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Resumo

O objetivo deste protocolo é manipular diretamente os receptores da área tegmental ventral para estudar sua contribuição para a liberação de dopamina subsegundo.

Resumo

A liberação de dopamina phasic (DA) da área tegmental ventral (VTA) para o núcleo accumbens desempenha um papel fundamental no processamento de recompensas e aprendizado de reforço. Entender como as diversas entradas neuronais na liberação da DA de controle VTA podem fornecer uma melhor imagem dos circuitos que controlam o processamento de recompensas e o aprendizado reforçado. Aqui, descrevemos um método que combina infusões de cânulas intra-VTA de agonistas farmacológicos e antagonistas com a liberação de DA fásica evocada por estimulação (infusão e estimulação combinada, ou CIS) medida pela voltametria cíclica in vivo de varredura rápida (FSCV). Usando CIS-FSCV em ratos anestesiados, uma resposta da DA fásica pode ser evocada estimulando eletricamente o VTA com um eletrodo bipolar equipado com uma cânula durante a gravação no núcleo do núcleo accumbens. Agonistas ou antagonistas farmacológicos podem ser infundidos diretamente no local de estimulação para investigar os papéis específicos dos receptores de VTA na liberação da DA fásica. Um grande benefício do CIS-FSCV é que a função receptorA VTA pode ser estudada in vivo, com base em estudos in vitro.

Introdução

A liberação de dopamina phasic (DA) da área tegmental ventral (VTA) para o núcleo accumbens (NAc) desempenha um papel vital em comportamentos relacionados à recompensa. Os neurônios VTA DA mudam de um disparo tônico (3-8 Hz) para um disparo em forma de estouro (>14 Hz)1, que produz a liberação da DA phasic no NAc. O VTA expressa uma variedade de receptores somatodendritic que estão bem posicionados para controlar o interruptor de tônica para estouro2,3,4,5. Identificar quais desses receptores, e seus respectivos insumos, controlarão a liberação da DA phasic aprofundará nossa compreensão de como os circuitos relacionados à recompensa são organizados. O objetivo da metodologia aqui descrita, infusão combinada e estimulação com voltametria cíclica de varredura rápida (CIS-FSCV), é avaliar de forma rápida e robusta a funcionalidade dos receptores VTA na liberação da DA fásica.

O termo infusão e estimulação combinada (CEI) refere-se a receptores farmacologicamente manipuladores em um grupo de neurônios (aqui o VTA) e estimular esses neurônios a estudar a função do receptor. No rato anestesiado, estimulamos eletricamente o VTA para evocar um grande sinal da fásico (1-2 μM) no núcleo NAc, medido pela voltammetry cíclica de varredura rápida (FSCV). Infusões de fármacos farmacológicos (ou seja, agonistas receptores/antagonistas) no local de estimulação podem ser usadas para medir a função dos receptores VTA observando a mudança subsequente na liberação da FAsica evocada. FSCV é uma abordagem eletroquímica que desfruta tanto de alta resolução espacial (50-100 μm) quanto temporal (10 Hz), e é adequada para medir eventos da DA relacionados à recompensa6,7. Esta resolução é mais fina do que outras medidas neuroquímicas in vivo, como a microdiálise. Assim, em conjunto, o CIS-FSCV é adequado para avaliar a regulação do receptor VTA da liberação de dopamina fásica.

Uma maneira comum de investigar a função do receptor de VTA é usando uma combinação de abordagens eletrofisiológicas que abordam como esses receptores alteram a taxa de disparo dos neurônios1,8. Esses estudos são altamente valiosos para entender quais receptores estão envolvidos na condução de disparos da promotoria após a ativação. No entanto, esses estudos só podem sugerir o que pode acontecer a jusante no terminal de axônio (ou seja, liberação de um neurotransmissor). O CIS-FSCV baseia-se nesses estudos eletrofisiológicos, respondendo como a saída de disparo de VTA, liberação de DA fásica, é regulada por receptores localizados em dendritos de VTA e corpos celulares. Assim, o CIS-FSCV é adequado para se basear nesses estudos de eletrofisiologia. Como exemplo, a ativação do receptor nicotínico pode induzir o disparo de explosão no VTA9, e o CIS-FSCV no rato anestesiado foi usado para mostrar que a ativação do receptor de acetilcolina nicotínica (nAChR) no VTA também controla a liberação da Fásica no NAc10,11.

O exame mecanicista da regulação da da afásica também é comumente estudado usando preparações de fatias juntamente com a aplicação de banho de drogas. Esses estudos muitas vezes se concentram na regulação pré-sináptica da liberação da DA afásica dos terminais de dopamina, uma vez que os corpos celulares são frequentemente removidos da fatia12. Essas preparações são valiosas para estudar efeitos de receptores pré-sinápticos nos terminais de dopamina, enquanto o CIS-FSCV é mais adequado para estudar efeitos do receptor somatodendritico em neurônios de dopamina, bem como entradas pré-sinápticas no VTA. Essa distinção é importante, pois a ativação do receptor somatodendritic no VTA pode ter um efeito diferente da ativação do receptor pré-sináptico NAc. De fato, bloquear nAChRs pré-sinápticas dopaminérgicos no NAc pode elevar a liberação de dopamina afásica durante o estouro13, enquanto o oposto é verdadeiro no VTA somatodendritc nAChRs10,11.

CIS-FSCV é uma abordagem ideal para estudar a capacidade dos receptores VTA de regular a liberação da DA fásica. É importante ressaltar que essa abordagem pode ser realizada em um rato intacto, seja anestesiado ou em movimento livre. Esta abordagem é adequada para estudos agudos, para estudar a função receptora em seu estado de base10,14, bem como estudos de longo prazo que possam avaliar alterações funcionais em um receptor após exposição a medicamentos ou manipulação comportamental11,15.

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Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Guia nacional de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório (NIH) e aprovados pelo Elizabethtown College e pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yale (IACUC). Este protocolo é específico para a preparação anestésima de ratos de utilização do CIS-FSCV.

1. Preparações pré-úrgicas

  1. Preparação da solução de eletrodos
    1. Para fazer a solução de enchimento de eletrodo, prepare uma solução de acetato de potássio de 4 M com cloreto de potássio de 140 mM16.
  2. Preparação de eletrodos
    1. Utilizando sucção a vácuo, insira uma fibra de carbono T-650 (7 μm de diâmetro) em um capilar de vidro borossilicato (comprimento = 100 mm, diâmetro = 1,0 mm, diâmetro interno = 0,5 mm).
    2. Uma vez que a fibra de carbono tenha sido colocada dentro do capilar de vidro, coloque o capilar de vidro em um puxador de eletrodo vertical, com o elemento de calor aproximadamente no meio do capilar. Coloque o aquecedor em 55 com o ímã desligado.
    3. Depois que o capilar é puxado, levante cuidadosamente o suporte capilar superior para que a ponta do eletrodo não seja cercada pelo elemento de aquecimento.
    4. Usando uma tesoura afiada, corte a fibra de carbono que ainda está conectando os dois pedaços do capilar. Isso resultará em duas microeletrodas separadas de fibra de carbono.
    5. Sob um microscópio leve, corte cuidadosamente a fibra de carbono exposta com um bisturi afiado, de modo que a fibra de carbono se estenda aproximadamente 75-100 μm além da extremidade do vidro.
    6. Usando um microscópio leve, certifique-se de que o eletrodo esteja livre de rachaduras ao longo do capilar. Certifique-se também de que o selo, onde a fibra de carbono sai do capilar, é difícil de notar e livre de rachaduras.
      NOTA: Um bom selo ajudará a reduzir o ruído durante as gravações. Veja os estudos publicados17,18,19 para um protocolo mais detalhado.
  3. Fabricação de eletrodos de referência
    1. Soldar um pino de ouro para um fio de prata de 5 cm.
    2. Conecte o ânodo a um clipe de papel metálico ou outro condutor, o cátodo a um pino, e aplique uma tensão (~2 V) enquanto o clipe de papel e o fio de prata estão submersos em 0,1 M HCL.
    3. Pare a tensão quando um revestimento branco (AgCl) aparecer no fio de prata.
  4. Preparação de eletrodo para implantação
    1. Soldar um pino dourado para um fio isolado fino (~10 cm de comprimento, <0,50 mm de diâmetro).
    2. Remova ~5 cm de isolamento do fio oposto ao pino dourado.
    3. Encha o eletrodo aproximadamente na metade com a solução de eletrodo.
    4. Insira fio isolado no eletrodo.
      NOTA: O fio deve fazer contato com a fibra de carbono dentro do eletrodo.

2. Implantações de eletrodos

  1. Dar aos ratos adultos, machos, Sprague Dawley (250-450 g) uma injeção intraperitoneal (1,5 g/kg ou 1 mL/kg) de 0,5 g/mL de uretano dissolvido em soro fisiológico estéril. Comece com uma dose inicial de uretano de 1,0−1,2 g/kg. Se o animal ainda responder ao teste de estímulo nocivo (pinça traseira) 20 min após a administração da uretano, administre um uretano adicional de 0,3−0,5 g/kg para uma dose total de 1,5 g/kg.
    NOTA: Para a preparação da solução de 0,5 g/mL de uretano, adicione 10 g de uretano a 10 g (~10 mL) de soro fisiológico. Ouretano é um cancerígeno e deve ser tratado com cuidado. O uretano é um anestésico importante, pois não altera os níveis de dopamina, assim como outros anestésicos como cetamina/ xilazina e hidrato de cloral20,21.
  2. Uma vez que o animal é profundamente anestesiado e não responde a estímulos nocivos (por exemplo, pinça do dedo do dedo), coloque-o no quadro estereotaxic. Aplique lubrificante oftálmico em cada olho do rato.
    NOTA: Esta é uma cirurgia de não sobrevivência, mas uma boa técnica asséptica é incentivada.
  3. Limpe o couro cabeludo do rato usando um esfoliante de dois estágios (ou seja, um esfoliante de iodopovidona seguido de um esfoliante de 70% de etanol; realize com uma repetição de 3 ciclos).
  4. Corte o tecido do couro cabeludo usando pinças esterilizadas do nariz da agulha e tesoura cirúrgica. Remova uma quantidade significativa de tecido para abrir espaço para as várias implantações descritas abaixo.
  5. Limpe suavemente a superfície do crânio usando aplicadores de ponta de algodão esterilizados. Em seguida, aplique 2-3 gotas de 3% de peróxido de hidrogênio para ajudar a identificar a lambda e bregma.
  6. Utilizando uma furadeira estereotaxica ou manual (1,0 mm, ~20.000 rpm), fure um orifício de 1,5 mm de diâmetro 2,5 mm anterior ao bregma e 3,5 mm lateral ao bregma. Parcialmente (cerca de metade, até que esteja firmemente no lugar) implante um parafuso (1,59 mm de O.D., 3,2 mm de comprimento) neste orifício. Recomenda-se o uso de soro fisiológico estéril para irrigar durante a perfuração para evitar ferimentos térmicos.
  7. Para o eletrodo de referência, perfurar um orifício de 1,0 mm de diâmetro 1,5 mm anterior e 3,5 mm lateral para o bregma, no hemisfério esquerdo.
  8. À mão, insira ~2 mm de fio de referência neste orifício, enquanto envolve o fio de referência ao redor e sob a cabeça do parafuso implantado.
  9. Implante totalmente o parafuso, fixando o eletrodo de referência no lugar.
  10. No hemisfério direito, perfurar um orifício de 1,5 mm de diâmetro 1,2 mm anterior e 1,4 mm lateral para o bregma.
  11. Remova suavemente a dura usando pinças.
  12. Para o eletrodo estimulante, faça um orifício quadrado (2 mm anterior-posterior, 5 mm medial-lateral) centrado em 5,2 mm posterior e 1,0 mm lateral para o bregma.
  13. Usando as barras de braço estereotáticos, abaixe a cânula estimulante/guia bipolar 5 mm abaixo da dura. Em caso de sangramento durante a implantação do eletrodo, use cotonetes e gaze estéreis para minimizar o sangramento.
    NOTA: O eletrodo estimulante bipolar utilizado neste método é pré-adaptado com uma cânula guia(Tabela de Materiais). A cânula interna usada com este item deve ser lavada com as pontas do eletrodo estimulante bipolar quando totalmente inserida na cânula guia. Isso permitirá que a cânula interna fique diretamente entre as duas pontas do estimulador, que ficam a cerca de 1 mm de distância. Um protocolo semelhante é descrito em outro lugar14.
  14. Usando as barras de braço estereotáticos, baixe a fibra de carbono microeletrodes 4 mm abaixo da dura. Este local é na parte mais dorsal do estriado.
  15. Conecte o fio de referência e a fibra de carbono a um potencialiostat.
  16. Aplique uma forma de onda triangular (-0,4−1,3 V, 400 V/s) por 15 min a 60 Hz, e novamente por 10 min a 10 Hz.
    NOTA: Normalmente, ao aplicar formas de onda a microeletrodos de fibra de carbono no cérebro, grupos de óxido são adicionados à superfície da fibra de carbono. O equilíbrio desta reação deve ser alcançado antes da gravação; caso contrário, ocorrerá uma deriva significativa19. Pedalar o eletrodo em frequências mais altas (60 Hz) permite que a fibra de carbono alcance o equilíbrio mais rapidamente.

3. Otimizando a fibra de carbono e estimulando locais de cânula/guia

  1. Defina o estimulador para produzir uma forma de onda elétrica bipolar, com uma frequência de 60 Hz, 24 pulsos, corrente de 300 μA e largura de pulso de 2 ms/fase.
  2. Abaixe suavemente o estimulador em incrementos de 0,2 mm de 5 mm a 7,8 mm abaixo da dura. A cada incremento, estimule o VTA.
    NOTA: Em profundidades mais dorsais (5-6 mm), a estimulação do cérebro normalmente (~80% do tempo) faz com que os bigodes do rato se contraiam. Em profundidades posteriores, os bigodes cessarão a contração, o que ocorre entre 7,5 e 8,2 mm abaixo da dura. Quando os bigodes cessarem, o eletrodo estimulante estará próximo ou no VTA. Isso não ocorrerá em todos os ratos, e a falta de contração de whisker não deve ser tomada como um sinal de que a cânula de eletrodo/infusão estimulante bipolar é extraviada. A contração do whisker pode não ocorrer para todos os anestésicos (por exemplo, isoflurane).
  3. Continue a baixar a cânula estimulante bipolar/cânula guia até que uma estimulação produza a liberação da DA fásica na microeletroda de fibra de carbono (atualmente no estriato dorsal).
    NOTA: A liberação de DA no estriado dorsal nem sempre ocorrerá se o eletrodo bipolar for implantado no VTA, mas a observação da liberação de DA no estriado dorsal sobre a estimulação do VTA é geralmente um bom sinal de que um bom sinal será observado no núcleo NAc.
  4. Abaixe a microeletrídola de fibra de carbono até que esteja pelo menos 6,0 mm abaixo da dura. Esta é a parte mais dorsal do núcleo NAc.
  5. Estimule o VTA e regise o pico de amplitude do pico da DA.
  6. Abaixe ou eleve a microeletríd latroc de fibra de carbono no local que produz a maior liberação da DA.
  7. Certifique-se de que o pico da resposta da DA é um pico claro de oxidação em 0,6 V e um pico de redução em -0,2 V. Esses picos são indicativos de DA.

4. Infusão de combinação e gravação de FSCV

NOTA: A Figura 1 mostra a linha do tempo para gravação antes e depois da microinfusão VTA.

