Kombinierte Infusion und Stimulation mit zyklischer Fast-Scan-Voltammetrie (CIS-FSCV) zur Beurteilung der ventralen Tegmental-Area-Rezeptor-Regulation von phasischem Dopamin

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ventrale tegmentale Bereichsrezeptoren direkt zu manipulieren, um ihren Beitrag zur Subsekunden-Dopaminfreisetzung zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die phasische Dopaminausschüttung (DA) aus dem ventralen tegmentalen Bereich (VTA) in den Nucleus accumbens spielt eine zentrale Rolle bei der Belohnungsverarbeitung und beim reinforcementden Lernen. Zu verstehen, wie die verschiedenen neuronalen Eingaben in die phasische DA-Freisetzung der VTA-Kontrolle ein besseres Bild der Schaltkreise liefern können, die die Belohnungsverarbeitung und das Verstärkungslernen steuern. Hier beschreiben wir eine Methode, die Intra-VTA-Kanüleninfusionen von pharmakologischen Agonisten und Antagonisten mit stimulationshergerufener phasischer DA-Freisetzung (kombinierte Infusion und Stimulation oder CIS) kombiniert, gemessen durch in vivo zyklische Schnellscan-Voltammetrie (FSCV). Unter Verwendung von CIS-FSCV bei anästhesierten Ratten kann eine phasische DA-Reaktion hervorgerufen werden, indem die VTA mit einer bipolaren Elektrode, die mit einer Kanüle versehen ist, während im Kern des Nucleus accumbens elektrisch stimuliert wird. Pharmakologische Agonisten oder Antagonisten können direkt an der Stimulationsstelle infundiert werden, um die Rolle spezifischer VTA-Rezeptoren bei der Förderung der phasischen DA-Freisetzung zu untersuchen. Ein großer Vorteil von CIS-FSCV besteht darin, dass die VTA-Rezeptorfunktion in vivo untersucht werden kann, aufbauend auf In-vitro-Studien.

Einleitung

Die freisetzung von phasischem Dopamin (DA) aus dem ventralen tegmentalen Bereich (VTA) in den Nucleus accumbens (NAc) spielt eine wichtige Rolle bei belohnungsbezogenen Verhaltensweisen. VTA DA-Neuronen wechseln von einem tonischartigen Feuer (3-8 Hz) zu einem Burst-ähnlichen Feuer (>14 Hz)¹, was eine phasische DA-Freisetzung im NAc erzeugt. Der VTA exprimiert eine Vielzahl von somatodendritischen Rezeptoren, die gut positioniert sind, um den Wechsel von tonisch zu burstfeuern^2,3^,4,^5zusteuern. Die Identifizierung, welcher dieser Rezeptoren und ihre jeweiligen Eingaben die phasische DA-Freisetzung steuern, wird unser Verständnis dafür vertiefen, wie die belohnungsbezogene Schaltung organisiert ist. Der Zweck der hier beschriebenen Methodik, kombinierte Infusion und Stimulation mit zyklischer Schnellscan-Voltammetrie (CIS-FSCV), besteht darin, die Funktionalität von VTA-Rezeptoren bei der Förderung der phasischen DA-Freisetzung schnell und robust zu bewerten.

Der Begriff kombinierte Infusion und Stimulation (CIS) bezieht sich auf die pharmakologische Manipulation von Rezeptoren auf einer Gruppe von Neuronen (hier die VTA) und die Stimulierung dieser Neuronen, um die Funktion des Rezeptors zu untersuchen. Bei der betäubten Ratte stimulieren wir die VTA elektrisch, um ein großes phasisches DA-Signal (1-2 μM) im NAc-Kern hervorzurufen, gemessen durch zyklische Schnellscan-Voltammetrie (FSCV). Infusionen von pharmakologischen Medikamenten (d.h. Rezeptoragonisten/-antagonisten) an der Stimulationsstelle können verwendet werden, um die Funktion von VTA-Rezeptoren zu messen, indem die nachfolgende Veränderung der evozierten phasischen DA-Freisetzung beobachtet wird. FSCV ist ein elektrochemischer Ansatz, der sowohl eine hohe räumliche (50-100 μm) als auch eine zeitliche (10 Hz) Auflösung aufweist und sich gut für die Messung belohnungsbezogener, phasischer DA-Ereignisse^{eignet 6,7}. Diese Auflösung ist feiner als andere neurochemische In-vivo-Messungen, wie z.B. Mikrodialyse. Daher ist CIS-FSCV zusammen gut geeignet, um die VTA-Rezeptorregulation der phasischen Dopaminfreisetzung zu beurteilen.

