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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieser Artikel zeigt einen effizienten chirurgischen Ansatz zur Feststellung einer akuten Ischämie bei Mäusen mit einem kleinen Schnitt. Dieser Ansatz kann von den meisten Forschungsgruppen ohne Labor-Upgrades angewendet werden.

Zusammenfassung

Ziel dieser Studie ist es, einen modifizierten chirurgischen Ansatz zur Induktion einer akuten Ischämie bei Mäusen einzuführen und zu bewerten, der in den meisten Tierlabors eingesetzt werden kann. Im Gegensatz zum herkömmlichen Ansatz für die Doppelligatur der Oberschenkelarterie (DLFA) wurde ein kleinerer Schnitt an der rechten Leistenregion vorgenommen, um die proximale Oberschenkelarterie (FA) für die Durchführung von DLFA freizusetzen. Dann wurde der Schnitt mit einer 7-0-Naht in die Knieregion gezogen, um den distalen FA freizulegen. Magnetresonanztomographie (MRT) an bilateralen Hintergliedmaßen wurde verwendet, um FA-Okklusion nach der Operation zu erkennen. 0, 1, 3, 5 und 7 Tage nach der Operation wurde die funktionelle Erholung der Hintergliedmaßen visuell beurteilt und mit der Tarlov-Skala bewertet. Die histologische Untersuchung wurde nach der Einschläferung der Tiere 7 Tage nach DLFA durchgeführt. Die Eingriffe wurden bei zehnApoE-/- Mäusen erfolgreich am rechten Bein durchgeführt, und bei der anschließenden Beobachtung starben keine Mäuse. Die Schnittgrößen bei allen 10 Mäusen betrugen weniger als 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). MRT-Ergebnisse zeigten, dass der FA-Blutfluss auf der ischämischen Seite deutlich blockiert war. Die Ergebnisse der Tarlov-Skala zeigten, dass die Hintergliedmaßenfunktion nach dem Eingriff signifikant abnahm und sich in den folgenden 7 Tagen langsam erholte. Die histologische Untersuchung zeigte eine signifikante Entzündungsreaktion auf der ischämischen Seite und eine reduzierte mikrovaskuläre Dichte in der ischämischen Hintergliedmaße. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie eine modifizierte Technik mit einem Miniaturschnitt einführt, um eine Hintergliedmaßenischämie (HLI) unter Verwendung von DLFA durchzuführen.

Einleitung

Es besteht ein ungedeckter Bedarf an präklinischen Tiermodellen für die Erforschung von Gefäßerkrankungen wie der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (PAVK). Trotz der fortgeschrittenen Entwicklungen in Diagnose und Behandlung gab es im Jahr 2018 mehr als 200 Millionen Patienten mit PAD1, und ihre Zahl steigt ständig. Obwohl mehrere neuartige Therapieansätze2,3,4,5,6,7 beschrieben wurden, bleibt die erfolgreiche Translation dieser therapeutischen Modalitäten in die klinische Anwendung eine gewaltige Aufgabe. Daher sind zuverlässige und relevante experimentelle In-vivo-Modelle erforderlich, die den menschlichen Krankheitszustand simulieren, um den potenziellen Mechanismus und die Effizienz dieser neuen therapeutischen Ansätze zur Behandlung von PAD6zu untersuchen,7.

Hyperlipidämie und Atherosklerose (AS) sind die Hauptrisikofaktoren für die Entwicklung von PAD. ApoE-/- Mäuse (auf einer fettreichen Diät) zeigen einen abnormalen Fettstoffwechsel und Hyperlipidämie und entwickeln anschließend atherosklerotische Plaques, was ApoE-/- Mäuse zur besten Wahl macht, um das klinisch relevante PAD zu simulieren. Präklinische HLI-Tiermodelle werden durch Doppelligatur der Oberschenkelarterie (DLFA) erzeugt, was der am weitesten verbreitete Ansatz in Labors auf der ganzen Welt ist8,9,10,11,12,13,14,15 zur Simulation einer akuten chronischen Ischämie. Dieser Ansatz erfordert jedoch in der Regel einen relativ großen und invasiven Schnitt. Weiterhin führt es unweigerlich dazu, dass die Tiere (insbesondere Mäuse) unter vermehrten Schmerzverletzungen und Entzündungen leiden, was auch die nachfolgenden Experimentellen Ergebnissebeeinflusst 5,6,16,17. Diese Arbeit beschreibt ein akutes auf chronisches HLI-Modell in APOE-/- Mäusen unter Verwendung eines sehr kleinen Schnitts.

