Immunfluoreszenz, Clearing und Multiphotonenmikroskopie des gesamten Eierstocks zur quantitativen 3D-Analyse der sich entwickelnden Ovarialreserve in der Maus

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Abbildung ganzer Eierstöcke für quantitative und qualitative Analysen mittels Whole-Mount-Immunfärbung, Multiphotonenmikroskopie sowie 3D-Visualisierung und -Analyse. Dieses Protokoll ermöglicht eine zuverlässige, wiederholbare Verarbeitung mit hohem Durchsatz, die für die Toxikologie, die klinische Diagnostik und genomische Assays der Eierstockfunktion geeignet ist.

Zusammenfassung

Die weibliche Fruchtbarkeit und die reproduktive Lebensdauer hängen von der Qualität und Quantität der Eierstock-Eizellreserve ab. Schätzungsweise 80% der weiblichen Keimzellen, die in die meiotische Prophase I eintreten, werden während der fetalen Eizellabnutzung (FOA) und der ersten Woche des postnatalen Lebens eliminiert. Drei Hauptmechanismen regulieren die Anzahl der Eizellen, die während der Entwicklung überleben, und etablieren die Eierstockreserve bei Frauen, die in die Pubertät eintreten. In der ersten Welle des Eizellverlustes werden 30-50% der Eizellen während der frühen FOA eliminiert, ein Phänomen, das auf eine hohe lange eingestreute Kernelement-1 (LINE-1) -Expression zurückzuführen ist. Die zweite Welle des Eizellverlustes ist die Beseitigung von Eizellen mit meiotischen Defekten durch einen meiotischen Qualitätskontrollpunkt. Die dritte Welle des Eizellverlustes tritt perinatal während der primordialen Follikelbildung auf, wenn einige Eizellen keine Follikel bilden. Es bleibt unklar, was jede dieser drei Wellen des Eizellverlustes reguliert und wie sie die Eierstockreserve bei Mäusen oder Menschen formen.

Immunfluoreszenz und 3D-Visualisierung haben einen neuen Weg eröffnet, um die Entwicklung von Eizellen im Kontext des gesamten Eierstocks abzubilden und zu analysieren, anstatt in weniger informativen 2D-Schnitten. Dieser Artikel bietet ein umfassendes Protokoll für die Immunfärbung des gesamten Eierstocks und die optische Reinigung, das Vorbereitungen für die Bildgebung mittels Multiphotonenmikroskopie und 3D-Modellierung mit kommerziell verfügbarer Software liefert. Es zeigt, wie diese Methode verwendet werden kann, um die Dynamik der Eizellabnutzung während der Eierstockentwicklung bei C57BL/6J-Mäusen zu zeigen und den Eizellverlust während der drei Wellen der Eizellelimination zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann auf pränatale und frühe postnatale Eierstöcke zur Visualisierung und Quantifizierung von Eizellen sowie auf andere quantitative Ansätze angewendet werden. Wichtig ist, dass das Protokoll strategisch entwickelt wurde, um eine zuverlässige, wiederholbare Verarbeitung mit hohem Durchsatz zu ermöglichen, die die Anforderungen in der Toxikologie, klinischen Diagnostik und genomischen Assays der Eierstockfunktion erfüllen kann.

Einleitung

Die meisten weiblichen Säugetiere werden mit einer endlichen Anzahl von meiotisch stillgelegten Eizellen geboren, die in den Urfollikeln gespeichert sind und die Eierstockreserve (OR) ^bilden1,2. Der OP bestimmt die gesamte weibliche reproduktive Lebenserwartung und Gesundheit³. Der OP nimmt normalerweise mit zunehmendem Alter ab und kann bei Exposition gegenüber bestimmten genotoxischen Wirkstoffen (Bestrahlung / Chemotherapie) und Umweltbelastungen (Unterernährung) vorzeitig erschöpft sein, was zu Unfruchtbarkeit führt ^4,5,6. Idiopathische weibliche Unfruchtbarkeit kann oft auf die genetische und physiologische Qualität von Eiern zurückgeführt werden, die sich aus dem OP entwickeln, und bleibt schlecht verstanden ^7,8. Da die weibliche Follikelausstattung weitgehend durch die Geburt vorbestimmt ist, ist es wichtig, die regulatorischen Mechanismen zu verstehen, die an der Einrichtung und Aufrechterhaltung der OP beteiligt sind.

Bei Mäusen beginnt die OP-Bildung mit der Spezifizierung von primordialen Keimzellen (PGCs) um den Embryonaltag (E) 7.5². Die PGCs wandern zu den Genitalrücken, wo sie sich um etwa E10,5⁹ befinden werden. Die folgende ausgedehnte Proliferation tritt bei unvollständiger Zytokinese auf, was zur Bildung von Zysten führt, die später in der Entwicklung abgebaut werden^10,11. Bei ungefähr E12,5 wird das Gonadengeschlecht bestimmt, und die PGC-Proliferation stoppt in den Eierstöcken. Bei Weibchen treten PGCs, jetzt Eizellen, bei etwa E13,5^12,13 in die meiotische Prophase I (MPI) ein. Die Eizellen durchlaufen eine ausgedehnte MPI und eine Verhaftung im Diktate um die Zeit der Geburt. In der ersten Woche nach der Geburt ist jede festsitzende Eizelle von Granulosazellen umgeben und bildet dadurch einen Urfollikel.

Die Anzahl der Urfollikel im OP eines Weibchens hängt davon ab, wie viele Eizellen die Wellen der Eizellelimination überlebt haben, die vor und während des MPI-Stillstands durch Apoptose, Autophagie oder Nekrose auftreten^14,15. Die erste Welle tritt während der fetalen Entwicklung auf und wird als FOA bezeichnet. FOA ist ein evolutionär konservierter Prozess bei Weibchen (Säugetiere und Nicht-Säugetiere), wobei schätzungsweise ^50-80% der Eizellen je nach weiblicher Art^16,17,18,19 eliminiert werden. Bei Mäusen tritt FOA während E15.5 bis E18.5 auf und wurde auf die Reaktivierung und Expression von Retrotransposon-LINE-1-Sequenzen zurückgeführt, die zum Tod der Eizellen^20,21 führten. Die zweite Welle der Eizellelimination erfolgt durch einen meiotischen Checkpoint, der Eizellen mit meiotischen Defekten wie nicht reparierten DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) ^{eliminiert22,23}. Die nächste Welle der Eizellelimination tritt während des Zystenabbaus auf und gipfelt in der Bildung von Urfollikeln, von denen jede eine einzelne Eizelle 10,11,24,25 enthält.

Bei Mäusen wird die ursprüngliche Follikelreserve weitgehend durch die Pubertät festgelegt, danach nimmt sie ab, da die primordialen Follikel während regelmäßiger Fortpflanzungszyklen für das Wachstum aktiviert werden. Die OP-Größe variiert zwischen einzelnen Frauen und zwischen verschiedenen genetischen Stämmen von Mäusen; Die genetische Regulation der ^OP-Größe ist jedoch nicht gut verstanden^26,27,28,29. Genetische Studien der OP-Regulation werden durch das Fehlen standardisierter Protokolle zur Untersuchung der Wellen der Eizellelimination während der pränatalen und postnatalen Entwicklung behindert. Mehrere Methoden zur Quantifizierung von Eizellen wurden an Mäusen entwickelt, wobei die häufigste und am weitesten verbreitete histomorphometrische Auswertung histomorphometrischer Abschnitte^30,31 ist. Bei dieser Technik werden Eizellen auf seriellen Abschnitten mit histologischen Färbungen wie Hämatoxylin und Eosin (H & E) und periodischer Säure-Schiff (PAS) oder fluoreszierenden Markern identifiziert. Diese Technik ist zuverlässig, wenn alle Bedingungen konstant bleiben, einschließlich der Abschnittsdicke, der effizienten Wiederherstellung aller Abschnitte im gesamten Eierstock und der Zählschemata der einzelnen Laboratorien. Die von verschiedenen Labors gemeldeten Zahlen unterscheiden sich jedoch oft erheblich und sind daher nicht leicht vergleichbar.

