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Resumen

El objetivo de este protocolo es manipular directamente los receptores del área tegmental ventral para estudiar su contribución a la liberación de dopamina de subsectores.

Resumen

La liberación de dopamina fásica (DA) desde el área tegmental ventral (VTA) al núcleo accumbens juega un papel fundamental en el procesamiento de recompensas y el aprendizaje por refuerzo. Comprender cómo las diversas entradas neuronales en la liberación de DA fásica de control VTA puede proporcionar una mejor imagen de los circuitos que controlan el procesamiento de recompensas y el aprendizaje por refuerzo. Aquí, describimos un método que combina infusiones de cánula intra-VTA de agonistas farmacológicos y antagonistas con liberación de DA fásica evocada por estimulación (infusión y estimulación combinadas, o CIS) medida por voltamperometría cíclica de exploración rápida in vivo (FSCV). Usando CIS-FSCV en ratas anestesiadas, se puede evocar una respuesta da fásica estimulando eléctricamente el VTA con un electrodo bipolar equipado con una cánula mientras se registra en el núcleo accumbens core. Los agonistas o antagonistas farmacológicos se pueden infundir directamente en el sitio de estimulación para investigar el papel específico de los receptores VTA en la conducción de la liberación de DA fásica. Un beneficio importante de CIS-FSCV es que la función del receptor VTA se puede estudiar in vivo, basándose en estudios in vitro.

Introducción

La liberación de dopamina fásica (DA) desde el área tegmental ventral (VTA) al núcleo accumbens (NAc) juega un papel vital en los comportamientos relacionados con la recompensa. Las neuronas VTA DA cambian de un disparo tónico (3-8 Hz) a un disparo en forma de ráfaga (>14 Hz)1, que produce la liberación fásica de DA en el NAc. El VTA expresa una variedad de receptores somatodendríticos que están bien posicionados para controlar el cambio de tónico a disparo de ráfaga2,3,4,5. Identificar cuál de estos receptores, y sus respectivas entradas, controla la liberación de DA fásico profundizará nuestra comprensión de cómo se organizan los circuitos relacionados con la recompensa. El propósito de la metodología descrita aquí, la infusión y estimulación combinadas con voltamperometría cíclica de exploración rápida (CIS-FSCV), es evaluar de manera rápida y robusta la funcionalidad de los receptores VTA para impulsar la liberación de DA fásica.

El término infusión y estimulación combinadas (CIS) se refiere a la manipulación farmacológica de los receptores en un grupo de neuronas (aquí el VTA) y la estimulación de esas neuronas para estudiar la función del receptor. En la rata anestesiada, estimulamos eléctricamente el VTA para evocar una gran señal de DA fásica (1-2 μM) en el núcleo de NAc, medida por voltamperometría cíclica de escaneo rápido (FSCV). Las infusiones de fármacos farmacológicos (es decir, agonistas/antagonistas de los receptores) en el sitio de estimulación se pueden utilizar para medir la función de los receptores VTA observando el cambio posterior en la liberación de DA fásica evocada. FSCV es un enfoque electroquímico que goza de una alta resolución espacial (50-100 μm) y temporal (10 Hz), y es muy adecuado para medir eventos DA fásicos relacionados con la recompensa6,7. Esta resolución es más fina que otras mediciones neuroquímicas in vivo, como la microdiálisis. Por lo tanto, en conjunto, CIS-FSCV es muy adecuado para evaluar la regulación del receptor VTA de la liberación de dopamina fásica.

Una forma común de investigar la función del receptor VTA es mediante el uso de una combinación de enfoques electrofisiológicos que abordan cómo esos receptores alteran la velocidad de disparo de las neuronas1,8. Estos estudios son muy valiosos para comprender qué receptores están involucrados en la conducción de la activación de DA tras la activación. Sin embargo, estos estudios solo pueden sugerir lo que podría suceder aguas abajo en el terminal del axón (es decir, la liberación de un neurotransmisor). CIS-FSCV se basa en estos estudios electrofisiológicos al responder cómo la salida de VTA de disparo de ráfaga, liberación de DA fásica, está regulada por receptores ubicados en dendritas VTA y cuerpos celulares. Por lo tanto, CIS-FSCV es muy adecuado para construir sobre estos estudios de electrofisiología. Como ejemplo, la activación del receptor nicotínico puede inducir la activación de ráfagas en el VTA9,y CIS-FSCV en la rata anestesiada se utilizó para demostrar que la activación del receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) en el VTA también controla la liberación de DA fásica en el NAc10,11.