Eine gängige Methode zur Untersuchung der VTA-Rezeptorfunktion ist die Verwendung einer Kombination elektrophysiologischer Ansätze, die untersuchen, wie diese Rezeptoren die Feuerrate von Neuronen verändern^1,8. Diese Studien sind sehr wertvoll, um zu verstehen, welche Rezeptoren daran beteiligt sind, DA bei Aktivierung anzutreiben. Diese Studien können jedoch nur darauf hindeuten, was stromabwärts am Axonterminal passieren könnte (d. H. Freisetzung eines Neurotransmitters). CIS-FSCV baut auf diesen elektrophysiologischen Studien auf, indem es beantwortet, wie die Ausgabe von VTA-Burst-Feuerung, phasischer DA-Freisetzung, durch Rezeptoren reguliert wird, die sich auf VTA-Dendriten und Zellkörpern befinden. Cis-FSCV ist daher gut geeignet, um auf diesen elektrophysiologischen Studien aufzubauen. Als Beispiel kann die Nikotinrezeptoraktivierung das Burst-Feuern im VTA⁹induzieren, und CIS-FSCV in der anästhesierten Ratte wurde verwendet, um zu zeigen, dass die Aktivierung des nikotinischen Acetylcholinrezeptors (nAChR) in der VTA auch die phasische DA-Freisetzung im NAc¹⁰steuert,¹¹.

Die mechanistische Untersuchung der phasischen DA-Regulation wird auch häufig mit Slice-Präparaten zusammen mit der Anwendung von Medikamenten untersucht. Diese Studien konzentrieren sich oft auf die präsynaptische Regulation der phasischen DA-Freisetzung von Dopaminterminalen, da die Zellkörper oft aus der^{Scheibe 12}entfernt werden. Diese Präparate sind wertvoll für die Untersuchung präsynaptischer Rezeptorwirkungen auf Dopaminterminale, während CIS-FSCV besser geeignet ist, um somatodendritische Rezeptorwirkungen auf Dopaminneuronen sowie präsynaptische Inputs in die VTA zu untersuchen. Diese Unterscheidung ist wichtig, da die Aktivierung des somatodendritischen Rezeptors im VTA einen anderen Effekt haben kann als die Aktivierung des präsynaptischen NAc-Rezeptors. Tatsächlich kann die Blockierung dopaminerger präsynaptischer nAChRs im NAc die phasische Dopaminfreisetzung während des Burst-Firings¹³erhöhen, während das Gegenteil bei VTA somatodendritc nAChRs^10,11der Fall ist.

CIS-FSCV ist ein idealer Ansatz, um die Fähigkeit von VTA-Rezeptoren zu untersuchen, die phasische DA-Freisetzung zu regulieren. Wichtig ist, dass dieser Ansatz bei einer intakten Ratte durchgeführt werden kann, entweder betäubt oder sich frei bewegend. Dieser Ansatz eignet sich für akute Studien, zur Untersuchung der Rezeptorfunktion im Ausgangszustand^10,14 sowie für Langzeitstudien, die funktionelle Veränderungen in einem Rezeptor nach Arzneimittelexposition oder Verhaltensmanipulation beurteilen können^11,15.

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Protokoll

Alle Experimente wurden gemäß dem Leitfaden der National Institutes of Health (NIH) für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und sowohl vom Elizabethtown College als auch vom Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Dieses Protokoll ist spezifisch für die anästhesierte Rattenvorbereitung unter Verwendung von CIS-FSCV.