Darüber hinaus kann die Verwendung verschiedener Mausstämme angesichts genetischer Unterschiede auch die Anzahl der Eizellen beeinflussen. Weitere Berechnungsansätze wurden für die histomorphometrische Auswertung entwickelt und umfassen die automatisierte Erkennung von Eizellen mit dem Fraktionierungsansatz, die automatische Zählung mit Rechenalgorithmen und die 3D-Rekonstruktion histologischer Bilder, um eine Mehrfachzählung derselben Eizelle^zu verhindern 31,32,33,34,35,36 . Selbst wenn diese Verbesserungen der histomorphometrischen Auswertung hinzugefügt werden, ist die Technik relativ arbeitsintensiv, insbesondere für groß angelegte und Hochdurchsatzstudien. Die gesammelten Daten sind aufgrund von Unterschieden in den Zählschemata, Computeralgorithmen und der verwendeten Software möglicherweise nicht reproduzierbar und zwischen den Studien vergleichbar.

In jüngster Zeit, beschleunigt durch die Entwicklung neuer Multiphotonen- und Lichtblattmikroskopie mit mittlerer Auflösung und optischer Gewebereinigungsmethoden, werden 3D-Modellierungs- und Analysetechniken für intakte Eierstöcke zur Methode der Wahl, um die Anzahl der Eizellen effizient zu quantifizieren und die Proteinlokalisierung und -dynamik^{zu untersuchen 37,38}. Diese 3D-Methoden sind typischerweise vorteilhaft gegenüber histologischen Methoden, da Gewebe und Organe besser erhalten und intakt gehalten werden. Darüber hinaus liefern 3D-Analyse und -Modellierung zusätzliche Einblicke in Funktionen und Wechselwirkungen innerhalb und zwischen Zellnischen oder Substrukturen innerhalb des Organs, die bei der 2D-Analyse übersehen werden können.

Die 3D-Analyse ganzer Organe erfordert die Optimierung von Fixations-, Immunfärbungs- und optischen Clearingprotokollen für einzelne Organe wie Eierstöcke ohne Gewebeverzerrung oder -schädigung. Eine zusätzliche Optimierung der Probenmontage für die Bildgebung ist für die hochauflösende Mikroskopie erforderlich und kann von der verfügbaren Bildgebungsplattform abhängen. Schließlich erzeugt die Bildgebung des gesamten intakten Eierstocks eine große Datenmenge für nachfolgende Rechenanalysen. Daher besteht die Notwendigkeit, standardisierte 3D-Methoden zur Zählung von Eizellen für vergleichende Studien und über Entwicklungsstadien hinweg zu entwickeln.

Dieses Protokoll verwendet Standard-Immunfärbungs- und zuvor berichtete Clearing-Protokolle und konzentriert sich auf einen einfachen, benutzerfreundlichen und Hochdurchsatz-Ansatz 38,39,40,41. Das Protokoll ist optimiert, um eine große Anzahl pränataler und postnataler Eierstöcke bis zum postnatalen Tag 28 (P28) und unterschiedliche Größen von Eierstöcken aus verschiedenen genetischen Hintergründen der Maus zu analysieren. Die Immunfärbungsschritte sind für alle Stadien ähnlich; Die Clearingprotokolle unterscheiden sich jedoch für pubertäre Eierstöcke aufgrund ihrer größeren Größe, ScaleS4(0) und CUBIC für kleine und große Eierstöcke bzw.^40,41. Darüber hinaus wird bei P28-Mäusen vor der Fixierung eine Ganzkörperperfusion durchgeführt, um die Autofluoreszenz von Blutzellen zu verhindern. Auf der Leica DIVE/4Tune-Plattform wurde ein Multiphotonenmikroskop als Alternative zur Lichtblattmikroskopie zur Bilderfassung entwickelt, und für dieses Protokoll wurde die IMARIS 3D-Visualisierungs- und Analysesoftware mit verschiedenen Analysewerkzeugen ausgewählt. Dieses Protokoll ist einfach zu befolgen und weniger praktisch, daher zeitsparend. Darüber hinaus ist die Quantifizierung der Eizellen relativ schnell, abhängig von der Größe des Eierstocks und der Anordnung der Eizellen.

Protokoll

Alle verwendeten Mäuse gehörten dem genetischen Stamm C57BL/6J an (siehe Materialtabelle). Dieser Stamm wurde vollständig sequenziert und ist Standard für viele Studien zur Struktur und Funktion der Eierstöcke. Mäuse wurden gemäß den NIH-Richtlinien untergebracht, und die durchgeführten Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Jackson Laboratory genehmigt. Die in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien und Zusammensetzungen sind in der Materialtabelle bzw. in der Tabelle 1 aufgeführt.

1. Herstellung von Reagenzien

1. Fixativ: Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS vor. Fügen Sie beispielsweise für 24 Proben (0,5 ml/Probe = 12 ml Gesamtvolumen) 3 ml 16% PFA-Elektronenmikroskopiegrad zu 9 ml 1x PBS hinzu.
2. Permeabilisierungspuffer
   1. Messen Sie Polyvinylalkohol (PVA) am Tag vor dem Benötigen des Permeabilisierungspuffers in ein 250-ml-Plastikbecherglas mit 1x PBS. Rühren Sie die Lösung über Nacht um, damit sich PVA vollständig auflösen kann.
   2. Natriumborhydrid zum gelösten PVA geben und das Gemisch für ca. 3-5 min homogenisieren lassen. Erwarten Sie die Lösung für Schaum.
   3. Fügen Sie Triton X-100 zur Lösung hinzu und verwenden Sie den Puffer, sobald der Triton X-100 aufgelöst ist.
      HINWEIS: Es dauert lange, bis sich PVA auflöst (mindestens 3 h), und das Eindringen des Antikörpers hängt davon ab, wie gut er sich auflöst. Bei größeren Eierstöcken ist es entscheidend, PVA vollständig aufzulösen.
3. Blockieren des Puffers
   1. Rinderserumalbumin (BSA) in ein Becherglas mit 1x PBS dosieren. Rühren Sie die Lösung um, bis die BSA aufgelöst ist.
   2. Fügen Sie Glycin, Triton X-100, Penicillin-Streptomycin und Natriumazid hinzu. Rühren Sie, bis die Lösung homogenisiert ist. Den Puffer in eine Flasche geben und bei 4 °C lagern. Fügen Sie vor dem Gebrauch normales Ziegenserum hinzu.
4. Waschpuffer: Messen Sie PVA in ein Becherglas, das 1x PBS enthält. Rühren Sie die Lösung über Nacht um, damit sich die PVA auflösen kann. Fügen Sie Triton X-100 und Natriumazid hinzu. Sobald der Puffer gemischt ist, lagern Sie ihn bei 4 °C.
5. ScaleS4(0)-Lösung (pH 8,1): D-Sorbit in PBS in einem Becherglas unter Rühren bei ≤100 °C auflösen. Fügen Sie Harnstoff zur Lösung hinzu, und sobald sich der Harnstoff auflöst, schalten Sie die Hitze aus und lassen Sie die Lösung rühren, bis sie vollständig aufgelöst ist. Glycerin und Dimethylsulfoxid hinzufügen und umrühren, bis die Lösung homogenisiert ist. Lagern Sie die Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln.
   HINWEIS: Die ScaleS4(0)-Lösung muss am ersten Tag der Reinigung der Eierstöcke frisch zubereitet werden.
6. ScaleCUBIC-1 Lösung
   1. Harnstoff in einem PBS-haltigen Becherglas unter Rühren bei einer Temperatur ≤100 °C auflösen. Messen Sie N,N,N ′,N′-Tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylendiamin in ein separates Becherglas, fügen Sie dann den gelösten Harnstoff hinzu und rühren Sie bei einer Temperatur von ≤100 °C, bis sich die Reagenzien vollständig auflösen. Sobald alle Reagenzien in Lösung sind, schalten Sie die Heizung aus und kühlen Sie sie bei Raumtemperatur ab. Im Dunkeln aufbewahren.
   2. Entgasen Sie die Lösung, indem Sie sie in einen Filterkolben geben. Befestigen Sie den Kolben mit Schläuchen an einem Vakuum, decken Sie den Kolben ab und schalten Sie das Vakuum ein, bis Blasen in der Lösung verschwinden. Verwenden Sie die Lösung nach dieser Entgasung.
      HINWEIS: Die Lösung kann im Dunkeln gelagert werden, um bis zu einem Monat verwendet zu werden.
7. Saccharoselösung: Saccharose in 1x PBS auflösen; Dann entgasen Sie die Lösung vor dem Gebrauch.
   HINWEIS: Bereiten Sie die Lösung vor Gebrauch frisch vor.
8. ScaleCUBIC-2 Lösung
   1. Saccharose wird in einem PBS-haltigen Becherglas unter Rühren bei einer Temperatur ≤100 °C gelöst. Harnstoff hinzufügen und bei einer Temperatur von ≤100 °C umrühren, bis sich der Harnstoff auflöst. Schalten Sie die Heizung aus.
   2. Triethanolamin und Triton X-100 hinzufügen. Rühren Sie, bis die Lösung homogenisiert ist. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und lagern Sie sie im Dunkeln. Entgasen Sie die Lösung vor der Verwendung.
      HINWEIS: Die Lösung kann im Dunkeln gelagert werden, um bis zu einem Monat verwendet zu werden.

2. Dissektion und Fixierung der pränatalen Eierstöcke (Abbildung 1A)

1. Paarung erwachsener Weibchen (≥8 Wochen) und Männchen gemäß dem genehmigten institutionellen Protokoll. Suchen Sie jeden Morgen nach Vaginalpfropfen.
   HINWEIS: Der Morgen eines Vaginalpfropfens wird als 0,5 Tage nach dem Koitum (d.p.c) oder E0.5 bezeichnet.
2. Bereiten Sie am Tag der Dissektion 4% Paraformaldehyd (PFA) und Aliquot ~ 0,5 ml in Mikrozentrifugenröhrchen vor, die auf der Bankseite platziert werden (~ 4 pro schwangerer Frau).
   HINWEIS: PFA ist ein gefährlicher Stoff und muss unter einer chemischen Haube gehandhabt werden.
3. Bereiten Sie drei 100-mm-Platten mit ~ 10 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für jede schwangere Frau vor (zur Ernte von Gebärmutter, zur Sezierung des Mesonephros-Eierstock-Komplexes und zur Isolierung der Eierstöcke).
4. Euthanasieren Sie schwangere Frauen, die Embryonen des bevorzugten Entwicklungsstadiums tragen, und fahren Sie mit der Dissektion fort. Euthanasieren Sie nicht mehr als 1-2 Weibchen gleichzeitig. Verwenden Sie ein zugelassenes Protokoll für die Euthanasie von trächtigen Mäusen (z. B. CO₂ -Exposition gefolgt von zervikaler Dislokation).
5. Sobald eine Frau eingeschläfert ist, besprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Heben Sie mit einer Pinzette die Bauchhaut an und verwenden Sie eine Schere, um einen V-förmigen Schnitt durch den Bauch und die Körperwand zu machen. Schneiden Sie entlang der beiden Seiten des Einschnitts und schälen Sie die Haut zurück, um die inneren Organe und Föten in der Gebärmutter freizulegen.
6. Schneiden und trennen Sie mit einer Pinzette und einer Schere die Gebärmutter mit den Föten vom Bauchfett und den Eierstockarterien und -venen. Entfernen Sie die Gebärmutter und legen Sie sie in eine 100-mm-Platte, die 1x PBS enthält. Lassen Sie die Föten in PBS frei, indem Sie die Gebärmutterwand durchschneiden und den Dottersack durchstechen. Durchtrennen Sie die Nabelschnur.
   HINWEIS: Bei Föten, die jünger als 15 Tage in der Schwangerschaft sind, sorgt die Euthanasie der Mutter und die Entfernung aus der Gebärmutter für einen schnellen Tod des Fötus. Föten, die älter als 15 Tage in der Schwangerschaft bis zur Geburt sind, müssen durch Enthauptung eingeschläfert werden.
7. Übertragen Sie einen Fötus in eine neue Platte mit frischem 1x PBS. Um einen E15.5-Fötus zu enthaupten, stecken Sie die beiden Hinterbeine auf der Platte vorsichtig mit einer Pinzette auseinander, um den Fötus zu immobilisieren. Halten Sie mit einer zweiten Pinzette in der dominanten Hand den Hals zwischen den Pinzettenzangen und drücken Sie den Kopf des Fötus ab, oder schneiden Sie den Hals mit einer Schere ab.
8. Mit der dominanten Handzange unterhalb der Vorderbeine abschneiden und den Oberkörper vorsichtig wegziehen. Als nächstes führen Sie einen Endpunkt der dominanten Handzange in die Peritonealhöhle vertikal in die Öffnung des Bauchbereichs ein, während der andere Endpunkt der Pinzette draußen bleibt. Schließen Sie die Pinzette, klemmen Sie die Körperwand zusammen, um sie zu schneiden, und legen Sie die inneren Organe frei.
9. Entfernen Sie mit der gleichen Pinzette vorsichtig die Organe, einschließlich Darm und Leber, bis die Niere und die Fortpflanzungsorgane sichtbar werden. Bestimmen Sie das Geschlecht des Fötus: Bei E15,5 haben Eierstöcke eine längliche wurstartige Form, während die Hoden oval sind.
   HINWEIS: In früheren Stadien kann eine Genotypisierung erforderlich sein, um das Geschlecht zu bestimmen.
10. Halten Sie mit einer Pinzette den weiblichen Fötus fest und verwenden Sie die andere Pinzette, um jeden Mesonephros-Eierstock-Komplex zu greifen und ihn sanft von den Nieren und den Müllerschen Kanälen zu trennen. Legen Sie die Eierstöcke in eine neue Platte mit 1x PBS, lassen Sie den Mesonephros anhaften, entfernen Sie jedoch das umgebende Gewebe, um sicherzustellen, dass die Eierstöcke freigelegt sind. Legen Sie beide Eierstöcke in Mikrozentrifugenröhrchen in ~ 0,5 ml 4% PFA und fixieren Sie sie über Nacht bei 4 ° C. Ersetzen Sie am nächsten Tag PFA durch 70% Ethanol.
11. Für die Dissektion und Fixierung von E18.5-Eierstöcken trennen Sie die Föten wie oben beschrieben von der Gebärmutter und befolgen Sie dann das in Abschnitt 3 beschriebene Protokoll für präpubertäre Welpen (Abbildung 1B).

3. Dissektion und Fixierung der präpubertären Eierstöcke (Abbildung 1B)

1. Bereiten Sie 4% PFA und Aliquot ~ 0,5 ml in 1,5 ml Röhrchen vor und legen Sie sie auf die Bankseite (~ eine Tube pro Welpe). Bereiten Sie 35 mm Platten mit 1x PBS (~ eine pro Welpe) vor. Euthanasieren Sie die Welpen mit dem genehmigten institutionellen Protokoll.
   HINWEIS: Enthauptung ist die bevorzugte Methode der Euthanasie für Mäuse im Alter von 8 Tagen oder jünger. Neugeborene Mäuse können entweder mit einer 3-4 "Sezierschere oder einer 5-7" Mayo-Schere enthauptet werden.
2. Bestimmen Sie das Geschlecht von Welpen, indem Sie den anogenitalen Abstand messen, der bei Männern größer ist als bei Frauen. Verwenden Sie eine scharfe Enthauptungsschere, um weibliche Welpen zu enthaupten. Legen Sie den Körper mit offener Seite nach unten auf ein Papiertuch, um das Blut abzulassen (~ 5-10 s).
3. Sichern Sie den Welpen auf dem Rücken, indem Sie einen Stift in das Pfotenpolster jedes Fußes legen. Besprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut des Welpen vom Körper fernzuhalten, und verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen V-förmigen Schnitt in die Haut des Unterbauchs zu machen.
4. Führen Sie die Schere in den Schnitt unter der Haut ein und schneiden Sie entlang beider Seiten des Abdomens. Verwenden Sie die Pinzette, um die Haut sanft zurückzuziehen und den Unterbauch freizulegen. Bewegen Sie den Darm vorsichtig nach oben und platzieren Sie die Gebärmutterhörner neben der Blase. Folgen Sie jedem Gebärmutterhorn in Richtung Niere und lokalisieren Sie den Eierstock mit umgebendem Fettgewebe unterhalb jeder Niere.
5. Um die Eierstöcke zu sezieren, halten Sie das Gebärmutterhorn mit einer Pinzette (Pinzette A, Abbildung 1B) unter den Eierstock und den Eileiter und heben Sie es vorsichtig vom Körper weg. Greifen Sie mit einer anderen Pinzette (Pinzette B) vorsichtig unter das erste Paar Pinzetten, so dass der Eierstock und der Eileiter im Fettkissen über dem zweiten Pinzettenpaar sichtbar sind. Schneiden Sie dann mit einer Schere unter die zweite Pinzette oder ziehen Sie vorsichtig, um die Eierstöcke und das anhaftende Gewebe zu lösen.
6. Legen Sie die isolierten Organe in eine Platte mit 1x PBS. Schneiden Sie das zusätzliche Fettgewebe, den Eileiter und das Gebärmutterhorn ab, um den Eierstock zu reinigen und zu isolieren. Öffnen Sie vorsichtig den Schleimbeutel, der den Eierstock umgibt, und legen Sie den gesamten Eierstock frei.
7. Schneiden Sie die Schleimbeutelmembran ab, ohne den Eierstock zu beschädigen, und lassen Sie Gewebe um das Hilum (bandartige Struktur zwischen dem Eierstock und dem Fortpflanzungstrakt) zurück, um den Eierstock zu behandeln, wie in Abbildung 1B, P5 gezeigt. Sobald die Eierstöcke getrimmt sind, legen Sie sie in 4% PFA und fixieren Sie die Eierstöcke über Nacht bei 4 ° C. Ersetzen Sie am nächsten Tag 4% PFA durch 70% Ethanol und lagern Sie die Eierstöcke bei 4 ° C bis zum Schritt des Immunfärbeprotokolls.