El examen mecanicista de la regulación fásica de la DA también se estudia comúnmente utilizando preparaciones de rebanadas junto con la aplicación de medicamentos en el baño. Estos estudios a menudo se centran en la regulación presináptica de la liberación de DA fásica de los terminales de dopamina, ya que los cuerpos celulares a menudo se eliminan de la rebanada12. Estas preparaciones son valiosas para estudiar los efectos de los receptores presinápticos en las terminales de dopamina, mientras que CIS-FSCV es más adecuado para estudiar los efectos de los receptores somatodendríticos en las neuronas dopaminérgicas, así como las entradas presinápticas al VTA. Esta distinción es importante, porque la activación del receptor somatodendrítico en el VTA puede tener un efecto diferente que la activación del receptor presináptico NAc. De hecho, el bloqueo de los nAChRs presinápticos dopaminérgicos en el NAc puede elevar la liberación de dopamina fásica durante la ráfaga13,mientras que lo contrario es cierto en VTA somatodendritc nAChRs10,11.

CIS-FSCV es un enfoque ideal para estudiar la capacidad de los receptores VTA para regular la liberación de DA fásica. Es importante destacar que este enfoque se puede realizar en una rata intacta, ya sea anestesiada o en movimiento libre. Este enfoque es adecuado para estudios agudos, para estudiar la función del receptor en su estado basal10,14, así como estudios a largo plazo que pueden evaluar cambios funcionales en un receptor después de la exposición al fármaco o la manipulación conductual11,15.

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Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por Elizabethtown College y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yale (IACUC). Este protocolo es específico para la preparación de ratas anestesiadas que utilizan CIS-FSCV.

1. Preparaciones prequirúrgicas

  1. Preparación de la solución de electrodos
    1. Para hacer la solución de relleno de electrodos, prepare una solución de acetato de potasio de 4 M con cloruro de potasio de 140 mM16.
  2. Preparación de electrodos
    1. Usando succión al vacío, inserte una fibra de carbono T-650 (7 μm de diámetro) en un capilar de vidrio de borosilicato (longitud = 100 mm, diámetro = 1.0 mm, diámetro interior = 0.5 mm).
    2. Una vez que la fibra de carbono se haya colocado dentro del capilar de vidrio, coloque el capilar de vidrio en un extractor de electrodo vertical, con el elemento de calor aproximadamente en el medio del capilar. Ajuste el calentador a 55 con el imán apagado.
    3. Después de tirar del capilar, levante con cuidado el soporte capilar superior para que la punta del electrodo no esté rodeada por el elemento calefactor.
    4. Usando tijeras afiladas, corta la fibra de carbono que todavía está conectando las dos piezas del capilar. Esto dará como resultado dos microelectrodos de fibra de carbono separados.
    5. Bajo un microscopio de luz, corte cuidadosamente la fibra de carbono expuesta con un bisturí afilado, de modo que la fibra de carbono se extienda aproximadamente 75-100 μm más allá del extremo del vidrio.
    6. Usando un microscopio de luz, asegúrese de que el electrodo esté libre de grietas a lo largo del capilar. También asegúrese de que el sello, donde la fibra de carbono sale del capilar, sea difícil de notar y esté libre de grietas.
      NOTA: Un buen sello ayudará a reducir el ruido durante las grabaciones. Ver estudiospublicados 17,18,19 para un protocolo más detallado.
  3. Fabricación de electrodos de referencia
    1. Suelde un pasador de oro a un alambre de plata de 5 cm.
    2. Conecte el ánodo a un clip de metal u otro conductor, el cátodo a un pasador y aplique un voltaje (~ 2 V) mientras el clip y el cable plateado están sumergidos en 0.1 M HCl.
    3. Cese el voltaje una vez que aparezca una capa blanca (AgCl) en el cable de plata.
  4. Preparación del electrodo para la implantación
    1. Suelde un pasador de oro a un alambre aislado delgado (~ 10 cm de longitud, <0.50 mm de diámetro).
    2. Retire ~ 5 cm de aislamiento del cable opuesto al pasador de oro.
    3. Llene el electrodo aproximadamente hasta la mitad con solución de electrodo.
    4. Inserte un cable aislado en el electrodo.
      NOTA: El cable debe hacer contacto con la fibra de carbono dentro del electrodo.