1. Vorchirurgische Vorbereitungen

1. Vorbereitung der Elektrodenlösung
   1. Um die Elektrodenverfülllösung herzustellen, wird eine Lösung aus 4 M Kaliumacetat mit 140 mM Kaliumchlorid^{16 hergestellt.}
2. Elektrodenvorbereitung
   1. Mittels Vakuumabsaugung wird eine T-650 Kohlefaser (7 μm Durchmesser) in eine Borosilikatglaskapillare eingebracht (Länge = 100 mm, Durchmesser = 1,0 mm, Innendurchmesser = 0,5 mm).
   2. Sobald die Kohlefaser in die Glaskapillare gelegt wurde, legen Sie die Glaskapillar in einen vertikalen Elektrodenabzieher, wobei das Wärmeelement ungefähr in der Mitte der Kapillare liegt. Stellen Sie die Heizung bei ausgeschaltetem Magneten auf 55.
   3. Nachdem die Kapillare gezogen wurde, heben Sie den oberen Kapillarhalter vorsichtig an, damit die Spitze der Elektrode nicht vom Heizelement umgeben ist.
   4. Schneiden Sie mit einer scharfen Schere die Kohlefaser ab, die noch die beiden Teile der Kapillare verbindet. Dies wird zu zwei separaten Kohlefaser-Mikroelektroden führen.
   5. Schneiden Sie unter einem Lichtmikroskop die freiliegende Kohlefaser vorsichtig mit einem scharfen Skalpell ab, so dass sich die Kohlefaser etwa 75-100 μm über das Ende des Glases hinaus erstreckt.
   6. Stellen Sie mit einem Lichtmikroskop sicher, dass die Elektrode frei von Rissen entlang der Kapillare ist. Achten Sie auch darauf, dass die Dichtung, bei der die Kohlefaser aus der Kapillare austritt, schwer zu bemerken und frei von Rissen ist.
      HINWEIS: Eine gute Abdichtung hilft, Rauschen während der Aufnahmen zu reduzieren. Siehe veröffentlichte Studien^17,18,19 für ein detaillierteres Protokoll.
3. Herstellung von Referenzelektroden
   1. Löten Sie einen Goldstift an einen 5 cm großen Silberdraht.
   2. Befestigen Sie die Anode an einer Metallklammer oder einem anderen Leiter, die Kathode an einem Stift und legen Sie eine Spannung (~ 2 V) an, während die Büroklammer und der Silberdraht in 0,1 M HCl eingetaucht sind.
   3. Stoppen Sie die Spannung, sobald eine weiße Beschichtung (AgCl) auf dem Silberdraht erscheint.
4. Elektrode für die Implantation vorbereiten
   1. Löten Sie einen Goldstift an einen dünnen isolierten Draht (~10 cm Länge, <0,50 mm Durchmesser).
   2. Entfernen Sie ~ 5 cm Isolierung von dem Draht gegenüber dem Goldstift.
   3. Füllen Sie die Elektrode etwa zur Hälfte mit Elektrodenlösung.
   4. Legen Sie einen isolierten Draht in die Elektrode ein.
      HINWEIS: Der Draht sollte Kontakt mit der Kohlefaser in der Elektrode aufnehmen.