4. Durchblutung, Dissektion und Fixierung der pubertären Eierstöcke (Abbildung 1C)

1. Perfundieren Sie Mäuse nach institutionell zugelassenen Protokollen mit der Maus unter tiefer Betäubung in einem chemischen Abzug. Bereiten Sie die Perfusionsausrüstung und die Reagenzien vor. Siehe das detaillierte Protokoll unter ⁴².
   HINWEIS: Perfusion ist ein terminales Euthanasieverfahren, das das Blut im gesamten Gefäßsystem durch ein Gewebefixiermittel ersetzt.
2. Wiegen Sie eine pubertäre weibliche Maus (P28) und notieren Sie das Gewicht der Maus (typischerweise zwischen 13 g und 15 g). Berechnen Sie die Menge des zugelassenen Anästhesiemittels, das verwendet werden soll.
   HINWEIS: Hier wurden in diesem Protokoll 0,35 ml Tribromethanol pro 10 g Körpergewicht verwendet.
3. Verwenden Sie eine 10-ml-Einwegspritze mit einer 20-G-Nadel, um die Spritze mit dem zugelassenen Anästhetikum zu füllen. Ersetzen Sie die 20 G Nadel durch eine 26 G x 3/8 Nadel.
4. Halten Sie die Maus vorsichtig zurück, indem Sie die dorsale Halshaut mit einer Hand zerquetschen. Drehen Sie die Maus um, um den Bauch freizulegen. Injizieren Sie die zuvor berechnete Menge an Anästhetikum in die Peritonealhöhle. Legen Sie die Maus in einen Behälter mit einer Abdeckung, bis die Anästhesie wirksam wird (d.h. die Maus bewegt sich nicht mehr).
5. Sobald sich die Maus nicht mehr bewegt, kneifen Sie vorsichtig ihre Füße zusammen, um zu überprüfen, ob es keine Reaktion gibt, und stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig betäubt ist, bevor Sie die Perfusion einleiten. Legen und befestigen Sie die Maus auf dem Rücken, indem Sie alle vier Beine vorsichtig durch die Pfotenpolster auf ein Brett stecken. Stellen Sie sicher, dass die Beine in einer entspannten Position festgeklemmt und nicht überdehnt sind.
6. Besprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol vom Bauch bis zur Brustregion. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Bauchhaut sanft zu kneifen und anzuheben, und verwenden Sie dann eine Schere, um einen kleinen V-förmigen Schnitt durch die Haut und die Körperwand zu machen.
7. Heben Sie die Hautlappe aus der Körperhöhle ab und führen Sie die Schere unter die Haut und die Körperwand ein. Schneiden Sie die Haut und die Körperwand gerade nach oben zum Kopf bis zum Rand der Brusthöhle am Brustbein.
8. Öffnen Sie die Brusthöhle, indem Sie die Rippen auf beiden Seiten des Brustbeins vorsichtig bis knapp unter das Schulterblatt schneiden. Achten Sie darauf, die Lunge unterhalb des Brustkorbs nicht zu punktieren. Greifen Sie die Haut- / Rippenklappen mit einer Pinzette und stecken Sie sie ein, um die inneren Organe freizulegen.
9. Schneiden Sie vorsichtig jedes Gewebe wie den Thymus ab, das den klaren Zugang zum Herzen behindern kann. Legen Sie alle Organe, einschließlich des Magen-Darm-Traktes, frei, um eine visuelle Bestätigung zu ermöglichen, dass der gesamte Körper durchblutet ist, einschließlich des Unterbauchs.
10. Verwenden Sie eine Dissektionsschere, um den rechten Vorhof des Herzens zu schneiden und Blut aus dem System freizusetzen. Halten Sie das Herz vorsichtig mit einer Pinzette fest und führen Sie eine Perfusionsnadel (verbunden mit einem Peristaltikpumpenregler) in den linken Ventrikel.
11. Pumpen Sie ~ 10 ml PBS mit sanftem, aber konstantem Druck, bis Gewebe wie Leber, Nieren und Fortpflanzungstrakt (Abbildung 1E, F) von rosa zu weiß werden. Als nächstes ersetzen Sie das PBS durch frisch hergestelltes 1% PFA und setzen die Perfusion mit etwa 10 ml PFA fort oder bis das Zucken im unteren Körper der Maus (z. B. Schwanz) auftritt.
    HINWEIS: Diese Fixationszittern deuten auf eine erfolgreiche Perfusion hin.
12. Sobald die Perfusion abgeschlossen ist, lokalisieren Sie das Fettpolster mit den Eierstöcken unterhalb der Niere und sezieren Sie vorsichtig den gesamten Fortpflanzungstrakt, einschließlich des Fettpads, der Eierstöcke und der Gebärmutterhörner, und legen Sie den Trakt in eine Durchstechflasche mit 4% PFA. Fixieren Sie die Eierstöcke bei Raumtemperatur über Nacht (~ 16-24 h). Ersetzen Sie dann die 4% PFA für mindestens einen Tag durch 70% Ethanol und trimmen Sie die Eierstöcke (Abbildung 1E, F), wie oben beschrieben, bevor Sie mit dem Immunfärbeprotokoll beginnen.

5. Immunfärbung des gesamten Eierstocks (Abbildung 2A)

HINWEIS: Üben Sie sterile Techniken während des Immunfärbungsprotokolls, insbesondere beim Wechseln der Puffer, um eine Kontamination während längerer Inkubationszeiten zu vermeiden.

1. Führen Sie alle Immunfärbungsschritte in einer 24-Well-Platte durch, wie in Abbildung 2A dargestellt. Passen Sie das Reagenzienvolumen für andere Formate an. Wechseln Sie die Puffer sorgfältig, um den Verlust kleiner pränataler und präpubertärer Eierstöcke zu vermeiden.
   HINWEIS: Andere Formate, wie 48- und 96-Well-Platten, können verwendet werden, aber die tieferen Vertiefungen und schmaleren Öffnungen erschweren das Absaugen von Puffern, ohne Eierstöcke zu verlieren oder zu beschädigen.
2. Tag 1
   1. Pippette 1 ml PBS/Well in die Anzahl der benötigten Wells in einer sauberen 24-Well-Platte. Schneiden Sie die Spitze einer 200 μL Pipettenspitze ab, um eine breite Öffnung zu machen, und verwenden Sie sie, um präpubertäre Eierstöcke vorsichtig von 1,5 ml Röhrchen mit 70% Ethanol in die Vertiefungen zu übertragen. Verwenden Sie für die pubertären Eierstöcke eine 1000 μL Pipettenspitze, wobei die Spitze für den Transfer abgeschnitten ist.
      HINWEIS: Die breitere Öffnung der Spitze verhindert Gewebeschäden während des Transfers.
   2. Sobald alle Proben in die Bohrlöcher übertragen wurden, verwenden Sie eine neue Spitze, um das PBS abzusaugen und durch frische 0,8 ml PBS / Well zu ersetzen. Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur auf einem Shaker bei ~100-150 U / min über Nacht. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Permeabilisierungspuffers (siehe Tabelle 1 und Abschnitt 1).
      HINWEIS: Die neue Spitze verhindert, dass Eierstöcke an der Spitze haften bleiben, und der PBS-Inkubationsschritt ermöglicht es den Eierstöcken, sich in PBS auszugleichen und vor der Färbung zu rehydrieren.
3. Tag 2
   1. Abschließende Vorbereitung des Permeabilisierungspuffers. Aspirieren Sie PBS aus den Bohrlöchern und ersetzen Sie es durch 0,8 ml des Permeabilisierungspuffers pro Bohrloch. Legen Sie die Platten wieder auf den Shaker und inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 4 h.
   2. Nach 4 Stunden Inkubation wird der Permeabilisierungspuffer vollständig abgesaugt und durch einen Blockpuffer von 0,5 ml ersetzt (siehe Tabelle 1 und Abschnitt 1). Verschließen Sie die Platte mit Parafilm, um eine Verdunstung zu verhindern, legen Sie sie in einen sicher abgedeckten Behälter auf einem Shaker und inkubieren Sie die Proben mit sanftem Rühren im Blockpuffer über Nacht (16-24 h) bei Raumtemperatur.
4. Tag 3
   1. Bereiten Sie die primären Antikörper durch Verdünnung im Blockpuffer vor. Zur Visualisierung von Eizellen verwenden Sie Eizellmarker, z. B. Ratten-Antikeimzell-nukleäre saure Peptidase (GCNA) / TRA98 für pränatale und präpubertäre Eierstöcke und Kaninchen-Anti-DEAD-Box-Helikase 4 (DDX4) / Maus-Vasa-Homolog (MVH) für präpubertäre und pubertäre Eierstöcke. Zur Quantifizierung der LINE-1 ORF1p-Expression in pränatalen Eierstöcken verwenden Sie Kaninchen-Anti-LINE-1 ORF1p oder einen anderen verfügbaren Antikörper.
      HINWEIS: Das GCNA/TRA98-Signal ist in den pubertären Eierstöcken nicht nachweisbar.
   2. Saugen Sie den blockierenden Puffer aus den Proben ab und ersetzen Sie ihn durch 0,5 ml verdünnte primäre Antikörper. Versiegeln Sie die Platte mit Parafilm, um eine Verdunstung zu verhindern. Legen Sie die Platten in einen Behälter mit einer Abdeckung, um das Austrocknen der Proben während der Inkubation zu verhindern. Legen Sie den Behälter auf den Shaker und inkubieren Sie die Proben für 3-4 Tage bei Raumtemperatur.
5. Tag 7
   1. Entfernen Sie vorsichtig den Parafilm von den Platten und saugen Sie die primäre Antikörpermischung aus den Proben ab. Lagern Sie die primären Antikörpergemische bei 4 °C (für bis zu einem Monat oder drei Anwendungen) und verwenden Sie sie später wieder, indem Sie sie mit frischen Antikörpern ergänzen (z. B. 2 μL frischer Antikörperaliquot pro 5 ml der zuvor verwendeten Mischung).
   2. Geben Sie 1 ml Waschpuffer (siehe Tabelle 1 und Abschnitt 1 ) pro Vertiefung zu den Proben und schaukeln Sie die Platten vorsichtig für einige Sekunden, um die verbleibenden Antikörper abzuspülen. Den Waschpuffer vorsichtig absaugen und durch 0,8 ml frischen Waschpuffer ersetzen und die Platten bei Raumtemperatur über Nacht schütteln.
6. Tag 8
   1. Saugen Sie den Waschpuffer über Nacht ab, ersetzen Sie ihn durch 0,8 ml frischen Waschpuffer und schütteln Sie ihn bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Wiederholen Sie den Waschschritt mit frischem Waschpuffer für weitere 2 h.
   2. Ersetzen Sie nach der letzten Wäsche den Waschpuffer durch 0,5 ml sekundäre Antikörpermischungen, die in einem Sperrpuffer verdünnt sind, z. B. Ziegen-Anti-Ratten-Alexa Fluor 555 und Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 647 bei 1:1.000 Verdünnung. Bereiten Sie die sekundäre Antikörpermischung frisch für jedes Immunfärbeexperiment vor.
   3. Versiegeln Sie die Platte mit Parafilm, um eine Verdunstung während der Inkubation zu verhindern. Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur im Dunkeln oder in mit Aluminiumfolie überzogenen Platten mit sanftem Rühren für 3 Tage.
      HINWEIS: Dieser Schritt und alle nachfolgenden Schritte finden im Dunkeln oder mit Aluminiumfolienfolie statt.
7. Tag 11
   1. Saugen Sie die sekundäre Antikörpermischung ab und führen Sie eine erste Wäsche mit 1 ml Waschpuffer durch. Schaukeln Sie die Platten vorsichtig für einige Sekunden, um die verbleibenden sekundären Antikörper abzuspülen.
   2. Saugen Sie den Waschpuffer ab, ersetzen Sie ihn durch 0,8 ml frischen Waschpuffer und inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 2 h mit Schütteln, geschützt vor Licht. Wiederholen Sie den Waschschritt 2 Mal für insgesamt 3 Wäschen. Fahren Sie nach der dritten Wäsche mit dem Reinigungsschritt fort (Abschnitt 6).

6. Clearing von immungefärbten ganzmontierbaren Eierstöcken (Abbildung 2A).

HINWEIS: Führen Sie alle Reinigungsschritte im Dunkeln durch, indem Sie die Platten in Aluminiumfolie einwickeln oder in undurchsichtige Behälter legen. Die Reinigungsschritte unterscheiden sich für präpubertäre und pubertäre Eierstöcke.

1. Tag 11 [Pränatale und präpubertäre Eierstöcke werden in einem einstufigen Protokoll gereinigt]
   1. Nach der letzten Wäsche wird der Waschpuffer abgesaugt und durch 0,8 ml frisch hergestellte ScaleS4(0)-Lösung ersetzt (siehe Tabelle 1 und Abschnitt 1). Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und inkubieren Sie die Proben im Dunkeln mit Schütteln bei Raumtemperatur für drei bis vier Tage vor der Bildgebung.
   2. Ersetzen Sie die ScaleS4(0)-Lösung bei Bedarf täglich durch eine neue Lösung. Seien Sie vorsichtig beim Ersetzen der Lösungen, da gereinigte Eierstöcke transparent werden und schwer zu sehen sind. Fahren Sie nach dem Löschen mit dem Probenaufbau und der Bildgebung fort (Abschnitt 7).
      HINWEIS: Wechselnde Lösungen haben die Bildqualität nicht wesentlich verbessert. Tägliche Änderungen erhöhen die Wahrscheinlichkeit, kleine und meist transparente Proben zu verlieren.
2. Tage 11-15 [Pubertale Eierstöcke werden in einem zweistufigen Protokoll gereinigt]
   1. Nach der letzten Immunfärbungswäsche den Waschpuffer absaugen und durch 0,8 ml ScaleCUBIC-1 ersetzen (siehe Tabelle 1 und Abschnitt 1). Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und schütteln Sie die Proben vorsichtig bei 37 °C für 3 Tage im Dunkeln. Ersetzen Sie die ScaleCUBIC-1-Lösung täglich durch die frische Lösung.
   2. Waschen Sie die Proben am 15. Tag jeweils 3 Mal für 10 Minuten in 0,8 ml PBS bei Raumtemperatur mit leichtem Schütteln. Ersetzen Sie das PBS durch 0,8 ml entgaste 20% Saccharose, die frisch mit PBS zubereitet werden. Bei Raumtemperatur 1 h vorsichtig schütteln.
   3. Ersetzen Sie die 20%ige Saccharoselösung durch 0,8 ml ScaleCUBIC-2-Lösung (siehe Tabelle 1 und Abschnitt 1 ), verschließen Sie die Platte mit Parafilm und schütteln Sie sie vorsichtig bei Raumtemperatur mit täglichem Wechsel der ScaleCUBIC-2-Lösung. Für 4-5 Tage löschen und mit dem Bild fortfahren. Seien Sie vorsichtig beim Austausch von Lösungen, um Probenverlust zu vermeiden, da gereinigte Eierstöcke transparent und schwer zu sehen sind. Fahren Sie mit dem Probenaufbau und der Bildgebung fort (Abschnitt 7).

7. Probenaufbau und Bildgebung mit einem Multiphotonenmikroskop

HINWEIS: Alle unten beschriebenen Schritte wurden mit einem Leica DIVE/4TUNE/FALCON mit zwei abstimmbaren, modegebundenen Ti:Saphir-Multiphotonenlasern mit einer Pulsdauer von 120 fs und einem Multi-Immersion 16x/NA0.6 Objektiv (Tauchflüssigkeit = Glycerin) mit einem maximalen Arbeitsabstand von 2,2 mm durchgeführt. Weitere Informationen zur Bilderfassungssoftware finden Sie in der Materialtabelle . Ergänzende Tabelle S1 und Ergänzende Abbildung S1 zeigen die für dieses Protokoll verwendeten Einstellungen . Für andere Bildgebungsplattformen wenden Sie sich an den Mikroskopiekern oder befolgen Sie die Spezifikationen / Empfehlungen der Hersteller.

1. Beispiel-Setup
   1. Bereiten Sie das Setup für die Montage der Proben vor. Verwenden Sie beispielsweise eine klebrige und flexible Silikondichtung, um eine Klebevertiefung zu erstellen. Legen Sie die Klebstoffmulde auf ein 25 mm x 25 mm großes Mikro-Deckglas Nr. 1,5, um eine Vertiefung zu schaffen, in der die Eierstöcke platziert werden (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Eine Dichtung von 1 mm Dicke eignet sich für alle Größen von Eierstöcken. Dieses Setup wird empfohlen, da es Eierstockbewegungen während der Bildgebung eliminiert, die auftreten können, wenn Eierstöcke in einer Glasbodenschale in Mountant gelegt werden.
   2. Übertragen Sie die Eierstöcke mit ~ 5-10 μL ScaleS4(0)-Lösung unter Verwendung einer Pipettenspitze mit abgeschnittener Spitze (20 μL für pränatale und präpubertäre Leitung) in die Mitte des Klebstoffs, wie in Abbildung 2B dargestellt. Verwenden Sie für pubertäre Eierstöcke eine 200 μL Pipettenspitze, bei der die Spitze weit genug abgeschnitten ist, um die Eierstöcke zu übertragen. ~15-20 μL der ScaleCUBIC-2-Lösung in die Mitte der Klebstoffvertiefung geben.
      HINWEIS: Zu viel Lösung kann dazu führen, dass auf den Mikroskoptisch undicht wird, und zu wenig Lösung führt zu einer schlechten Bildqualität. Verwenden Sie ein Dissektionsmikroskop, um Proben zu übertragen, da gereinigte Eierstöcke transparent werden und schwer zu sehen sind.
   3. Sobald die Eierstöcke mit einem Tropfen Klärlösung in einzelne Vertiefungen überführt wurden, legen Sie vorsichtig ein weiteres Deckglas auf die Klebeschacht, drücken Sie, um eine Versiegelung zu erstellen, und halten Sie die Proben an Ort und Stelle in einem kleinen Pool von Clearinglösung, der zwischen den beiden Deckgläsern eingeklemmt ist (Abbildung 2B). Für die Bildgebung legen Sie das Deckglas "Sandwich" in einen 3D-gedruckten Mikroskopadapterobjektträger (z. B. ^43).
      HINWEIS: Klebebrunnen sind nach dem Dekonstruieren des "Sandwiches" und dem Waschen mit Wasser wiederverwendbar.
2. Bildgebung (Ergänzungstabelle S1 und Zusatzfigur S1)
   1. Schalten Sie das Mikroskop und die Software gemäß den Richtlinien des Mikroskopiekerns oder des Herstellers ein. Legen Sie die montierten Proben auf den Mikroskoptisch und schauen Sie durch das Okular, um die mit einer stromsparenden LED-Fluoreszenzlampe beleuchtete Probe zu lokalisieren.
   2. Sobald die Proben gefunden sind, schalten Sie den/die Laser(s) ein und weisen Sie jeden Detektor einem bestimmten Alexa Fluor-Farbstoff/Marker zu. Ermöglichen Sie bei mehreren Lasern eine sequentielle Bildaufnahme. Erfassen Sie den gesamten Stapel, bevor Sie die Laser wechseln.
      HINWEIS: Für dieses Protokoll wurde ein Laser für die Bildaufnahme von 555 nm und 647 nm Fluorophoren verwendet.
   3. Richten Sie die Parameter für die Bildaufnahme nach den Vorgaben des Mikroskopiekerns oder des Herstellers ein. Verwenden Sie die bidirektionale Bildaufnahme, falls verfügbar, um die Scanzeit zu verkürzen und die Effizienz zu verbessern. Passen Sie andere Einstellungen an, einschließlich des Liniendurchschnitts (1), des Frame-Durchschnitts (1) und der Frame-Akkumulation (1).
      HINWEIS: Die bidirektionale Bilderfassung ermöglicht es Lasern, in beide Richtungen zu scannen, während sie sich auf der X-Achse bewegen.
   4. Richten Sie den Z-Stack ein, indem Sie den Anfang (Unterseite der Proben-/Bodenglasabdeckung) und die Endposition (oben auf der Proben-/oberen Glasabdeckung) identifizieren. Wählen Sie eine Z-Schritt-Größe von 2 μm für präpubertäre Eierstöcke und 5 μm für pubertäre Eierstöcke.
   5. Aktivieren Sie die Z-Kompensationsfunktion und innerhalb dieser Funktion die Erregungsverstärkung. Stellen Sie die Z-Kompensation für den Boden und die Oberseite der Probe ein, indem Sie eine Laserintensität sowohl für den unteren (niedrige Intensität) als auch für den oberen Stapel (hohe Intensität) auswählen. Siehe Ergänzende Abbildung S1, Lineare Z-Kompensation, wobei die Anregungsverstärkungsbox ausgewählt ist und die Laserintensität für die Unterseite (0) und die Oberseite (347,75) auf 10 bzw. 12 festgelegt ist.
   6. Verwenden Sie den Kachelmodus für größere Stichproben, die nicht in einem einzigen Sichtfeld erfasst werden können. Aktivieren Sie den Bildnavigator und geben Sie die Anzahl der Kacheln an, die zum Erfassen der gesamten Probe mit dem rechteckigen Markierungswerkzeug erforderlich sind.
   7. Starten Sie die Bildaufnahme. Starten Sie bei Bildern mit mehreren Kacheln die Bilderfassung mit dem Navigator, um alle Kacheln zu erfassen. Sobald die Bilderfassung abgeschlossen ist, speichern Sie zuerst alle Bilder, und wenn mehrere Kacheln erworben wurden, führen Sie dann das Mosaik-Zusammenführungswerkzeug aus, um die Kacheln zu einem einzigen Bild zusammenzuführen.
   8. Speichern Sie die zusammengeführten Dateien in einem separaten Projektordner, um die Arbeit mit den Gigabyte-großen Bildern zu erleichtern. Übertragen Sie die Dateien für die Bildverarbeitung mit einer 3D-Bildvisualisierungs- und Analysesoftware. Abbildung 3 zeigt repräsentative Bilder, die in verschiedenen Stadien mit zwei Markern (GCNA und DDX4) aufgenommen wurden.

8. Bildverarbeitung

HINWEIS: Alle unten beschriebenen Schritte wurden mit der IMARIS 3D-Bildvisualisierungs- und Analysesoftware entwickelt und durchgeführt.

1. Importieren Sie die Bilder in die 3D-Bildvisualisierungs- und Analysesoftware und konvertieren Sie bei Bedarf die Dateien aus dem Originalformat (z. B. .lif, .czi, .lsm, .lei, .oib, .oif, .nd2) in das .ims-Format.
2. Verarbeiten Sie die Bilder bei Bedarf mit dem Gauß-Filter, um die Verpixelung zu reduzieren (Abbildung 4A). Positionieren Sie das Bild mithilfe der 3D-Ansichtsfunktion und deaktivieren Sie die Rahmenoption (um den Rahmen zu entfernen).
   HINWEIS: Es gibt andere optionale Filter, die auch verwendet werden können, um die Pixelierung zu verringern und die Hintergrundintensität zu reduzieren.
3. Vergrößern Sie das Bild auf einen bestimmten Maßstab, und verwenden Sie die Schnappschussfunktion. Legen Sie die Voreinstellungen wie folgt fest: Wählen Sie 300 DPI, Als TIFF-Bild speichern und Transparenter Hintergrund aus. Machen Sie einen Schnappschuss des Bildes und speichern Sie es. Abbildung 3 zeigt vollständig zusammengesetzte Bilder.

9. Quantifizierung der Eizellen

HINWEIS: Die Immunfluoreszenz des gesamten Eierstocks und die 3D-Bildvisualisierung und -analyse können für die Schätzung der Eizellzahlen in ganzen Eierstöcken (Abbildung 3 und Abbildung 4) mithilfe der Spot-Funktion verwendet werden. Das GCNA-Signal kann verwendet werden, um Eizellen in pränatalen und präpubertären Eierstöcken zu quantifizieren, wie in Abbildung 4 (P5) gezeigt. Verwenden Sie in pubertären Eierstöcken das DDX4-Signal, um zwei Eizellpopulationen in nicht wachsenden Follikeln ("ringartige" Struktur, geschlossener Pfeil) und wachsenden Follikeln (große Strukturen, offener Pfeil, Abbildung 4, P28) zu quantifizieren.

1. Bestimmen Sie die Größe der Eizellen, die als Parameter zur Quantifizierung von Eizellen verwendet werden, mit der Funktion "Spots" in Schritt 9.2.
   1. Öffnen Sie das Bild und wählen Sie die Option Slice, um das Z-Stack-Bild zu öffnen.
   2. Wählen Sie im Bedienfeld "Messen" die Option "Linie" und messen Sie den Abstand, indem Sie eine Linie von einer Kante einer Eizelle/Markierung zur anderen Kante an der breitesten Stelle zeichnen, um den XY-Durchmesser des zu zählenden Eizelltyps/der zu zählenden Eizellgröße zu bestimmen. Bewegen Sie sich durch den Stapel und erhalten Sie den Durchmesserbereich für mehrere Eizellen desselben Typs. Verwenden Sie die kürzeste Länge als Größenauswahlkriterium für die Anzahl der Eizellen.
2. Spots-Funktion : Wählen Sie die Option 3D-Ansicht und aktivieren Sie die Funktion " Neue Spots hinzufügen" im Szenenbedienfeld , um das Algorithmus-Bedienfeld zu öffnen. Deaktivieren Sie alle Algorithmuseinstellungen, da der Größenauswahlfilter mit der in Schritt 9.1 erhaltenen Eizellgröße verwendet wird.
   1. Klicken Sie auf den einzelnen Vorwärtspfeil , um zum Quellkanal zu wechseln. Wählen Sie den Kanal mit der bevorzugten Markierung aus, und geben Sie den in Schritt 9.1 erhaltenen geschätzten XY-Durchmesser ein. Verwenden Sie beispielsweise einen geschätzten XY-Durchmesser von 7 μm für pränatale Eizellen und 11 μm für P5-Eizellen (GCNA = grünes Signal; Abbildung 3 und Abbildung 4A).
   2. Verwenden Sie 30 μm für das DDX4-Signal, um die Anzahl der Eizellen in wachsenden Follikeln in P5-Eierstöcken abzuschätzen (DDX4 = Magenta-Signal; Abbildung 3 und Abbildung 4A). Verwenden Sie für pubertäre Eierstöcke das DDX4-Signal für Eizellquantifizierungen. Verwenden Sie beispielsweise XY-Durchmesser von 15 μm bzw. 80 μm, um Eizellen in nicht wachsenden Follikeln bzw. wachsenden Follikeln zu identifizieren, wie in Abbildung 4A dargestellt.
      HINWEIS: Die gewählte Größe kann aufgrund der Bildaufnahmekriterien und der Art des verwendeten Mikroskops variieren. Die Auswahl kann auch zwischen genetischen Stämmen variieren, da Eierstöcke mit mehr Eizellen eine kleinere Auswahl für eine bessere automatisierte Eizellerkennung erfordern.
   3. Aktivieren Sie nach der Größenauswahl die Modell-PSF-Dehnung und die Hintergrundsubtraktion, die automatisch ermittelt werden. Wählen Sie den einzelnen Vorwärtspfeil aus, um zum Bedienfeld "Filterpunkte " zu wechseln. Fügen Sie den Filter Qualität hinzu, und legen Sie einen Schwellenwert fest. Um eine genaue Schätzung der Eizellzahlen zu gewährleisten, vergrößern Sie das Bild, wenn der Schwellenwert angepasst wird, um einen Schwellenwert zu wählen, der die meisten Eizellen auswählt. Klicken Sie auf den Doppelpfeil , um die automatischen Zählungen abzuschließen.
   4. Überprüfen Sie die ausgewählten Eizellen manuell über die Registerkarte Bearbeiten , um verpasste Eizellen auszuwählen oder die Auswahl von Nicht-Eizellpartikeln aufzuheben, die durch den automatischen Schwellenwert ausgewählt wurden. Zeichnen Sie die Daten auf der Registerkarte Statistik unter der Registerkarte Gesamt zur weiteren Analyse auf.
      HINWEIS: Die Parameter, die zum Zählen der Spots verwendet werden, können gespeichert und für einen anderen Samplesatz verwendet werden, es wird jedoch empfohlen, vor der Batch-Analyse eine manuelle Überprüfung durchzuführen.
   5. Um die Parameter zu speichern, klicken Sie auf die Registerkarte Erstellung und dann auf Parameter für Stapel speichern.
      HINWEIS: Kernmarker (GCNA+-Eizellen, Abbildung 4A) sind durch die Spot-Funktion leicht zu identifizieren und erfordern möglicherweise keine große manuelle Anpassung. Der zytoplasmatische Marker (DDX4+-Eizelle, Abbildung 3 (P28, geschlossener Pfeil) und Abbildung 4A) erfordert jedoch eine manuellere Anpassung, um die Identifizierung der richtigen Größe / Art der Eizellen sicherzustellen.

10. Quantifizierung der Proteinexpression in Eierstöcken

HINWEIS: Es gibt mehrere Möglichkeiten, den Eizellenausdruck bestimmter Marker zu quantifizieren, indem Sie sowohl das Flecken-Feature (Abschnitt 9 und Schritt 10.1) als auch das Surfaces-Feature (Schritt 10.2) verwenden. Die Spots-Funktion kann für Proteine mit unterschiedlichen Lokalisierungsmustern wie Kernmarkern (GCNA) verwendet werden, und die Surfaces-Funktion kann für Proteine mit ungleichmäßigen Lokalisationsmustern verwendet werden, wie in Abbildung 5A gezeigt, wo LINE-1 ORF1p-Intensitäten in E15,5- und E18,5-Eierstöcken gemessen wurden. Um die Intensität des interessierenden Proteins zwischen zwei Proben (z. B. Zeitpunkten, Behandlungen oder Genotypen) zu berechnen und zu vergleichen, sammeln Sie Bilder mit den gleichen Eigenschaften. Verwenden Sie Proben mit einem intensiveren Signal, um die Parameter zu bestimmen, die gespeichert und für die anderen Proben verwendet werden können.

1. Um die Proteinexpression mit der Spots-Funktion zu erhalten, identifizieren Sie zuerst die Eizellen als hervorgehoben (Abschnitt 9).
   1. Wählen Sie dann unter der Spots-Funktion die Registerkarte Statistik und anschließend die Registerkarte Detailliert aus. Klicken Sie auf den Abwärtspfeil und wählen Sie Spezifische Werte, wodurch eine weitere Registerkarte darunter mit verschiedenen Messungen geöffnet wird. Wählen Sie das Intensitätsmittel des Kanals aus, der für die Oberflächenerzeugung verwendet wird (oder wählen Sie andere Intensitätsmessungen wie den Intensitätsmedian).
   2. Um die kombinierten/durchschnittlichen statistischen Informationen zu erhalten, wählen Sie das Kriterium Durchschnittswerte aus. Sobald Sie fertig sind, exportieren und speichern Sie Daten für weitere Analysen.
2. Um die Proteinexpression mit dem Flächen-KE zu erhalten, öffnen Sie das Bild, wählen Sie die Option 3D-Ansicht und aktivieren Sie die Funktion Neue Flächen hinzufügen im Szenenbedienfeld, um das Bedienfeld "Algorithmus" zu öffnen. Deaktivieren Sie alle Algorithmuseinstellungen, falls nicht erforderlich, und klicken Sie auf den einzelnen Vorwärtspfeil, um zum Quellkanal zu wechseln.
   1. Wählen Sie den Kanal mit dem zu messenden Antikörpersignal aus. Weitere auszuwählende Eigenschaften sind benutzerspezifische Optionen. Hier wurde das LINE-1-Signal als Marker verwendet. Die Werte für Flächendetails (Flächendetails) und Hintergrundsubtraktion (lokaler Kontrast) wurden auf den Standardwerten 1,42 bzw. 5,33 belassen.
   2. Klicken Sie auf den Vorwärtspfeil, um zum Schwellenwertfenster zu wechseln. Wählen Sie einen Schwellenwert aus, der in beiden Stichproben vergleichbar ist (z. B. wurde hier der LINE-1-Ausdruck in E18.5 verwendet, um einen Schwellenwert auszuwählen). Wählen Sie Mit einem Standarddurchmesser der Startpunkte von 7,10 aktivieren (dieser Wert wurde für die Bilder als optimal befunden, kann jedoch von der erwarteten Pixelgröße der Features abhängen).
   3. Klicken Sie auf den Vorwärtspfeil , um zum Bedienfeld "Filterflächen" zu wechseln. Verwenden Sie einen Qualitätsfilter , und basieren Sie den Wert, wie beim Schwellenwert, auf der Expression der Proteine in beiden Eierstockproben. Sobald die Filtereigenschaft ausgewählt ist, klicken Sie auf den doppelten Vorwärtspfeil , um die Generierung der Fläche abzuschließen.
   4. Um die Intensitätswerte zu erhalten, wählen Sie die Registerkarte Statistik und anschließend die Registerkarte Detailliert aus. Klicken Sie auf den Abwärtspfeil und wählen Sie Spezifische Werte, wodurch eine weitere Registerkarte darunter mit verschiedenen Messungen geöffnet wird.
   5. Wählen Sie das Intensitätsmittel des Kanals aus, der für die Oberflächenerzeugung verwendet wird (oder wählen Sie andere Intensitätsmessungen wie den Intensitätsmedian).
   6. Um die kombinierten/durchschnittlichen statistischen Informationen zu erhalten, wählen Sie das Kriterium Durchschnittswerte aus. Sobald Sie fertig sind, exportieren und speichern Sie die Daten für weitere Analysen (Abbildung 5C).

11. Schätzung der Gesamtzahl der Eizellen im geschädigten Eierstock mit rechnerischer Korrektur

HINWEIS: Wenn während der Dissektion eine geringfügige Schädigung der Eierstöcke auftritt, kann die Gesamtzahl der Eizellen rechnerisch geschätzt werden. Es wird empfohlen, intakte Eierstöcke aus demselben Stamm und Entwicklungsstadium für die Schätzung der Eizellzahl zu verwenden, wie in Abbildung 6 gezeigt. Simulationen, die mit Eierstöcken bei E15,5 durchgeführt wurden, zeigen, dass die Korrektur eines Verlustes von ≥30% zu einer signifikanten Abweichung von den tatsächlichen Zahlen führt (Abbildung 6C).

1. Öffnen Sie Bilder von intakten Eierstöcken mit IMARIS und wählen Sie die Rahmenfunktion. Wählen Sie unter den Rahmeneinstellungen die Beschriftungen Box, Raster, Teilstriche und Achse aus. Wählen Sie auf der Registerkarte Position X/Y/Z die Option 200 μm aus, um Tickmarks mit 200 μm Abständen in allen X/Y/Z-Positionen zu generieren.
   HINWEIS: Die Häkchen erzeugen ein Raster/Lineal in X-, Y- und Z-Ebenen, um Eizellen innerhalb einer bestimmten Region zu identifizieren.
2. Aktivieren Sie die Spots-Funktion, um die in Abschnitt 9 hervorgehobenen Eizellen zu identifizieren (Abbildung 4). Erstellen Sie ein 3D-Modell mit den Eizellen, die in allen intakten Eierstöcken identifiziert wurden, die für die Simulation verwendet werden, indem Sie im Flecken-KE auf der Registerkarte Punktestil/-qualität die Option Kugel auswählen.
   HINWEIS: Die Pixelbreite kann auch auf der Registerkarte " Punktestil/-qualität" geändert werden.
3. Wenn das in Schritt 11.1 generierte Feld generiert wurde, richten Sie die 3D-Modelle der intakten Eierstöcke in derselben Ausrichtung aus wie in Abbildung 6A gezeigt.
4. Wählen Sie anhand der 200-μm-Tickmarks (Schritt 11.1) Eizellen aus, die innerhalb von 50% des Volumens jedes Eierstocks liegen. Klicken Sie auf die Funktion "Spots " und wählen Sie "Etiketten bearbeiten ", um die Eizellen, die in den 50%-Bereich fallen, nach Farbe zu klassifizieren, wie in Abbildung 6A dargestellt.
   HINWEIS: Sobald Eizellen in einer Region klassifiziert sind, wird die Anzahl der Eizellen, die in jede Klasse fallen, angegeben.
5. Zoomen Sie in den 50%-Bereich und ändern Sie die Tickmarks von 200 μm auf 50 μm, um ein kleineres Lineal für die Eizellidentifikation zu erstellen. Behalten Sie den Zoom % in allen Bildern bei. Teilen Sie mit den 50-μm-Tickmarks als Richtwert die 50%-Region in fünf gleiche Teile.
   HINWEIS: Eizellen in jedem Teil machen 10% des Volumens aus, wie in Abbildung 6A hervorgehoben, wo ein intakter Eierstock Eizellen in der oberen Hälfte des Eierstocks zeigt, die durch fünf verschiedene Farben klassifiziert sind, wobei jede Farbe Eizellen innerhalb einer volumetrischen Region von 10% darstellt.
6. Notieren Sie die Eizellzahlen in jeder 10%-Region, wie in Abbildung 6A,B dargestellt. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Eizellen in Schritten von 10, 20, 30, 40 und 50%.
7. Verwenden Sie die in den Schritten 11.1 bis 11.6 hervorgehobenen Elemente, um Eizellzahlen im beschädigten partiellen Eierstock zu erhalten. Positionieren Sie den beschädigten Eierstock in der gleichen Ausrichtung wie die intakten Eierstöcke und schätzen Sie das fehlende Volumen / den fehlenden Prozentsatz wie oben beschrieben.
8. Um die Gesamtzahl der Eizellen im gesamten Eierstock zu schätzen, addieren Sie die durchschnittliche Anzahl der Eizellen, die für ein ähnliches Volumen berechnet wurde, zu der aus dem partiellen Eierstock erhaltenen Anzahl (Abbildung 6B).

Ergebnisse

Die Immunfärbung und Bildgebung des gesamten Eierstocks ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung der Eizell- oder Proteinexpression in Eierstöcken in verschiedenen Entwicklungsstadien mit derselben Technik und denselben Markern (Abbildung 3). Dieses Protokoll wurde für ein Großprojekt entwickelt, in dem die Analyse von Eierstöcken in mehreren Stadien und aus mehreren Mausstämmen erforderlich war. Hier präsentieren wir Daten, die für den Stamm C57BL6/J, einen Standardstamm f...

Diskussion

Dieser Artikel stellt ein detailliertes 3D-Immunfärbungs- und Bildgebungsprotokoll für pränatale und postnatale Eierstöcke für Hochdurchsatz- und Vergleichsstudien zur Keimzellquantifizierung und Proteinlokalisierung vor. Wir haben dieses Protokoll entwickelt, um die Anzahl der Eizellen in den Eierstöcken (N = 6-12) an sechs Entwicklungszeitpunkten in 10-16 verschiedenen Stämmen zu analysieren, wobei typischerweise 2-4 24-Well-Platten gleichzeitig verarbeitet werden. Diese Methode kann für andere Organe oder zell...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benchtop Incubator	Benchmark Scientific	H2200-H	37 °C incubator
Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	97061-416
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664	mouse inbred strain
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D1435	Hazardous material
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S6021
Dumont #5 Forceps	FST	91150-20
FastWells Reagent Barriers	GraceBio	664113	Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)
Fine Scissors	FST	91460-11
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025
Glycine	ThermoFisher Scientific	BP381-500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21246	Dilution 1:1000
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21434	Dilution 1:1000
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023
IMARIS Software	Oxford Instruments	Version 9.7.0	Image visualization and analysis software
Insight X3	Spectra-Physics	InSight X3 Tunable Ultrafast Laser	Laser for Multiphoton Imaging
LASX software	Leica	Version 3.5.6	Image acquisition software
Leica DIVE/4TUNE/FALCON	Leica	Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406	Multiphoton Microscope
MaiTai HP	Spectra-Physics	Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser	Laser for Multiphoton Imaging
Masterflex Pump Controller	SPW Industrial	Model: 7553-50	Peristaltic pump for perfusion
Mayo Scissors	FST	14010-17	5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm	VWR	48366-249
Mini BioMixer	Benchmark Scientific	B3D1020	shaker/nutator for 37 °C incubator
Nikon Ergonomic SMZ1270	Leica	SMZ1270	stereomicroscope
Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)	Electron Microscopy Sciences	15710	Hazardous material
PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline	ThermoFisher Scientific	BP2944100	Dissolve in Milli-Q water
Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution	ThermoFisher Scientific	ICN1670249
Polyvinyl alcohol (PVA)	Sigma-Aldrich	P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)	Sigma-Aldrich	122262
Rabbit anti-DDX4/MVH	Abcam	ab27591	Dilution 1:500
Rabbit anti-LINE-1 ORF1p	Abcam	ab216324	Dilution 1:500
Rat anti-TRA98/GCNA	Abcam	ab82527	Dilution 1:500
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Hazardous material
Sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882	Hazardous material
Sucrose	ThermoFisher Scientific	S0389
Tekmar Orbital Shaker	Bimedis	VXR-S10	shaker for room temperature
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
UNOLOK Infusion Set	MYCO Medical	7001-23	needles for perfusion
Urea	Amresco	97061-920
X-Cite 120LED	Excelitas	S/N XT640-W-0147	low-power LED fluorescence lamp