Protokoll

HINWEIS: Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß der EG-Richtlinie EG 2010/63/EU durchgeführt und sind durch die lokale deutsche Gesetzgebung (35-9185.81/G[1]239/18) zugelassen. Zehn männliche ApoE-/- Mäuse mit dem C57BL/6J-Hintergrund mit einem Gewicht von 29,6-38,0 g wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht und mit einer westlichen Ernährung (1,25% Cholesterin und 21% Fett) und Wasser ad libitum für 12 Wochen ab dem Alter von 8 Wochen gefüttert. HLI wurde an 20 Wochen alten Mäusen durchgeführt, wie unten beschrieben.

1. Induktion von HLI in ApoE-/- Mäusen

  1. Bereiten Sie die erforderlichen Geräte und Werkzeuge für die Operation vor (siehe Materialtabelle und Abbildung 1). Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente vor Gebrauch durch Autoklavieren und verwenden Sie während der Operation einen Glasperlensterilisator.
  2. Betäuben Sie die Maus vor allen chirurgischen Eingriffen mit einer subkutanen Injektion (S.C.) einer Mischung aus Midazolam (5 mg/kg), Medetomidin (0,05 mg/ml/kg) und Fentanyl (0,5 mg/kg).
    1. Verwenden Sie nach Beginn der Anästhesie die Tiersalbe auf den Augen, um Trockenheit zu verhindern, und bestätigen Sie das Fehlen des Pedalentzugreflexes im Vorderbein und in der Hintergliedmaße.
  3. Anschließend die Maus auf ein Heizkissen legen, um die Körperkerntemperatur bei ca. 37 °C zu halten. Entfernen Sie mit Wattestäbchen und Haarentfernungscreme vorsichtig haare von der Hintergliedmaßenhaut auf der rechten Seite.
    HINWEIS: Die Haarentfernungscreme sollte in ausreichender Menge verwendet werden, um den Hinterteil zu bedecken, insbesondere den Leistenbereich, in dem der Schnitt gemacht wird. Die Haarentfernungscreme sollte für eine Dauer von weniger als 3 Minuten verwendet werden und anschließend 2 bis 3 Mal mit angefeuchteten Wattestäbchen entfernt werden.
  4. Legen Sie die Maus in Rückenlage unter ein Seziermikroskop auf das Heizkissen. Verwenden Sie ein Hautantiseptikum (siehe Materialtabelle),um die Haut der Maus zu desinfizieren. Anschließend machen Sie mit einer spitzen Pinzette und einer chirurgischen Schere einen ca. 3-4 mm langen Schnitt in der Mitte der Leistengegend. In Abbildung 2 finden Sie ein Schema der Prozedur.
  5. Entfernen Sie das Unterhautfettgewebe vorsichtig mit Hilfe einer feinen spitzen Pinzette, um das proximale neurovaskuläre Femoralbündel freizulegen. Verwenden Sie vorsichtig die feine spitze Pinzette, um die Membran der Oberschenkelscheide zu durchbohren. Verwenden Sie ein mit Kochsalzlösung angefeuchtetes Wattestäbchen, um die Oberschenkelarterie (FA) vorsichtig vom Oberschenkelnerv (FN) und der Oberschenkelvene (FV) wegzubewegen.
  6. Führen Sie zwei resorbierbare 7-0-Nähte durch die proximale FA und machen Sie doppelte Knoten mit einer Federschere, um die FA zwischen den beiden Bindungen zu transektieren.
  7. Um die distale FA freizulegen, führen Sie eine resorbierbare 7-0-Naht durch den unteren Rand des Schnitts und ziehen Sie den Schnitt vorsichtig in den Bereich der rechten Seite des Knies der Hintergliedmaße.
  8. Bewegen Sie das Unterhautgewebe vorsichtig zur Seite, um das neurovaskuläre Bündel freizulegen. Verwenden Sie eine feine spitze Pinzette, um die Membran der Oberschenkelscheide zu durchbohren, und sezieren Sie die FA von FV und FN.
  9. Führen Sie zwei 7-0 resorbierbare Nähte durch die distale FA und machen Sie doppelte Knoten. Verwenden Sie eine Federschere, um die FA zwischen den beiden Bindungen zu transektieren.
    HINWEIS: Am linken Glied, das bei jeder Maus als Kontrolle diente, wurde keine Ligatur durchgeführt.
  10. Verwenden Sie anschließend 6-0 resorbierbare Nähte, um den Schnitt zu nähen. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen in einem sauberen Käfig und überwachen Sie ihre Vitalparameter bis zur Genesung. Postoperative Analgetika: Buprenorphin s.c. (0,1 mg/kg Körpergewicht alle 8 Stunden für 48 h). 48 h nach der Operation Metamizol im Trinkwasser verabreichen (24 mg/5 ml Wasser entsprechen einer Dosis von 200 mg/kg 4 mal täglich).

2. Magnetresonanztomographie

HINWEIS: Einen Tag nach DLFA müssen sich die Mäuse MRT-Scans unterziehen, um die FA-Blockade zu beurteilen.

  1. Legen Sie die Maus in eine transparente Induktionskammer und betäuben Sie die Maus mit 1,5-2% Isofluran in der Umgebungsluft bis zum Verlust des Aufrichtungsreflexes.
  2. Legen Sie die Maus auf ein beheiztes Tierbett, das mit einem Bisshalter ausgestattet ist und mit einem lasergesteuerten System zum Magneten hin positioniert ist. Halten Sie die Körpertemperatur bei 37±1 °C.
  3. Halten Sie während der Bildaufnahme die Anästhesie mit 1,5-2% Isofluran in der Umgebungsluft aufrecht und überwachen Sie die Atmung mit einer Drucksonde.
  4. Erfassen Sie Bilder in der Querschnittausrichtung mit einer dreidimensionalen (3D) Time of Flight (TOF) Angiographiesequenz mit Parameter Echozeit (TE)/Wiederholungszeit (TR)/Flip angle (FA) = 2 ms/12 ms/13°, vier Mittelwerten, einer Erfassungsmatrix von 178 x 144 rekonstruiert auf 256 x 192 und 121 Scheiben, was zu einer isotropen Auflösung von 0,15 mm3führt. Um das Signal von den Venen zu unterdrücken, legen Sie eine Sättigungsscheibe distal zu den Hintergliedmaßen.

3. Klinische Bewertung und Follow-up

  1. Schätzen Sie die funktionelle Erholung in den1.,3.,5.und7. Tagen nach der Operation unter Verwendung der funktionellen Scoring-Tarlov-Skala18,19 ( Tabelle1).

4. Histologische Bewertung

  1. Sieben Tage nach der Operation eine Pentobarbital-Injektion (115 mg/kg) anwenden, um die Mäuse einzuschläfern.
  2. Perfuse phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1% Paraformaldehyd (PFA) durch den linken Herzventrikel (100 ml pro Maus). Fixieren Sie den bilateralen Gastrocnemius (Gm) der Mäuse in 4% PFA über Nacht bei 4 °C.
  3. Die Probe wird gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll 20 in Paraffineingebettet.
    1. Schneiden Sie 4-5 μm dicke Abschnitte des in Paraffin eingebetteten Gewebeblocks auf ein Mikrotom. Mit Hilfe eines runden Pinsels die geschnittenen Gewebeabschnitte in das bei 42°C gehaltene Wasserbad legen.
    2. Führen Sie den Objektträger in einem Winkel von 45° in das Wasser ein und positionieren Sie ihn vorsichtig unter der Gruppe der zu sammelnden Abschnitte.
    3. Heben Sie die Rutsche vorsichtig aus dem Wasser und lassen Sie die Abschnitte an der Rutsche befestigen und über Nacht im Tischinkubator bei 37 ° C trocknen.
  4. Führen Sie eine Hämatoxylin/ Eosin (HE) -Färbung der Paraffinabschnitte durch.
    1. Legen Sie die Dias, die die Schnitte enthalten, in Schieberhalter. Bereiten Sie 3 Behälter mit frischem Xylol vor und legen Sie die Folien für 5 Minuten in jeden Behälter, um die Abschnitte zu entparaffinisieren.
    2. Rehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie die Scheiben nacheinander in 96%, 80%, 70%, 50%, 30% Ethanol und entionisiertes Wasser für jeweils 5 Minuten tauchen.
    3. Färben Sie in Hämatoxylinlösung für 10 min.
    4. Geben Sie die Scheiben in einen Behälter mit entionisiertem Wasser und spülen Sie sie ab, indem Sie sie 5 Minuten lang unter fließendes Leitungswasser legen.
    5. Überprüfen Sie mit einem Mikroskop die Intensität der Hämatoxylinfärbung. Wenn die Färbung eine eindeutige Identifizierung der Zellkerne ermöglicht, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn die Färbeintensität die Identifizierung von Zellkernen nicht erleichtert oder wenn die Intensität der Färbung schwach ist, legen Sie den Objektträger für 1 Minute in die Hämatoxylinlösung, wiederholen Sie das Waschen mit Wasser (Schritt 4.4.4) und überprüfen Sie es dann erneut.
    6. Gegenfleck in Eosin-Y-Lösung für 5 min.
    7. Dehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie die Scheiben nacheinander für eine Dauer von jeweils 10 s in Behälter mit entionisiertem Wasser und 30%, 50%, 70%, 80% und 96% Ethanol tauchen. Als nächstes legen Sie die Abschnitte nacheinander in drei Behälter mit frischem Xylol für jeweils 10 s.
    8. Platzieren Sie die Objektträger horizontal auf mikroskopischen Objektträger-Speicherkarten mit den Abschnitten nach oben. Fügen Sie genügend Montagemedium auf dem Dia hinzu und montieren Sie die Dias mit Deckgläsern.
  5. Führen Sie die immunhistochemische (IHC) Färbung der Paraffinabschnitte durch.
    1. Wiederholen Sie die Deparaffinisierungs- und Rehydratisierungsschritte 4.4.1-4.4.2. Tauchen Sie dann die Abschnitte in einen Behälter mit 10 mM Natriumcitratpuffer, pH 6, und bringen Sie die Probe in einer Mikrowelle zum Kochen.
      HINWEIS: Da eine Über- oder Unterhitzung der Proben zu einer inkonsistenten Färbung führen kann, halten Sie die Temperatur 10 Minuten lang knapp unter dem Siedepunkt.
    2. Als nächstes kühlen Sie die Abschnitte auf einer Tischplatte für 30 Minuten. Danach waschen Sie die Abschnitte dreimal für 5 min in PBS. Trocknen Sie den Bereich um die Probe sorgfältig ab und zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen großen Kreis um die Probe. .
      HINWEIS: Berühren Sie niemals die Probe. Die Markierung mit einem hydrophoben Pen bildet eine hydrophobe Grenze, die die Verwendung eines kleineren Volumens der Antikörperlösung erleichtert.
    3. Abschreckung der endogenen Peroxidaseaktivität durch Platzieren des Abschnitts in 0,3%H2O2in PBS für 10 min. Blockschnitte mit 400 μL Blockpuffer (PBS enthalten 3% Rinderserumalbumin und 0,3% nichtionisches Reinigungsmittel) für 1 h bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.
    4. Waschen Sie die Abschnitte in PBS für 5 min. Als nächstes fügen Sie 100-400 μL verdünnten Anti-CD31-Antikörper (1:250) hinzu, um den Abschnitt abzudecken. Anschließend brüten Sie Abschnitte über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer aus.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Abschnitt vollständig mit der Antikörperlösung bedeckt ist.
    5. Entfernen Sie den primären Antikörper und waschen Sie die Abschnitte dreimal in PBS für eine Dauer von jeweils 5 minuten.
    6. Bereiten Sie die 3, 3 '-Diaminobenzidin (DAB) -Mischung vor, indem Sie 1 Tropfen des DAB-Konzentrats zu 1 ml des DAB-Verdünnungsmittels geben und gut mischen. Anschließend 100-400 μL DAB-Gemisch in die Schnitte geben und 2 min lang mit dem Auge genau überwachen, bis eine akzeptable Färbeintensität beobachtet wird.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Abschnitt vollständig mit der DAB-Mischung bedeckt ist.
    7. Anschließend 5 min unter fließendem Leitungswasser abspülen. Führen Sie die Hämatoxylinfärbung wie in den Schritten 4.4.3-4.4.5 beschrieben durch.
    8. Führen Sie die in Schritt 4.4.6 beschriebene Eosin-Y-Färbung durch. Führen Sie die in Schritt 4.4.7 beschriebenen Dehydratisierungsschritte durch.
    9. Montage der Abschnitte mit Deckgläsern unter Verwendung des Montagemediums. Verwenden Sie ImageJ, um den Prozentsatz der positiven CD31-Fläche (%) in 5 zufällig ausgewählten Feldern (40x) zu schätzen, die wie zuvor beschrieben als mikrovaskuläre Dichte angesehen werden können21.

5. Statistische Auswertung

  1. Verwenden Sie eine statistische Analysesoftware, um die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardabweichung auszudrücken und einen ungepaarten t-Testan den Vergleichen durchzuführen. Betrachten Sie P < 0,05 als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Eigenschaften von ApoE-/- Mäusen
DLFA-Operationen wurden erfolgreich an 10 Mäusen durchgeführt, um das HLI-Modell zu etablieren, und keine der Mäuse starb nach dem Eingriff. Um Veränderungen des Körpergewichts zu verfolgen, wurden Mäuse vor dem DLFA-Verfahren (Pre-DLFA) und 7 Tage nach der DLFA-Operation (Post-DLFA) gewogen. Die Gewichte vor DLFA lagen zwischen 29,6 und 38,0 g (Mittelwert 34,74 ± 2,47 g), und die Gewichte nach DLFA lagen zwischen 2...