2. Elektrodenimplantationen

1. Geben Sie erwachsenen, männlichen Sprague Dawley Ratten (250−450 g) eine intraperitoneale Injektion (1,5 g/kg oder 1 ml/kg Volumen) von 0,5 g/ml Urethan gelöst in steriler Kochsalzlösung. Beginnen Sie mit einer Urethan-Anfangsdosis von 1,0−1,2 g/kg. Wenn das Tier 20 minuten nach der Verabreichung von Urethan noch auf den Schadstoffreiztest (Schwanzklemme) anspricht, verabreichen Sie zusätzlich 0,3−0,5 g/kg Urethan für eine Gesamtdosis von 1,5 g/kg.
   ANMERKUNG: Zur Herstellung der 0,5 g/ml Urethanlösung werden 10 g Urethan zu 10 g (~10 ml) Kochsalzlösung gegeben. Urethan ist ein Karzinogen und muss mit Vorsicht behandelt werden. Urethan ist ein wichtiges Anästhetikum, da es den Dopaminspiegel nicht verändert, ebenso wenig wie andere Anästhetika wie Ketamin / Xylazin und Chloralhydrat^20,21.
2. Sobald das Tier tief betäubt ist und nicht auf schädliche Reize (z. B. Zehendrücken) reagiert, legen Sie es in den stereotaktischen Rahmen. Tragen Sie ophthalmologisches Gleitmittel auf jedes Auge der Ratte auf.
   HINWEIS: Dies ist eine Nicht-Überlebensoperation, aber eine gute aseptische Technik wird empfohlen.
3. Reinigen Sie die Kopfhaut der Ratte mit einem zweistufigen Peeling (d. H. Ein Iodopovidon-Peeling, gefolgt von einem 70% igen Ethanol-Peeling; führen Sie es mit einer Wiederholung von 3 Zyklen durch).
4. Schneiden Sie das Kopfhautgewebe mit einer sterilisierten Nadelnasenpinzette und einer chirurgischen Schere weg. Entfernen Sie eine beträchtliche Menge an Gewebe, um Platz für die verschiedenen unten beschriebenen Implantationen zu schaffen.
5. Reinigen Sie die Schädeloberfläche vorsichtig mit sterilisierten Applikatoren aus Baumwolle. Tragen Sie dann 2-3 Tropfen 3% Wasserstoffperoxid auf, um lambda und bregma zu identifizieren.
6. Bohren Sie mit einem Stereotaxie- oder Handbohrer (1,0 mm, ~ 20.000 U / min) ein Loch mit einem Durchmesser von 1,5 mm, 2,5 mm vor dem Bregma und 3,5 mm seitlich vor dem Bregma. Teilweise (etwa auf halbem Weg, bis es fest an Ort und Stelle ist) implantieren Sie eine Schraube (1,59 mm O.D., 3,2 mm lang) in dieses Loch. Es wird empfohlen, sterile Kochsalzlösung zu verwenden, um während des Bohrens zu bewässern, um thermische Verletzungen zu vermeiden.
7. Bohren Sie für die Referenzelektrode ein Loch mit einem Durchmesser von 1,0 mm, 1,5 mm anterior und 3,5 mm seitlich zum Bregma in der linken Hemisphäre.
8. Führen Sie von Hand ~ 2 mm Referenzdraht in dieses Loch ein, während Sie den Referenzdraht um und unter den Kopf der implantierten Schraube wickeln.
9. Implantieren Sie die Schraube vollständig und befestigen Sie die Referenzelektrode an Ort und Stelle.
10. Bohren Sie in der rechten Hemisphäre ein Loch mit einem Durchmesser von 1,5 mm, 1,2 mm anterior und 1,4 mm seitlich zum Bregma.
11. Entfernen Sie die Dura vorsichtig mit einer Pinzette.
12. Für die Stimulierende Elektrode bohren Sie ein quadratisches Loch (2 mm anterior-posterior, 5 mm medial-lateral), zentriert bei 5,2 mm posterior und 1,0 mm lateral zum Bregma.
13. Senken Sie mit den stereotaktischen Armstangen die bipolare stimulierende Elektrode / Führungskanüle 5 mm unter die Dura. Im Falle von Blutungen während der Implantation der Elektrode verwenden Sie sterile Wattestäbchen und Gaze, um Blutungen zu minimieren.
    HINWEIS: Die bei diesem Verfahren verwendete bipolare Stimulationselektrode ist mit einer Führungskanüle vorgerüstet (Materialtabelle). Die mit diesem Artikel verwendete interne Kanüle sollte mit den Zinken an der bipolaren Stimulationselektrode gespült werden, wenn sie vollständig in die Führungskanüle eingeführt ist. Dadurch kann die innere Kanüle direkt zwischen den beiden Zinken des Stimulators sitzen, die etwa 1 mm voneinander entfernt sitzen. Ein ähnliches Protokoll ist an anderer Stelle beschrieben¹⁴.
14. Senken Sie mit den stereotaktischen Armstangen die Kohlefaser-Mikroelektrode 4 mm unter die Dura. Diese Lage befindet sich im dorsalsten Teil des Striatums.
15. Verbinden Sie den Referenzdraht und die Kohlefaser mit einem Potentiostaten.
16. Wenden Sie eine dreieckige Wellenform (-0,4−1,3 V, 400 V/s) für 15 min bei 60 Hz und erneut für 10 min bei 10 Hz an.
    HINWEIS: Typischerweise werden beim Anlegen von Wellenformen auf Kohlefasermikroelektroden im Gehirn Oxidgruppen zur Oberfläche der Kohlefaser hinzugefügt. Das Gleichgewicht dieser Reaktion muss vor der Aufzeichnung erreicht werden; Andernfalls kommt es zu einer signifikanten Drift¹⁹. Das Durchlaufen der Elektrode bei höheren Frequenzen (60 Hz) ermöglicht es der Kohlefaser, schneller ein Gleichgewicht zu erreichen.