  1. Uma vez otimizada a fibra de carbono e a localização da cânula estimulante/ guia, estimule por ~20-30 min.
    NOTA: Sob os parâmetros de estimulação atuais, não estimule mais de uma vez a cada 3 minutos, para permitir a recarga vesicular22.
  2. Depois de alcançar uma linha de base estável (variação de <20% sobre cinco estímulos), abaixe suavemente a cânula interna à mão na cânula guia que é pré-adaptada para o estimulador bipolar.
  3. Faça gravações adicionais de 2-3 para garantir que a inserção da cânula em si não tenha causado uma alteração no sinal evocado. Em alguns casos, a inserção e remoção da cânula interna podem causar danos ao VTA. Se o sinal mudar drasticamente durante este período de linha de base (>20%), então faça mais 3-4 gravações até que a linha de base se reestilizar.
  4. Utilizando uma bomba de seringa e microsinga, infundir 0,5 μL de solução (por exemplo, 0,9% salino, N-metil-D-aspartato [NMDA], (2R)-amino-5-ácido fosfosorórico [AP5]) no VTA durante um período de 2 min.
  5. Pós-infusão, deixe a cânula interna por pelo menos 1 minuto antes da remoção.
    NOTA: Algumas drogas podem exigir deixar a cânula interna por mais tempo com base na cinética da droga, e a remoção da cânula interna pode fazer com que a droga volte a viajar pela cânula interna. Se houver preocupação, pode-se deixar a cânula interna na cânula guia durante toda a gravação. Caso contrário, a gravação pode começar após este intervalo de 1 minuto.
  6. Continue gravando a cada 3 minutos para medir os efeitos pós-infusão.
    NOTA: Se infundir uma solução de controle e nenhum efeito for observado, é possível infundir uma segunda vez10. Se houver uma liberação de DA alterada causada pela inserção da cânula interna ou infusão salina, o sinal normalmente se recupera para a linha de base dentro de 30 minutos.

5. Verificação histológica da colocação de eletrodos

  1. No final do experimento, crie uma pequena lesão no local de gravação usando a microeletroda de fibra de carbono.
    1. Se o eletrodo deve ser preservado para calibração pós-experiência, use então um fio de tungstênio colocado em um capilar de vidro salientes ~100 μm além da ponta capilar. Neste caso, levante o eletrodo do cérebro, substitua o eletrodo de gravação pelo eletrodo de tungstênio, e abaixe-o para a mesma coordenada dorsoventral.
      NOTA: A fibra de carbono também pode ser usada para lesar o cérebro e fornecerá uma representação mais precisa da localização do local de gravação; no entanto, o experimentador perderá a capacidade de calibrar esses eletrodos.
  2. Para lesionar o local de gravação, aplique tensão usando uma fonte de alimentação. Comece em 1 V e aumente em 1 V a cada 10 s até que 10 V seja alcançado.
  3. Eutanize o animal usando uma injeção intraperitoneal letal de pentobarbital (150 mg/kg).
  4. Perfuse o rato usando uma solução de 4% de formalina.
  5. Remova a cabeça do rato usando uma guilhotina afiada.
  6. Usando rongeurs, remova o tecido conjuntivo e o crânio ao redor do cérebro, e desaloja suavemente o cérebro de qualquer tecido restante.
  7. Armazene o cérebro em 4% de formalina por 1 dia e depois transfira para 30% de sacarose.
    NOTA: A perfusão com 4% de formalina não é necessária para ver o local da lesão, embora como prática recomendada irá melhorar a reconstrução do local da lesão.
  8. Crie fatias de 30 μm do cérebro usando um criostat.
  9. Monte as fatias em slides e cubra com um deslizamento de tampa.
  10. Denote a localização da lesão de microeletrodes de fibra de carbono e localização da cânula de estimulação/infusão bipolar usando um microscópio leve.

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Resultados

CIS-FSCV foi utilizado para estudar a função de receptores de pós-metila-d-aspartato (NMDAR), receptores de acetilcolina nicotínica (nAChRs) e receptores de acetilcolina muscarínica (mAChRs) na liberação da DA fásica no núcleo NAc. A Figura 2 mostra dados representativos para um controle negativo, infusão de 0,9% salina, antes (linha de base) e 9 min de pós-infusão (soro fisiológico). A Figura 2 mostra um enredo de c...

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Discussão

O CIS-FSCV oferece uma oportunidade única para investigar os mecanismos receptores VTA subjacentes à liberação da DA fásica. Há duas etapas críticas para garantir uma gravação adequada. Em primeiro lugar, uma gravação de linha de base estável deve ser alcançada, com pouca deriva no sinal de DA evocado. Uma maneira importante de aumentar a probabilidade de estabelecer um registro estável é garantir que o eletrodo tenha tido tempo de sobra para pedalar tanto a 60 Hz quanto a 10 Hz (tipicamente 15 min a 60 Hz...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

O trabalho foi apoiado pela Elizabethtown College (R.J.W, M.L., e L.M.), por uma Bolsa de Pós-Graduação da NSF (R.J.W.) e pela Yale School of Medicine (N.A.).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Electrode Filling Solution/Supplies
MicropipetteWorld Precision InstrumentsMF286-5 (28 gauge)
Potassium AcetateSigma236497-100G
Potassium ChlorideSigmaP3911-25G
Electrode Supplies
Carbon fiberThornelT650
Electrode pullerNarishige InternationalPE-22Note: horizontal pullers can be used as well
Glass capillaryA-M systems626000
Insulated wires for electrodesWeico Wire and Cable IncorporatedUL 1423Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire
Light Microscope (for viewing and cutting electrode)Fischer ScientificM3700
PinPhoenix EnterprisesHWS1646To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage
PuttyAlcolin23922-1003Used to place electrode on while cutting the carbon fiber
Scalpal BladeWorld Precision Instruments500239For cutting carbon fiber to the apprpriate length
Silver WireSigma327026-4G
FSCV Hardware/Software
Faraday CageU-LineH-3618 (36" x 24" x 42")
PotentiostatUniv. of N. Carolina, Electronics Facility
Stimulating electrodePlasticsOneMS303/2-A/SPCwhen ordering, request a 22 mm cut below pedestal
TarHeel HDCV SoftwareUniversity of North Carolina-Chapel Hill-https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information
UEI breakout boxUniv. of N. Carolina, Electronics Facilityhttps://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information
UEI power supplyUniv. of N. Carolina, Electronics Facilityhttps://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information
Stimulator Hardware
Neurolog stimulus isolatorDigitimer Ltd.DS4Neurolog 800A
Infusion/Stimulation Supplies
Infusion PumpNew Era Syringe PumpNE-300
Internal CannulaPlasticsOneC315I/SPC INTERNAL 33GA
Microliter SyringeHamilton80308
TubingPlasticsOneC313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50
Surgical Supplies
Cannula HolderKopf Instruments1776 P-1
Cotton Tip ApplicatorsVitality Medical806
Electrode HolderKopf Instruments1770
Heating PadKent ScientificRT-0501
Povidone IodineVitality Medical29906-004
ScrewsStoeltingBone Anchor Screws/Pkg.of 1001.59 mm O.D., 3.2 mm long
Silver wire reference with AgClInVivo MetricE255A
Square GauzeVitality Medical441408
StereotaxKopf InstrumentsModel 902 (Dual Arm Bar)
Histological Supplies
FormulinSigma1004960700
Power supplyBK Precision9110
SucroseSigma80497
Tungsten microelectrodeMicroProbesWE30030.5A3
Drugs for infusions
((2R)-amino-5-phosphonovaleric acidSigma AldrichA5282
N-methyl-D-aspartateSigma AldrichM3262
Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg)Sigma AldrichM9020
Scopolamine hydrobromide (S0929-1g)Sigma AldrichS0929

Referências

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