고 배경을 "기본값"으로 설정합니다.
4. ImageJ에서 스퓨리어스 노이즈를 제거하고 프로세스 > 노이즈 > 이상값제거를 클릭하여 루멘의 "구멍"을 입력합니다.
   참고 : "밝은"이상값을 제거하면 연결된 용기의 작은 구멍이 채워집니다. "어두운" 이상값을 제거하면 죽은 셀이 제거됩니다. 제거 반경의 크기는 용기의 배율과 크기에 따라 달라집니다. 512 x 512 픽셀의 광시야 대물렌즈로 획득한 이미지의 경우 반지름은 일반적으로 4~6픽셀입니다.
5. 모든 원시(예: czi 확장자) 파일을 처리하고 7.6 단계로 진행하기 전에 .tif 파일로 변환합니다. 이 처리를 돕기 위해 이 원고에 ImageJ 스크립트인 "binarize 및 Filter.ijm"이 첨부되었습니다.
6. 처리된 .tif 파일을 원고에서 다운로드할 수 있는 파일 "BatchProcessSkeleton.m"과 동일한 폴더에 저장합니다. 저자에 의해 개발 된이 스크립트는 필립 콜만스 버거^(22)에 의해 게시 된 기능을 호출하고 몇 가지 추가 파일 조작을 수행한다.
7. 다운로드 및 두 가지 주요 기능 "Skel2Graph3D"(https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) 및 "Skeleton3D"(https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d)와 관련된 모든 파일의 압축을 해제합니다. 열린 처리 된 z-스택과 동일한 폴더에 모든 함수를 저장합니다.
8. 다중 패러다임 수치 컴퓨팅 환경을 열고(재료 표참조) 위에서 설명한 모든 파일이 저장된 폴더로 이동합니다.
9. 명령 창에 BatchProcessSkeleton을 입력하거나 스크립트를 열고 편집기에서 실행 단추(오른쪽 녹색 화살표)를 눌러 "BatchProcessSkeleton.m"을 실행합니다.
   참고: 단일 명령으로 큰 데이터 집합을 분석하려면 6줄의 dir 함수 안에 별표(예: '*.tif')가 포함되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않으면 단일 파일의 분석을 원하는 경우 별표를 파일 이름으로 바꿉니다.
10. 이 스크립트를 실행하는 데 걸리는 시간은 사용 가능한 컴퓨팅 성능에 따라 크게 달라집니다. 스크립트가 실행되는 동안 사용자가 다른 프로그램에 액세스할 수 있도록 RAM이 8GB 이상인 컴퓨터에서 이 분석을 수행하는 것이 좋습니다.
    주의: 반드시 필요한 것은 아니지만 원래 공초점 획득(회색)을 그래프로 표시하고 이 이미지 매트릭스를 스켈레톤 행렬(빨간색)으로 오버레이하면 스켈레톤 알고리즘의 성능을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 리더는 네트워크 분석의 정확성을 평가하기 위해 Kollmannsberger et al.에 의해 구현된 바와 같이, 절회그래프를 생성할 수 있다. 두 그래프를 모두 만들면 유용하지만 스크립트의 런타임이 크게 증가하고 추가 메모리가 필요합니다. 사용자가 단순히 최종 토폴로지 분석을 필요로 하고 데이터 집합을 시각화하지 않으려면 44~61줄(골격 그래프)과 104~143줄(토폴로지 그래프)을 주석으로 표시하면 됩니다.
11. 작업이 완료되면 작업 영역에 표시되는 데이터 행렬에 처리된 데이터가 포함됩니다. 데이터를 두 번 클릭하고 변수 편집기에서 이 셀을 엽니다.
    1. 이 행렬에는 파일 이름, 2) 노드 수(분기 점 + 끝점), 3) 분기 점, 4) 링크(즉, 선박 포함), 네트워크 길이(분리 용기 포함) 및 6) z 스택에 포함된 슬라이스 수가 포함됩니다. 이 데이터를 .csv 파일로 저장하고 선택한 소프트웨어에 대한 추가 분석을 위해 내보낼 수 있습니다.

결과

분화 후(그림1), FACS 및 콜라겐 하이드로겔에서 iPSC-EP의 캡슐화 후, 세포는 전형적으로 초기 루멘을 마이그레이션하고 형성하기 시작하기 전에 24 시간 동안 반올림된 상태로 유지됩니다. 배양의 대략 6 일 후에, 원시 모세관 신경총은 밝은 필드 현미경 검사법으로 볼때 하이드로겔에서 볼 수 있을 것입니다 (그림 2). 공초점 현미?...

토론

이 프로토콜은 E8, LaSR 기저, 및 EGM-2의 세 가지 유형의 세포 배양 배지에서 세포의 장기 배양을 포함한다. 따라서 모든 물질을 적절하게 살균하기 위해 세심한주의를 기울여야합니다. 또한 실험실 코트와 에탄올 세척 장갑은 실험실의 층류 후드에서 작업할 때 항상 착용해야 합니다. 마이코 플라즈마 오염을 자주 테스트하는 것이 좋습니다. iPSC 배양 중에 다량의 파편이 관찰되는 경우 또는 분화 효...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	N/A	A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile	Corning	7007	Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	The base media for iPSC-EP differentiation.
Barnstead GenPure xCAD Plus	Thermo Fisher Scientific	50136165	Water purification system; others can be readily substituted
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture	Fisher Scientific	A8412	To preserve cell viability when FACs sorting
CD34-PE, human (clone: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs
CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg	VWR	354249	Main component of the 3D microenvironment
Conical centrifuge tubes (15/50 mL)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306	To counterstain and visualize cell nuclei
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	ThermoFisher	14190-250	To wash monolayer cultures
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting
Endothelial Cell Growth Medium 2	PromoCell	C-22011	Promotes endothelial cell viability and proliferation
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	For maintenance of pluripotent stem cells
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT)	Sigma-Aldrich	50046	Neutralizes remaining detergent
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95%	Sigma-Aldrich	A8960	Component of iPSC-EP differentiation medium
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture)	Fisher Scientific	356231	Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation
Medium-199 10X	Thermo Fisher Scientific	1825015	Used to balance final hydrogel osmolarity and pH
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	VWR	87003-294	Stores small volumes of reagents
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	The main ingredient of the immunostaining solutions
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument
Recombinant Human VEGF 165 Protein	R&D Systems	293-VE	Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis
Rhodamine phalloidin	Themo Fisher Scientific	R415	To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks
Triton X-100 (nonionic surfactant)	Sigma-Aldrich	X-100	Detergent used to gently permeabilize cells
Tween-20 (emulsifying reagent)	Fisher Scientific	BP337	Increases the binding specificity of the added antibodies
VE-Cadherin (F-8)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989	To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels
Vitronectin	ThermoFisher	A14700	For maintenance of pluripotent stem cells
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded