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  • Références
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Résumé

Cet article démontre une approche chirurgicale efficace pour établir une ischémie aiguë chez la souris avec une petite incision. Cette approche peut être appliquée par la plupart des groupes de recherche sans aucune mise à niveau du laboratoire.

Résumé

Le but de cette étude est d’introduire et d’évaluer une approche chirurgicale modifiée pour induire une ischémie aiguë chez la souris qui peut être mise en œuvre dans la plupart des laboratoires animaliers. Contrairement à l’approche conventionnelle pour la double ligature de l’artère fémorale (DLFA), une incision plus petite sur la région inguinale droite a été faite pour exposer l’artère fémorale proximale (AF) à effectuer DLFA. Ensuite, à l’aide d’une suture 7-0, l’incision a été traînée vers la région du genou pour exposer l’AF distale. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) sur les membres postérieurs bilatéraux a été utilisée pour détecter l’occlusion de l’AF après la chirurgie. À 0, 1, 3, 5 et 7 jours après la chirurgie, la récupération fonctionnelle des membres postérieurs a été évaluée visuellement et notée à l’aide de l’échelle de Tarlov. L’évaluation histologique a été réalisée après euthanasie des animaux 7 jours après le DLFA. Les procédures ont été effectuées avec succès sur la jambe droite chez dix souris ApoE- / - et aucune souris n’est morte lors d’une observation ultérieure. Les tailles d’incision chez les 10 souris étaient inférieures à 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). Les résultats de l’IRM ont montré que le flux sanguin d’AF du côté ischémique était clairement bloqué. Les résultats de l’échelle de Tarlov ont démontré que la fonction des membres postérieurs a considérablement diminué après la procédure et s’est lentement rétablie au cours des 7 jours suivants. L’évaluation histologique a montré une réponse inflammatoire significative du côté ischémique et une densité microvasculaire réduite dans le membre postérieur ischémique. En conclusion, cette étude introduit une technique modifiée utilisant une incision miniature pour effectuer une ischémie des membres postérieurs (HLI) en utilisant DLFA.

Introduction

Il existe un besoin non satisfait de modèles animaux précliniques pour la recherche sur les maladies vasculaires telles que la maladie artérielle périphérique (MAP). Malgré les développements avancés dans le diagnostic et le traitement, il y avait plus de 200 millions de patients atteints d’AOMI en2018 1, et leur nombre est en constante augmentation. Bien que plusieurs nouvelles approches thérapeutiques2,3,4,5,6,7 aient été décrites, la traduction réussie de ces modalités thérapeutiques en application clinique reste une tâche ardue. Par conséquent, des modèles expérimentaux in vivo fiables et pertinents simulant l’état de la maladie humaine sont nécessaires pour étudier le mécanisme potentiel et l’efficacité de ces nouvelles approches thérapeutiques pour traiter l’AOMI6,7.

L’hyperlipidémie et l’athérosclérose (SA) sont les principaux facteurs de risque de développement de l’AOMI. Les souris ApoE-/- (avec un régime riche en graisses) présentent un métabolisme anormal des graisses et une hyperlipidémie et développent par la suite des plaques d’athérosclérose, ce qui fait des souris ApoE-/- le meilleur choix pour simuler l’AOMI cliniquement pertinente. Les modèles animaux HLI précliniques sont générés par double ligature de l’artère fémorale (DLFA), qui est l’approche la plus largement utilisée dans les laboratoires du monde entier8,9,10,11,12,13,14,15 pour simuler l’ischémie aiguë sur chronique. Cependant, cette approche nécessite généralement une incision relativement grande et invasive. En outre, cela conduit inévitablement les animaux (en particulier les souris) à souffrir d’une douleur accrue et d’une inflammation, ce qui influence également les résultats expérimentaux ultérieurs5,6,16,17. Cet article décrit un modèle HLI aigu sur chronique chez des souris APOE-/- en utilisant une très petite incision.

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Protocole

NOTE: Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément à la directive CE 2010/63/UE et ont été approuvées par la législation allemande locale (35-9185.81/G[1]239/18). Dix souris mâles ApoE-/- avec le fond C57BL / 6J, pesant 29,6-38,0 g, ont été logées sur un cycle clair / sombre de 12 h et nourries avec un régime occidental (1,25% de cholestérol et 21% de matières grasses) et de l’eau ad libitum pendant 12 semaines à partir de l’âge de 8 semaines. HLI a été effectué sur des souris âgées de 20 semaines comme décrit ci-dessous.

1. Induction de HLI chez les souris ApoE-/-

  1. Préparer l’équipement et les outils nécessaires pour la chirurgie (voir le tableau des matériaux et la figure 1). Stérilisez les instruments chirurgicaux par autoclavage avant utilisation et utilisez un stérilisateur à billes de verre pendant l’opération.
  2. Anesthésier la souris avec une injection sous-cutanée (S.C.) d’un mélange de midazolam (5 mg/kg), de médétomidine (0,05 mg/ml/kg) et de fentanyl (0,5 mg/kg) avant toutes les interventions chirurgicales.
    1. Après le début de l’anesthésie, utilisez la pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse et confirmez l’absence du réflexe de retrait de la pédale dans le membre antérieur et le membre postérieur.
  3. Ensuite, placez la souris sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle centrale à environ 37 ° C. À l’aide de cotons-tiges et de crème dépilatoire, retirez soigneusement les poils de la peau des membres postérieurs du côté droit.
    REMARQUE: La crème dépilatoire doit être utilisée en quantité suffisante pour couvrir les membres postérieurs, en particulier la région inguinale où l’incision sera faite. La crème dépilatoire doit être utilisée pendant une durée inférieure à 3 minutes et doit ensuite être retirée avec des cotons-tiges humidifiés 2 à 3 fois.
  4. Posez la souris en position couchée sur le coussin chauffant sous un microscope à dissection. Utilisez un antiseptique cutané (voir le Tableau des matériaux)pour désinfecter la peau de la souris. Ensuite, utilisez des pinces pointues et des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision d’environ 3-4 mm au milieu de la région inguinale. Voir la figure 2 pour un schéma de la procédure.
  5. Retirez soigneusement le tissu adipeux sous-cutané à l’aide d’une pince pointue fine pour exposer le faisceau neurovasculaire fémoral proximal. Utilisez soigneusement les pinces pointues fines pour percer la membrane de la gaine fémorale. Utilisez un coton-tige humidifié avec une solution saline pour éloigner soigneusement l’artère fémorale (AF) du nerf fémoral (FN) et de la veine fémorale (FV).
  6. Passez deux sutures résorbables 7-0 à travers le FA proximal et faites des nœuds doubles à l’aide de ciseaux à ressort pour transecter le FA entre les deux attaches.
  7. Pour exposer l’AF distale, passez une suture résorbable 7-0 à travers le bord inférieur de l’incision et faites glisser doucement l’incision vers la région du côté droit du genou du membre postérieur.
  8. Déplacez soigneusement le tissu sous-cutané pour exposer le faisceau neurovasculaire. Utilisez de fines pinces pointues pour percer la membrane de la gaine fémorale et disséquer l’AF du FV et du FN.
  9. Passez deux sutures résorbables 7-0 à travers le FA distal et faites des nœuds doubles. Utilisez des ciseaux à ressort pour transecter le FA entre les deux traverses.
    REMARQUE: Aucune ligature n’a été effectuée sur le membre gauche, qui a servi de contrôle chez chaque souris.
  10. Ensuite, utilisez 6-0 sutures résorbables pour coudre l’incision. Placez la souris sur un coussin chauffant dans une cage propre et continuez à surveiller ses paramètres vitaux jusqu’à la récupération. Fournir des analgésiques postopératoires : Buprénorphine s.c. (0,1 mg/kg de poids corporel toutes les 8 heures pendant 48 h). 48 h après l’opération, administrer du métamizole dans l’eau potable (24 mg/5 mL d’eau correspond à une dose de 200 mg/kg 4 fois par jour).

2. Imagerie par résonance magnétique

REMARQUE: Un jour après DLFA, les souris doivent subir une IRM pour évaluer le blocage de l’AF.

  1. Placez la souris dans une chambre d’induction transparente et anesthésiez la souris avec 1,5 à 2% d’isoflurane dans l’air ambiant jusqu’à perte du réflexe de redressement.
  2. Placez la souris sur un lit d’animal chauffé équipé d’un porte-morsure et positionné vers l’aimant avec un système contrôlé par laser. Maintenir la température corporelle à 37±1 °C.
  3. Lors de l’acquisition d’images, maintenez l’anesthésie avec 1,5 à 2% d’isoflurane dans l’air ambiant et surveillez la respiration à l’aide d’une sonde de pression.
  4. Acquérir des images dans l’orientation transversale de la tranche en utilisant une séquence d’angiographie tridimensionnelle (3D) en temps de vol (TOF) avec paramètre temps d’écho (TE)/temps de répétition (TR)/angle de retournement (FA) = 2 ms/12 ms/13°, quatre moyennes, une matrice d’acquisition de 178 x 144 reconstruite en 256 x 192 et 121 tranches, résultant en une résolution isotrope de 0,15 mm3. Pour supprimer le signal des veines, placez une tranche de saturation distalement sur les membres postérieurs.

3. Évaluation clinique et suivi

  1. Estimer la récupération fonctionnelle dans les1er,3e,5eet 7e jours après la chirurgie en utilisant l’échelle de Tarlov de notation fonctionnelle18,19 (Tableau 1).

4. Évaluation histologique

  1. Sept jours après la chirurgie, appliquer une injection de pentobarbital (115 mg / kg) pour euthanasier les souris.
  2. Perfuser une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1 % de paraformaldéhyde (PFA) à travers le ventricule cardiaque gauche (100 mL par souris). Fixer le gastrocnémien bilatéral (Gm) des souris dans 4% de PFA pendant la nuit à 4 ° C.
  3. Incorporer l’échantillon dans de la paraffine selon le protocole20décrit précédemment.
    1. Couper des sections de 4 à 5 μm d’épaisseur du bloc de tissu incorporé à la paraffine sur un microtome. À l’aide d’un pinceau rond, placez les sections de tissu coupé dans le bain-marie maintenu à 42 ° C.
    2. Insérez la lame du microscope dans l’eau à un angle de 45° et positionnez-la soigneusement sous le groupe de sections à collecter.
    3. Soulevez délicatement la glissière de l’eau et laissez les sections s’attacher à la glissière et sécher pendant la nuit dans l’incubateur de paillasse à 37 ° C.
  4. Effectuer une coloration à l’hématoxyline/éosine (HE) des sections de paraffine.
    1. Placez les diapositives contenant les sections dans des supports de diapositives. Préparez 3 récipients de xylène frais et placez les lames dans chaque récipient pendant 5 minutes pour déparaffiniser les sections.
    2. Réhydrater les sections en trempant successivement les tranches dans de l’éthanol à 96%, 80%, 70%, 50%, 30% et de l’eau désionisée pendant 5 min chacune.
    3. Tache dans la solution d’hématoxyline pendant 10 min.
    4. Transférer les tranches dans un récipient d’eau désionisée et rincer en les plaçant sous l’eau courante du robinet pendant 5 min.
    5. À l’aide d’un microscope, vérifiez l’intensité de la coloration à l’hématoxyline. Si la coloration permet d’identifier clairement les noyaux cellulaires, passez à l’étape suivante. Si l’intensité de coloration ne facilite pas l’identification des noyaux cellulaires ou si l’intensité de la coloration est faible, placez la lame dans la solution d’hématoxyline pendant 1 min, répétez le lavage à l’eau (étape 4.4.4), puis vérifiez à nouveau.
    6. Contre-tache dans une solution d’éosine-Y pendant 5 min.
    7. Déshydrater les sections en trempant successivement les tranches dans des récipients contenant de l’eau désionisée et de l’éthanol 30%, 50%, 70%, 80% et 96% successivement pendant une durée de 10 s chacun. Ensuite, placez les sections séquentiellement dans trois récipients de xylène frais pendant 10 s chacun.
    8. Placez les diapositives horizontalement sur des cartes de stockage de diapositives microscopiques avec les sections orientées vers le haut. Ajoutez suffisamment de support de montage sur la diapositive et montez les diapositives avec des couvercles.
  5. Effectuer la coloration immunohistochimique (IHC) des sections de paraffine.
    1. Répétez les étapes de déparaffinisation et de réhydratation 4.4.1 à 4.4.2. Ensuite, immergez les sections dans un récipient avec un tampon de citrate de sodium de 10 mM, pH 6, et portez l’échantillon à ébullition au micro-ondes.
      REMARQUE: Comme le surchauffage ou le sous-échauffement des échantillons peut provoquer des taches incohérentes, maintenez la température juste en dessous du point d’ébullition pendant 10 minutes.
    2. Ensuite, refroidissez les sections sur une paillasse pendant 30 minutes. Par la suite, lavez les sections dans PBS trois fois pendant 5 min. Séchez soigneusement la zone autour de l’échantillon et dessinez un grand cercle autour de l’échantillon à l’aide d’un stylo hydrophobe. .
      REMARQUE: Ne touchez jamais l’échantillon. Le marquage avec un stylo hydrophobe crée une limite hydrophobe, ce qui facilite l’utilisation d’un plus petit volume de solution d’anticorps.
    3. Étancher l’activité endogène de la peroxydase en plaçant la section dans 0,3% H2O2 dans PBS pendant 10 min. Sections de bloc avec 400 μL de tampon bloc (PBS contient 3% d’albumine sérique bovine et 0,3% de détergent non ionique) pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humidifiée.
    4. Lavez les sections dans PBS pendant 5 min. Ensuite, ajoutez 100-400 μL d’anticorps anti-CD31 dilués (1:250) assez pour couvrir la section. Ensuite, incuber des sections pendant la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée.
      REMARQUE: Assurez-vous que la section est complètement recouverte de la solution d’anticorps.
    5. Retirez l’anticorps primaire et lavez les sections trois fois dans du PBS pendant une durée de 5 minutes chacune.
    6. Préparer le mélange de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) en ajoutant 1 goutte du concentré DAB à 1 mL du diluant DAB, et bien mélanger. Ensuite, ajoutez 100 à 400 μL de mélange DAB aux sections et surveillez attentivement à l’œil nu pendant 2 minutes jusqu’à ce qu’une intensité de coloration acceptable soit observée.
      REMARQUE: Assurez-vous que la section est complètement recouverte du mélange DAB.
    7. Ensuite, rincez à l’eau courante du robinet pendant 5 min. Effectuer la coloration à l’hématoxyline comme décrit aux étapes 4.4.3-4.4.5.
    8. Effectuer la coloration à l’éosine-Y décrite à l’étape 4.4.6. Effectuer les étapes de déshydratation décrites à l’étape 4.4.7.
    9. Montez les sections avec des couvercles à l’aide d’un support de montage - effectué. Utilisez ImageJ pour estimer le pourcentage de la surface CD31 positive (%) dans 5 champs sélectionnés au hasard (40x) qui peuvent être considérés comme une densité microvasculaire comme décrit précédemment21.

5. Analyse statistique

  1. Utilisez un logiciel d’analyse statistique pour exprimer les résultats sous forme de moyenne ±'écart-type et pour effectuer un test tnon apparié sur les comparaisons. Considérez P < 0,05 comme étant statistiquement significatif.

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Résultats

Caractéristiques des souris ApoE-/-
Les chirurgies DLFA ont été effectuées avec succès sur 10 souris pour établir le modèle HLI, et aucune des souris n’est morte après la procédure. Pour suivre les changements de poids corporel, les souris ont été pesées avant la procédure DLFA (pré-DLFA) et 7 jours après la chirurgie DLFA (post-DLFA). Les poids pré-DLFA variaient de 29,6 à 38,0 g (moyenne de 34,74 ± 2,47 g), et les poids post-DLFA varia...

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Discussion

Cette étude rapporte une approche modifiée, simplifiée et chirurgicalement efficace pour établir un modèle HLI chez des souris ApoE- / - en utilisant une double ligature dans les régions proximale et distale de l’AF à travers une incision de 3-4 mm sans aucune mise à niveau de laboratoire requise. La principale caractéristique de cette méthode est la plus petite taille de l’incision par rapport aux études précédemment rapportées décrivant les modèles HLI de souris8

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent que le contenu de l’article a été composé en l’absence de relations commerciales ou financières qui pourraient être interprétées comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

Les auteurs remercient Viktoria Skude, Alexander Schlund et Felix Hörner pour l’excellent support technique.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
10x Phosphate buffer salineRoth9143.1Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
30% H2O2Roth9681.2Used for immunohistochemistry stain
6-0 absorbable suturesPROLENE8776HUsed for stitching the skin
6-0 absroable suturePROLENEEP8706Used in Surgery
7-0 absorbable suturesPROLENEEH8021EUsed for ligating the artery
7-0 absroable suturePROLENEEP8755Used in Surgery
Acetic acidRoth6755.1Used for haematoxylin and eosin stain
Albumin Fraktion VRoth8076.2Used for immunohistochemistry stain
AutoclaveSystec GmbHSystec VX-150Used for the sterilisation of the surgical instruments
Axio vert A1 microscopeCarl ZeissZEISS Axio Vert.A1Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Bruker BioSpec 94/20 AVIIIBruker Biospin MRI GmbHN/AScan the femoral artery blockage
Buprenovet Sine 0,3mg/mlBayer AG2542 (WDT)Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation
CD31 antibodyAbcamab28364Used for immunohistochemistry stain
Eosin Y solution 0.5 % in waterRothX883.1Used for haematoxylin and eosin stain
Epitope Retrieval Solution pH 6Leica Biosystems6046945Used for immunohistochemistry stain
Ethanol ≥ 99,5 %Roth5054.1Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
FentanylCayman Chemical437-38-7Used for anesthesia
Fine point forcepsMedixplus93-4505SUsed for separating the artery from nerve and vein
Glass bead sterilisatorSimon KellerType 250Used for sterilisation of the surgical instruments
Graefe iris forceps curvedVUBUVUBU-02-72207Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue
Hair Remover cream, Veet (with aloe vera)Reckitt Benckiser108972Remove hair from mice hind limbs
Heating plateSTÖRK-TRONIC7042092Keep the satble temperature of mice
HematoxylinRothT865.2Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Leica surgical microscopeLeicaM651Enlarge the field of view to facilitate the operation
Liquid DAB+Substrate Chromogen SystemDakoK3468Used for immunohistochemistry stain
Male ApoE-/- miceCharles River LaboratoriesN/AUsed for establish the Peripheral artery disease mice model
MedetomidineCayman Chemical128366-50-7Used for anesthesia
Micro Needle HolderBlack & Black SurgicalB3B-18-8Holding the needle
Micro suture tying forcepsLife Saver Surgical IndustriesPS-MSF-145Used to assist in knotting during surgery
MicrotomeBiobaseBk-Mt268mUsed for tissue sectioning
MidazolamRatiopharm44856.01.00Used for anesthesia
MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025SA InstrumentsN/amonitoring vital signs of animal during MRI scan
Octeniderm farblosSchülke & Mayr GmbH180212used for disinfection of the skin
Ointment for the eyes and noseBayer AG1578675Keep the eyes wet under the anesthesia
ParaformaldehydeRoth0335.1Used for fixation of the tissue
PentobarbitalNembutal76-74-4Used for anesthesia
SalineDeltaSelect1299.99.99Used for anesthesia
Spring handle scissors with fine, sharp tipsBlack & Black SurgicalB66167Used for cutting the artery
SuperCut ScissorsBlack & Black SurgicalB55992Used for cutting the skin
Triton X-100Roth9002-93-1Used for immunohistochemistry stain
Western diet, 1.25% Cholesterolssniff Spezialdiäten GmbHE15723-34Diet for the mice
XyleneRoth4436.3Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain

Références

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