2. Implantes de electrodos

  1. Administrar a ratas Sprague Dawley adultas, machos (250-450 g) una inyección intraperitoneal (1,5 g/kg o 1 ml/kg de volumen) de 0,5 g/ml de uretano disuelto en solución salina estéril. Comience con una dosis inicial de uretano de 1.0−1.2 g/kg. Si el animal sigue respondiendo a la prueba de estímulo nocivo (pellizco de cola) 20 min después de la administración de uretano, administre 0,3-0,5 g/kg de uretano adicionales para una dosis total de 1,5 g/kg.
    NOTA: Para la preparación de la solución de uretano de 0,5 g/ml, agregue 10 g de uretano a 10 g (~10 ml) de solución salina. El uretano es un carcinógeno y debe manejarse con cuidado. El uretano es un anestésico importante, ya que no altera los niveles de dopamina, al igual que otros anestésicos como la ketamina/xilazina y el cloral hidratado20,21.
  2. Una vez que el animal esté profundamente anestesiado y no responda a estímulos nocivos (por ejemplo, pellizco del dedo del pie), colóquelo en el marco estereotáxico. Aplique lubricante oftálmico en cada ojo de la rata.
    NOTA: Esta es una cirugía que no es de supervivencia, pero se recomienda una buena técnica aséptica.
  3. Limpie el cuero cabelludo de la rata con un exfoliante de dos etapas (es decir, un exfoliante de yodopovidona seguido de un exfoliante de etanol al 70%; realice con una repetición de 3 ciclos).
  4. Corte el tejido del cuero cabelludo con pinzas de nariz de aguja esterilizadas y tijeras quirúrgicas. Retire una cantidad significativa de tejido para dejar espacio para los diversos implantes que se describen a continuación.
  5. Limpie suavemente la superficie del cráneo con aplicadores de punta de algodón esterilizados. Luego aplique 2-3 gotas de peróxido de hidrógeno al 3% para ayudar a identificar la lambda y el bregma.
  6. Usando un taladro estereotáxico o manual (1.0 mm, ~ 20,000 rpm), perfore un orificio de 1.5 mm de diámetro 2.5 mm anterior al bregma y 3.5 mm lateral al bregma. Implantar parcialmente (aproximadamente a mitad de camino, hasta que esté firmemente en su lugar) un tornillo (1,59 mm O.D., 3,2 mm de largo) en este orificio. Se recomienda usar solución salina estéril para regar durante la perforación para evitar lesiones térmicas.
  7. Para el electrodo de referencia, perfore un orificio de 1,0 mm de diámetro 1,5 mm anterior y 3,5 mm lateral al bregma, en el hemisferio izquierdo.
  8. A mano, inserte ~ 2 mm de alambre de referencia en este orificio, mientras envuelve el cable de referencia alrededor y debajo de la cabeza del tornillo implantado.
  9. Implante completamente el tornillo, fijando el electrodo de referencia en su lugar.
  10. En el hemisferio derecho, perfore un orificio de 1,5 mm de diámetro, 1,2 mm anterior y 1,4 mm lateral al bregma.
  11. Retire suavemente la duramadre con pinzas.
  12. Para el electrodo estimulante, perfore un orificio cuadrado (2 mm anterior-posterior, 5 mm medial-lateral) centrado en 5,2 mm posterior y 1,0 mm lateral al bregma.
  13. Usando las barras estereotácticas del brazo, baje la cánula de electrodo/guía estimulante bipolar 5 mm por debajo de la duramadre. En caso de sangrado durante la implantación del electrodo, use hisopos de algodón estériles y gasas para minimizar el sangrado.
    NOTA: El electrodo estimulante bipolar utilizado en este método está preequipado con una cánula guía (Tabla de Materiales). La cánula interna utilizada con este artículo debe enjuagarse con las puntas del electrodo estimulante bipolar cuando se inserta completamente en la cánula guía. Esto permitirá que la cánula interna se sitúe directamente entre las dos puntas del estimulador, que se encuentran a aproximadamente 1 mm de distancia. Un protocolo similar se describe en otra parte14.
  14. Usando las barras estereotácticas del brazo, baje el microelectrodo de fibra de carbono 4 mm por debajo de la duramadre. Esta ubicación se encuentra en la porción más dorsal del cuerpo estriado.
  15. Conecte el cable de referencia y la fibra de carbono a un potenciostato.
  16. Aplique una forma de onda triangular (-0.4−1.3 V, 400 V/s) durante 15 min a 60 Hz, y nuevamente durante 10 min a 10 Hz.
    NOTA: Por lo general, al aplicar formas de onda a microelectrodos de fibra de carbono en el cerebro, se agregan grupos de óxido a la superficie de la fibra de carbono. El equilibrio de esta reacción debe alcanzarse antes de la grabación; de lo contrario se producirá una deriva significativa19. El ciclo del electrodo a frecuencias más altas (60 Hz) permite que la fibra de carbono alcance el equilibrio más rápido.

3. Optimización de la fibra de carbono y estimulación de las ubicaciones de los electrodos / cánulas guía

  1. Configure el estimulador para que produzca una forma de onda eléctrica bipolar, con una frecuencia de 60 Hz, 24 pulsos, corriente de 300 μA y ancho de pulso de 2 ms/ fase.
  2. Baje suavemente el estimulador en incrementos de 0,2 mm de 5 mm a 7,8 mm por debajo de la duramadre. En cada incremento, estimule el VTA.
    NOTA: A más profundidades dorsales (5-6 mm), la estimulación del cerebro típicamente (~ 80% del tiempo) hará que los bigotes de la rata se contraigan. A más profundidades, los bigotes dejarán de temblar, lo que ocurre entre 7.5 y 8.2 mm por debajo de la duramadre. Cuando los bigotes dejan de temblar, el electrodo estimulante estará cerca o en el VTA. Esto no ocurrirá en todas las ratas, y la falta de espasmos del bigotes no debe tomarse como una señal de que la cánula de electrodo / infusión estimulante bipolar está fuera de lugar. Es posible que no se produzcan espasmos en el bigotes de todos los anestésicos (por ejemplo, isoflurano).
  3. Continúe bajando la cánula de electrodo/guía estimulante bipolar hasta que una estimulación produzca una liberación de DA fásica en el microelectrodo de fibra de carbono (actualmente en el cuerpo estriado dorsal).
    NOTA: La liberación de DA en el cuerpo estriado dorsal no siempre ocurrirá si el electrodo bipolar se implanta en el VTA, pero la observación de la liberación de DA en el estriado dorsal tras la estimulación del VTA suele ser una buena señal de que se observará una buena señal en el núcleo NAc.
  4. Baje el microelectrodo de fibra de carbono hasta que esté al menos 6,0 mm por debajo de la duramadre. Esta es la parte más dorsal del núcleo NAc.
  5. Estimule el VTA y registre la amplitud máxima del pico DA.
  6. Bajar o elevar el microelectrodo de fibra de carbono en el sitio que produce la mayor liberación de DA.
  7. Asegúrese de que el pico de la respuesta DA sea un pico de oxidación claro a 0.6 V y un pico de reducción a -0.2 V. Estos picos son indicativos de DA.