3. Optimierung der Kohlefaser und Stimulierung der Elektroden- / Führungskanülenpositionen

1. Stellen Sie den Stimulator so ein, dass er eine bipolare elektrische Wellenform mit einer Frequenz von 60 Hz, 24 Impulsen, 300 μA Strom und einer Pulsbreite von 2 ms / Phase erzeugt.
2. Senken Sie den Stimulator vorsichtig in Schritten von 0,2 mm von 5 mm bis 7,8 mm unter die Dura. Stimulieren Sie bei jedem Schritt den VTA.
   HINWEIS: In mehr dorsalen Tiefen (5-6 mm) führt die Stimulation des Gehirns typischerweise (~ 80% der Zeit) dazu, dass die Schnurrhaare der Ratte zucken. In weiteren Tiefen hören die Schnurrhaare auf zu zucken, was zwischen 7,5 und 8,2 mm unterhalb der Dura auftritt. Wenn die Schnurrhaare aufhören zu zucken, befindet sich die stimulierende Elektrode in der Nähe oder am VTA. Dies tritt nicht bei jeder Ratte auf, und das Fehlen von Schnurrhaarzucken sollte nicht als Zeichen dafür angesehen werden, dass die bipolare stimulierende Elektrode / Infusionskanüle verlegt ist. Whisker-Zuckungen treten möglicherweise nicht bei allen Anästhetika (z. B. Isofluran) auf.
3. Senken Sie die bipolare stimulierende Elektrode / Leitkanüle weiter ab, bis eine Stimulation eine phasische DA-Freisetzung an der Kohlefasermikroelektrode (derzeit im dorsalen Striatum) erzeugt.
   HINWEIS: Die DA-Freisetzung im dorsalen Striatum tritt nicht immer auf, wenn die bipolare Elektrode in die VTA implantiert wird, aber die Beobachtung der DA-Freisetzung im dorsalen Striatum bei VTA-Stimulation ist normalerweise ein gutes Zeichen dafür, dass ein gutes Signal im NAc-Kern beobachtet wird.
4. Senken Sie die Kohlefaser-Mikroelektrode ab, bis sie mindestens 6,0 mm unter der Dura liegt. Dies ist der dorsalste Teil des NAc-Kerns.
5. Stimulieren Sie den VTA und zeichnen Sie die Spitzenamplitude des DA-Peaks auf.
6. Senken oder heben Sie die Kohlefaser-Mikroelektrode an der Stelle an, die die größte DA-Freisetzung erzeugt.
7. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der DA-Reaktion eine klare Oxidationsspitze bei 0,6 V und eine Reduktionsspitze bei -0,2 V ist. Diese Spitzen sind ein Hinweis auf DA.

4. Kombinationsinfusion und Stimulation FSCV-Aufzeichnung

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die Zeitleiste für die Aufzeichnung vor und nach der VTA-Mikroinfusion.

1. Sobald die Position der Kohlefaser und der stimulierenden Elektrode / Führungskanüle optimiert wurde, stimulieren Sie für ~ 20−30 min.
   HINWEIS: Stimulieren Sie unter den aktuellen Stimulationsparametern nicht mehr als einmal alle 3 Minuten, um ein vesikuläres Nachladen zu ermöglichen²².
2. Nach Erreichen einer stabilen Baseline (<20% Variation über fünf Stimulationen) senken Sie die innere Kanüle vorsichtig von Hand in die Führungskanüle, die in den bipolaren Stimulator vormontiert ist.
3. Machen Sie zusätzliche 2−3 Baseline-Aufnahmen, um sicherzustellen, dass die Kanüleneinführung selbst keine Veränderung des evozierten Signals verursachte. In einigen Fällen kann das Einsetzen und Entfernen der inneren Kanüle zu Schäden an der VTA führen. Wenn sich das Signal während dieser Baseline-Periode drastisch ändert (>20%), dann nehmen Sie weitere 3-4 Aufnahmen auf, bis sich die Baseline wieder stabilisiert.
4. Mit einer Spritzenpumpe und einer Mikrospritze werden über einen Zeitraum von 2 Minuten 0,5 μL Lösung (z. B. 0,9% Kochsalzlösung, N-Methyl-D-Aspartat [NMDA], (2R)-Amino-5-phosphonovalerinsäure [AP5]) in die VTA eingebracht.
5. Lassen Sie die innere Kanüle nach der Infusion mindestens 1 Minute vor der Entfernung stehen.
   HINWEIS: Einige Medikamente erfordern möglicherweise, dass die interne Kanüle basierend auf der Arzneimittelkinetik für eine längere Zeit verlassen wird, und die Entfernung der internen Kanüle kann dazu führen, dass das Medikament durch die innere Kanüle wieder nach oben wandert. Wenn es Bedenken gibt, könnte man die interne Kanüle während der gesamten Aufnahme in der Führungskanüle belassen. Andernfalls kann die Aufzeichnung nach diesem 1-minütigen Intervall beginnen.
6. Nehmen Sie die Aufzeichnung alle 3 Minuten fort, um die Effekte nach der Infusion zu messen.
   HINWEIS: Wenn eine Kontrolllösung infundiert wird und keine Wirkung beobachtet wird, ist es möglich, ein zweites Mal zu infundieren¹⁰. Wenn es zu einer veränderten DA-Freisetzung kommt, die durch das Einsetzen der internen Kanüle oder der Kochsalzlösung verursacht wird, erholt sich das Signal typischerweise innerhalb von 30 Minuten auf den Ausgangswert.

5. Histologische Überprüfung der Elektrodenplatzierung

1. Am Ende des Experiments erzeugen Sie eine kleine Läsion an der Aufnahmestelle mit der Kohlefaser-Mikroelektrode.
   1. Wenn die Elektrode für die Kalibrierung nach dem Experiment erhalten bleiben muss, verwenden Sie einen Wolframdraht, der in einer Glaskapillare platziert ist, die ~ 100 μm über die Kapillarspitze hinausragt. Heben Sie in diesem Fall die Elektrode aus dem Gehirn an, ersetzen Sie die Aufnahmeelektrode durch die Wolframelektrode und senken Sie sie auf die gleiche dorsoventrale Koordinate.
      HINWEIS: Die Kohlefaser kann auch verwendet werden, um das Gehirn zu läsionieren und liefert eine genauere Darstellung der Position der Aufnahmestelle; Der Experimentator verliert jedoch die Fähigkeit, diese Elektroden zu kalibrieren.
2. Um die Aufnahmestelle zu läsionieren, wenden Sie die Spannung mit einem Netzteil an. Beginnen Sie bei 1 V und erhöhen Sie alle 10 s um 1 V, bis 10 V erreicht ist.
3. Das Tier wird mit einer tödlichen intraperitonealen Injektion von Pentobarbital (150 mg/kg) eingeschläfert.
4. Perfuse die Ratte mit einer 4% igen Formalinlösung.
5. Entfernen Sie den Kopf von der Ratte mit einer geschärften Guillotine.
6. Entfernen Sie mit Rongeurs das Bindegewebe und den Schädel, die das Gehirn umgeben, und entfernen Sie das Gehirn sanft von verbleibendem Gewebe.
7. Lagern Sie das Gehirn in 4% Formalin für 1 Tag und übertragen Sie es dann auf 30% Saccharose.
   HINWEIS: Eine Perfusion mit 4% Formalin ist nicht notwendig, um die Läsionsstelle zu sehen, obwohl sie als Best Practice die Rekonstruktion der Läsionsstelle verbessert.
8. Erstellen Sie 30 μm Scheiben des Gehirns mit einem Kryostaten.
9. Montieren Sie die Scheiben auf Dias und bedecken Sie sie mit einem Abdeckzettel.
10. Bezeichnen Sie die Lage der Kohlefaser-Mikroelektrodenläsion und die Bipolarstimulator- / Infusionskanülenposition mit einem Lichtmikroskop.