Diskussion

Diese Studie berichtet über einen modifizierten, vereinfachten und chirurgisch effizienten Ansatz zur Etablierung eines HLI-Modells inApoE-/-Mäusen mit Doppeltligatur in den proximalen und distalen Regionen des FA durch einen 3-4 mm-Schnitt ohne erforderliche Labor-Upgrades. Das Hauptmerkmal dieser Methode ist die geringere Größe der Inzision im Vergleich zu zuvor berichteten Studien, die die Maus-HLI-Modelle8,9,10

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass der Artikelinhalt in Ermangelung kommerzieller oder finanzieller Beziehungen verfasst wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagungen

Die Autoren danken Viktoria Skude, Alexander Schlund und Felix Hörner für die hervorragende technische Unterstützung.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
10x Phosphate buffer salineRoth9143.1Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
30% H2O2Roth9681.2Used for immunohistochemistry stain
6-0 absorbable suturesPROLENE8776HUsed for stitching the skin
6-0 absroable suturePROLENEEP8706Used in Surgery
7-0 absorbable suturesPROLENEEH8021EUsed for ligating the artery
7-0 absroable suturePROLENEEP8755Used in Surgery
Acetic acidRoth6755.1Used for haematoxylin and eosin stain
Albumin Fraktion VRoth8076.2Used for immunohistochemistry stain
AutoclaveSystec GmbHSystec VX-150Used for the sterilisation of the surgical instruments
Axio vert A1 microscopeCarl ZeissZEISS Axio Vert.A1Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Bruker BioSpec 94/20 AVIIIBruker Biospin MRI GmbHN/AScan the femoral artery blockage
Buprenovet Sine 0,3mg/mlBayer AG2542 (WDT)Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation
CD31 antibodyAbcamab28364Used for immunohistochemistry stain
Eosin Y solution 0.5 % in waterRothX883.1Used for haematoxylin and eosin stain
Epitope Retrieval Solution pH 6Leica Biosystems6046945Used for immunohistochemistry stain
Ethanol ≥ 99,5 %Roth5054.1Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
FentanylCayman Chemical437-38-7Used for anesthesia
Fine point forcepsMedixplus93-4505SUsed for separating the artery from nerve and vein
Glass bead sterilisatorSimon KellerType 250Used for sterilisation of the surgical instruments
Graefe iris forceps curvedVUBUVUBU-02-72207Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue
Hair Remover cream, Veet (with aloe vera)Reckitt Benckiser108972Remove hair from mice hind limbs
Heating plateSTÖRK-TRONIC7042092Keep the satble temperature of mice
HematoxylinRothT865.2Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Leica surgical microscopeLeicaM651Enlarge the field of view to facilitate the operation
Liquid DAB+Substrate Chromogen SystemDakoK3468Used for immunohistochemistry stain
Male ApoE-/- miceCharles River LaboratoriesN/AUsed for establish the Peripheral artery disease mice model
MedetomidineCayman Chemical128366-50-7Used for anesthesia
Micro Needle HolderBlack & Black SurgicalB3B-18-8Holding the needle
Micro suture tying forcepsLife Saver Surgical IndustriesPS-MSF-145Used to assist in knotting during surgery
MicrotomeBiobaseBk-Mt268mUsed for tissue sectioning
MidazolamRatiopharm44856.01.00Used for anesthesia
MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025SA InstrumentsN/amonitoring vital signs of animal during MRI scan
Octeniderm farblosSchülke & Mayr GmbH180212used for disinfection of the skin
Ointment for the eyes and noseBayer AG1578675Keep the eyes wet under the anesthesia
ParaformaldehydeRoth0335.1Used for fixation of the tissue
PentobarbitalNembutal76-74-4Used for anesthesia
SalineDeltaSelect1299.99.99Used for anesthesia
Spring handle scissors with fine, sharp tipsBlack & Black SurgicalB66167Used for cutting the artery
SuperCut ScissorsBlack & Black SurgicalB55992Used for cutting the skin
Triton X-100Roth9002-93-1Used for immunohistochemistry stain
Western diet, 1.25% Cholesterolssniff Spezialdiäten GmbHE15723-34Diet for the mice
XyleneRoth4436.3Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain

Referenzen

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