4. Infusión combinada y estimulación FSCV registro

NOTA: La Figura 1 muestra la línea de tiempo para grabar antes y después de la microinfusión de VTA.

  1. Una vez que se haya optimizado la ubicación de la fibra de carbono y la cánula guía / electrodo estimulante/ guía, estimule durante ~ 20-30 min.
    NOTA: Bajo los parámetros de estimulación actuales, no estimule más de una vez cada 3 min, para permitir la recarga vesicular22.
  2. Después de lograr una línea de base estable (variación del <20% en cinco estimulaciones), baje suavemente la cánula interna a mano en la cánula guía que está preajustada en el estimulador bipolar.
  3. Tome 2-3 registros de referencia adicionales para asegurarse de que la inserción de la cánula en sí no causó un cambio en la señal evocada. En algunos casos, la inserción y extracción de la cánula interna puede causar daño al VTA. Si la señal cambia drásticamente durante este período de referencia (>20%), entonces tome 3-4 registros adicionales hasta que la línea de base se restabilice.
  4. Usando una bomba de jeringa y microjeringa, infundir 0.5 μL de solución (por ejemplo, solución salina al 0.9%, N-metil-D-aspartato [NMDA], (2R)-amino-5-ácido fosfonovalerico [AP5]) en el VTA durante un período de 2 minutos.
  5. Después de la infusión, deje la cánula interna durante al menos 1 minuto antes de la extracción.
    NOTA: Algunos medicamentos pueden requerir abandonar la cánula interna durante más tiempo en función de la cinética de la droga, y la eliminación de la cánula interna puede hacer que la droga viaje de nuevo a través de la cánula interna. Si hay preocupación, se podría dejar la cánula interna en la cánula guía durante la totalidad de la grabación. De lo contrario, la grabación puede comenzar después de este intervalo de 1 minuto.
  6. Continúe grabando cada 3 minutos para medir los efectos posteriores a la infusión.
    NOTA: Si se infunde una solución de control y no se observa ningún efecto, es posible infundir una segunda vez10. Si hay una liberación alterada de DA causada por la inserción de la cánula interna o la infusión salina, la señal generalmente se recupera a la línea de base dentro de los 30 minutos.

5. Verificación histológica de la colocación del electrodo

  1. Al final del experimento, cree una pequeña lesión en el sitio de grabación utilizando el microelectrodo de fibra de carbono.
    1. Si el electrodo debe conservarse para la calibración posterior al experimento, use un cable de tungsteno colocado en un capilar de vidrio que sobresalga ~ 100 μm más allá de la punta capilar. En este caso, levante el electrodo del cerebro, reemplace el electrodo de grabación con el electrodo de tungsteno y bájelo a la misma coordenada dorsoventral.
      NOTA: La fibra de carbono también se puede usar para lesionar el cerebro y proporcionará una representación más precisa de la ubicación del sitio de grabación; sin embargo, el experimentador perderá la capacidad de calibrar estos electrodos.
  2. Para lesionar el sitio de grabación, aplique voltaje usando una fuente de alimentación. Comience a 1 V y aumente en 1 V cada 10 s hasta que se alcancen los 10 V.
  3. Eutanasiar al animal mediante una inyección intraperitoneal letal de pentobarbital (150 mg/kg).
  4. Perfunda la rata usando una solución de formalina al 4%.
  5. Retire la cabeza de la rata con una guillotina afilada.
  6. Usando rongeurs, retire el tejido conectivo y el cráneo que rodea el cerebro, y desaloje suavemente el cerebro de cualquier tejido restante.
  7. Almacene el cerebro en formalina al 4% durante 1 día y luego transfiéralo al 30% de sacarosa.
    NOTA: La perfusión con formalina al 4% no es necesaria para ver el sitio de la lesión, aunque como mejor práctica mejorará la reconstrucción del sitio de la lesión.
  8. Cree rebanadas de 30 μm del cerebro usando un criostato.
  9. Monte las rodajas en diapositivas y cúbralas con un resbalón de cubierta.
  10. Denote la ubicación de la lesión del microelectrodo de fibra de carbono y la ubicación de la cánula de estimulación / infusión bipolar utilizando un microscopio de luz.