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Ergebnisse

CIS-FSCV wurde verwendet, um die Funktion von VTA-N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren (NMDAR), nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (nAChRs) und muskarinischen Acetylcholinrezeptoren (mAChRs) bei der Förderung der phasischen DA-Freisetzung im NAc-Kern zu untersuchen. Abbildung 2 zeigt repräsentative Daten für eine Negativkontrolle, Infusion von 0,9% Kochsalzlösung, vor (Baseline) und 9 min nach der Infusion (Kochsalzlösung). Abbildung 2

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Diskussion

CIS-FSCV bietet eine einzigartige Gelegenheit, die VTA-Rezeptormechanismen zu untersuchen, die der phasischen DA-Freisetzung zugrunde liegen. Es gibt zwei kritische Schritte, um eine ordnungsgemäße Aufzeichnung zu gewährleisten. Zunächst muss eine stabile Baseline-Aufzeichnung erreicht werden, mit wenig Drift im evozierten DA-Signal. Eine wichtige Möglichkeit, die Wahrscheinlichkeit einer stabilen Aufzeichnung zu erhöhen, besteht darin, sicherzustellen, dass die Elektrode genügend Zeit hatte, sowohl bei 60 Hz als ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Electrode Filling Solution/Supplies
Micropipette	World Precision Instruments	MF286-5 (28 gauge)
Potassium Acetate	Sigma	236497-100G
Potassium Chloride	Sigma	P3911-25G
Electrode Supplies
Carbon fiber	Thornel	T650
Electrode puller	Narishige International	PE-22	Note: horizontal pullers can be used as well
Glass capillary	A-M systems	626000
Insulated wires for electrodes	Weico Wire and Cable Incorporated	UL 1423	Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire
Light Microscope (for viewing and cutting electrode)	Fischer Scientific	M3700
Pin	Phoenix Enterprises	HWS1646	To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage
Putty	Alcolin	23922-1003	Used to place electrode on while cutting the carbon fiber
Scalpal Blade	World Precision Instruments	500239	For cutting carbon fiber to the apprpriate length
Silver Wire	Sigma	327026-4G
FSCV Hardware/Software
Faraday Cage	U-Line	H-3618 (36" x 24" x 42")
Potentiostat	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
Stimulating electrode	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	when ordering, request a 22 mm cut below pedestal
TarHeel HDCV Software	University of North Carolina-Chapel Hill	-	https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information
UEI breakout box	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility		https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information
UEI power supply	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility		https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information
Stimulator Hardware
Neurolog stimulus isolator	Digitimer Ltd.	DS4	Neurolog 800A
Infusion/Stimulation Supplies
Infusion Pump	New Era Syringe Pump	NE-300
Internal Cannula	PlasticsOne	C315I/SPC INTERNAL 33GA
Microliter Syringe	Hamilton	80308
Tubing	PlasticsOne	C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50
Surgical Supplies
Cannula Holder	Kopf Instruments	1776 P-1
Cotton Tip Applicators	Vitality Medical	806
Electrode Holder	Kopf Instruments	1770
Heating Pad	Kent Scientific	RT-0501
Povidone Iodine	Vitality Medical	29906-004
Screws	Stoelting	Bone Anchor Screws/Pkg.of 100	1.59 mm O.D., 3.2 mm long
Silver wire reference with AgCl	InVivo Metric	E255A
Square Gauze	Vitality Medical	441408
Stereotax	Kopf Instruments	Model 902 (Dual Arm Bar)
Histological Supplies
Formulin	Sigma	1004960700
Power supply	BK Precision	9110
Sucrose	Sigma	80497
Tungsten microelectrode	MicroProbes	WE30030.5A3
Drugs for infusions
((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid	Sigma Aldrich	A5282
N-methyl-D-aspartate	Sigma Aldrich	M3262
Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg)	Sigma Aldrich	M9020
Scopolamine hydrobromide (S0929-1g)	Sigma Aldrich	S0929