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Resultados

CIS-FSCV se utilizó para estudiar la función de los receptores VTA N-metil-D-aspartato (NMDAR), los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) y los receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChRs) en la conducción de la liberación de DA fásica en el núcleo de NAc. La Figura 2 muestra datos representativos para un control negativo, infusión de solución salina al 0,9%, antes (basal) y 9 min después de la infusión (solución salina).

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Discusión

CIS-FSCV ofrece una oportunidad única para investigar los mecanismos del receptor VTA subyacentes a la liberación de DA fásica. Hay dos pasos críticos para garantizar una grabación adecuada. En primer lugar, se debe lograr un registro de referencia estable, con poca deriva en la señal DA evocada. Una forma importante de aumentar la probabilidad de establecer una grabación estable es asegurarse de que el electrodo haya tenido suficiente tiempo para circular tanto a 60 Hz como a 10 Hz (generalmente 15 minutos a 60 H...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El trabajo fue apoyado por Elizabethtown College (R.J.W, M.L. y L.M.), por una beca de posgrado de NSF (R.J.W.) y por la Escuela de Medicina de Yale (N.A.).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Electrode Filling Solution/Supplies
MicropipetteWorld Precision InstrumentsMF286-5 (28 gauge)
Potassium AcetateSigma236497-100G
Potassium ChlorideSigmaP3911-25G
Electrode Supplies
Carbon fiberThornelT650
Electrode pullerNarishige InternationalPE-22Note: horizontal pullers can be used as well
Glass capillaryA-M systems626000
Insulated wires for electrodesWeico Wire and Cable IncorporatedUL 1423Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire
Light Microscope (for viewing and cutting electrode)Fischer ScientificM3700
PinPhoenix EnterprisesHWS1646To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage
PuttyAlcolin23922-1003Used to place electrode on while cutting the carbon fiber
Scalpal BladeWorld Precision Instruments500239For cutting carbon fiber to the apprpriate length
Silver WireSigma327026-4G
FSCV Hardware/Software
Faraday CageU-LineH-3618 (36" x 24" x 42")
PotentiostatUniv. of N. Carolina, Electronics Facility
Stimulating electrodePlasticsOneMS303/2-A/SPCwhen ordering, request a 22 mm cut below pedestal
TarHeel HDCV SoftwareUniversity of North Carolina-Chapel Hill-https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information
UEI breakout boxUniv. of N. Carolina, Electronics Facilityhttps://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information
UEI power supplyUniv. of N. Carolina, Electronics Facilityhttps://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information
Stimulator Hardware
Neurolog stimulus isolatorDigitimer Ltd.DS4Neurolog 800A
Infusion/Stimulation Supplies
Infusion PumpNew Era Syringe PumpNE-300
Internal CannulaPlasticsOneC315I/SPC INTERNAL 33GA
Microliter SyringeHamilton80308
TubingPlasticsOneC313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50
Surgical Supplies
Cannula HolderKopf Instruments1776 P-1
Cotton Tip ApplicatorsVitality Medical806
Electrode HolderKopf Instruments1770
Heating PadKent ScientificRT-0501
Povidone IodineVitality Medical29906-004
ScrewsStoeltingBone Anchor Screws/Pkg.of 1001.59 mm O.D., 3.2 mm long
Silver wire reference with AgClInVivo MetricE255A
Square GauzeVitality Medical441408
StereotaxKopf InstrumentsModel 902 (Dual Arm Bar)
Histological Supplies
FormulinSigma1004960700
Power supplyBK Precision9110
SucroseSigma80497
Tungsten microelectrodeMicroProbesWE30030.5A3
Drugs for infusions
((2R)-amino-5-phosphonovaleric acidSigma AldrichA5282
N-methyl-D-aspartateSigma AldrichM3262
Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg)Sigma AldrichM9020
Scopolamine hydrobromide (S0929-1g)Sigma AldrichS0929

Referencias

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